Gama de hospedantes y transmisión de Tomato mottle Taino virus

Las cepas de Agrobacterium tumefaciens que portan los plasmidios pGJToMoTV A y pGJToMoTV B se emplearon para infectar 11 especies de las familias Solanaceae y Fabaceae (Tabla 9). Transcurridos 25 días, los extractos de ADN de las hojas de nuevo crecimiento se evaluaron por la técnica de Southern (resultados no mostrados) y la detección de la banda correspondiente al ADNsc geminiviral permitió reconocer el establecimiento de una infección sistémica eficiente.

Tabla 9. Eficiencia de la transmisión de ToMoTV a especies de las familias Fabaceae y Solanaceae por los métodos de

la agroinoculación, biobalística, injertos y mecánico.

% de infección vía: *

Especies Agroinoculación Biobalística Injertos Mecánica

Capsicum annuum L. 1 84 58 74 0

Nicotiana tabacum L. 1 96,6 76,6 100 0

Lycopersicon esculentum P. Mill. 1 100 90 93,3 0

Lycopersicon hirsutum Dunal 80 50 60 0

Lycopersicon peruvianum (L.) Mill. 80 60 60 0

Lycopersicon pimpinellifolium (Jusl.) Mill. 90 60 70 0

Nicotiana glutinosa L. 90 50 70 0 Solanum tuberosum L. 1 100 83,3 73,3 0 Phaseolus vulgaris L. 100 50 80 0 Datura metel L. 0 0 0 0 Datura stramonium L. 90 70 90 0 Nicotiana megalosiphon 100 80 70 0

*Los valores representan el porcentaje de plantas infectadas por cada diez plantas inoculadas. 1 _{Los valores, para}

estas especies, agrupan los resultados de todas las variedades inoculadas.

Para las variedades de plantas que pertenecen a las especies: pimiento (Capsicum annuum L.), tabaco (Nicotiana tabacum L.), Lycopersicon hirsutum Dunal, Lycopersicon peruvianum (L.) Mill., Lycopersicon pimpinellifolium (Jusl.) Mill., Nicotiana glutinosa L., papa (Solanum

tuberosum L.), frijol (Phaseolus vulgaris L.), Datura stramonium L. y Nicotiana megalosiphon

se obtuvo más de un 80% de infección (Tabla 9). Sin embargo, ninguna planta de Datura

metel L. resultó ser infectada. La susceptibilidad a la infección fue similar cuando se emplearon

los métodos de biobalística e injertos (Tabla 9). No obstante, en ambos casos los porcentajes de plantas infectadas no fueron tan elevados como con el uso de la agroinoculación (mayores a 60% en los injertos y 50% en la biobalística). Esta diferencia puede ser inherente a los

precisión en el momento de realizar los disparos y los injertos requieren mayor destreza del investigador para lograr más eficacia. En contraste con los métodos anteriores, la transmisión manual fue ineficiente y ninguna de las plantas ensayadas se infectó (Tabla 9).

Los síntomas de la infección por ToMoTV, mostrados por las especies del género Nicotiana, se caracterizaron por presentar arrugamiento en las hojas. Las mayores deformaciones se observaron en Nicotiana megalosiphon la cual, además, mostró una marcada reducción de los entrenudos, disminución del área foliar y del crecimiento en general (Figura 19A). Las plantas de Datura stramonium L. infectadas, también mostraron arrugamiento de sus hojas en los extremos apicales (Figura 19D). En las plantas de tomate, frijol y papa, los síntomas se caracterizaron por la presencia de moteados amarillos, aunque en el caso de tomate, en dependencia de la variedad utilizada (ej. Campbell 28), se observaron deformaciones de las hojas (Figura 19B y C). En tomate, los moteados amarillos fueron más intensos cuando se empleó la biobalística como método de transmisión.

4.7.1 Detección de infección natural por Tomato mottle Taino virus en plantaciones

de papa

Una vez determinado que la papa (Solanum tuberosum L.) es parte de la gama de hospedantes experimentales de ToMoTV, se estudió si los síntomas de moteado amarillo (Figura 20) observados en los campos de papa de La Habana en el período 1996-1998, podrían deberse a la presencia de este virus. Los extractos de ADN de las muestras colectadas en las localidades de Boyeros, San José de las Lajas y Güira de Melena se examinaron por Southern, RCP y RFLP. La detección de manchas fuertes en los autorradiogramas de los Southern, practicados en condiciones restringentes y con sondas radiactivas derivadas de los genes AV1 y BC1 de ToMoTV, reveló la presencia de un begomovirus muy relacionado con ToMoTV (Figura 21). Por otra parte, los patrones de RFLP realizados a los fragmentos amplificados con los cebadores degenerados pALv1978 y pAR1c715 (Rojas y col., 1993) (Figura 22) fueron iguales entre ellos y equivalentes a los obtenidos para el fragmento de 1,1 Kb de ToMoTV (Figura 8). En la comparación de los patrones de RFLP generados a

Figura 19. Fotografías de los síntomas producidos por ToMoTV en algunas de las plantas pertenecientes a su gama de

hospedantes. A: Nicotiana megalosiphon, B: Tomate (Lycopersicon esculentum P. Mill.) var. Campbel 28, C: Frijol (Phaseolus vulgaris L.) y D: Datura stramonium L.

C D B

A

Figura 20. Fotografía del síntoma de

moteado amarillo en una planta de papa (Solanum tuberosum L.) var Desirée de 40 días de sembrada. Campos del municipio Boyeros, Ciudad de La Habana.

partir de ToMoTV y de los aislamientos de papa, se tomó en cuenta que en la RCP para las muestras de papa se empleó el cebador pAR1c715 en lugar del pAR1c496. Las diferencias en tallas entre algunas de las bandas observadas en la Figura 8 y la Figura 22, se deben a que el fragmento amplificado por el par de cebadores pAL1v1978-pAR1c715 posee 217 pb más que el amplificado por el par pAL1v1978-pAR1c496.

Además, los fragmentos amplificados a partir de las muestras de papa se secuenciaron y se compararon con las bases de datos a través del

programa BLASTN. La identidad más alta de la secuencia nucleotídica de cada fragmento se observó con ToMoTV. En más detalle, las comparaciones de las secuencias de la región RC de los aislamientos virales de papa mostraron más de un 98% de identidad con la región RC de ToMoTV. Los otros valores más cercanos fueron de 78% y 70% con ToMHV y ToMoV, respectivamente. La secuencia nucleotídica, el ordenamiento y el número de los iterones fueron idénticos entre los aislamientos de papa y ToMoTV (Figura 23).

Las comparaciones de las secuencias de los genes AC1 y AV1 mostraron resultados similares a los obtenidos con el programa BLASTN. Los mayores valores de identidad se obtuvieron con los genes equivalentes de ToMoTV. En el caso de AC1, estos valores alcanzaron entre el 98% y el 99% con ToMoTV y en segundo lugar se obtuvo un 84,8% respecto a ToMoV. Para el gen AV1, los porcentajes fueron entre el 98% y el 99% con ToMoTV y en orden decreciente se encontró a SiGMFV con un porcentaje de identidad del

85,3%.

De esta forma, los resultados anteriores permitieron corroborar que los begomovirus hallados en papa corresponden a cepas de ToMoTV y en consecuencia la papa es un hospedante natural alternativo al tomate para este virus. Las secuencias de los fragmentos genómicos de los tres aislamientos de ToMoTV-papa fueron depositadas en la base de datos EMBL con los números de acceso AJ563919, AJ563918 y AJ563917.

Una vez reconocida a la papa como hospedante natural de ToMoTV, se estudió si este virus se transmite a través de los tubérculos de las plantas infectadas hacia las nuevas plantas germinadas a

1,6 Kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Figura 21. Autorradiografía del Southern practicado a

los extractos de ADN de plantas de papa colectadas en diferentes localidades de las provincias habaneras.

Carriles 1-2: Muestras de San José de la Lajas (1996-97), carriles 3-5: Muestras de Güira de Melena (1997-98), carriles 6-8: Muestras de Boyeros (1997-98), carril 9: Extracto de ADN de una planta de papa sana, carril 10: Extracto de ADN de una planta de papa agroinoculada con ToMoTV, y carril 11: Extracto de ADN de una planta de tomate agroinoculada con ToMoTV. La hibridación se realizó en condiciones restringentes, empleando como sonda a los genes AV1 y BC1 de ToMoTV. Se cargó 1 µg de ADN por carril.

Figura 22. Electroforesis en gel de agarosa al

0,8% para el ensayo tipo RFLP del fragmento de ADN correspondiente al aislado viral colectado en Boyeros-Ciudad de La Habana, amplificado con los cebadores degenerados pAL1v1978-pAR1c715 (Rojas y col., 1993). Carril 1: Marcador de peso molecular Escalera de 1Kb (Gibco-BRL, EE.UU.), carril 2: Fragmento amplificado sin digerir, carriles del 3 al 7: Fragmento amplificado digerido con Pst I, EcoR I, Hinc II,

Xba I y Bgl II, respectivamente.

1,6 Kb 1,0 Kb

0,5 Kb

partir de ellos. Para esto, los tubérculos de las plantas infectadas se cosecharon y se almacenaron por un año a 4˚C. Transcurrido este período, los tubérculos se germinaron y el virus pudo ser detectado en las plantas obtenidas. Los análisis tipo Southern demostraron la presencia de ADN dc y sc viral, mientras que los resultados de los RCP-RFLP demostraron la identidad del virus presente, el cual se correspondió con cepas de ToMoTV (resultados no mostrados).

4.8 Tropismo de Tomato mottle Taino virus

El tropismo de ToMoTV se evaluó en dos de sus hospedantes: tomate (Lycopersicon

esculentum P. Mill.) y Nicotiana megalosiphon. Las plantas en análisis se inocularon a través

de injertos y luego de 30 días las secciones transversales de los peciolos de las hojas de diferentes etapas de desarrollo y de tallos, se imprimieron sobre membranas Hybond. La presencia del ADN de ToMoTV en las huellas de la impresión se reveló a través de la hibridación de ácidos nucleicos. Para comprobar la especificidad de la técnica en la detección del ADN viral, se evaluaron a la vez varias secciones de tejidos a partir de plantas sanas, de igual edad y de las mismas especies (Figura 24A). La observación de las membranas después de la incubación con el sustrato de revelado mostró puntos grisáceos típicos de la reacción de la fosfatasa alcalina. Estos puntos no se observaron en las impresiones correspondientes a las plantas no infectadas. Los puntos grisáceos se observaron en zonas cercanas a los tejidos vasculares (Figura 24B a la E). Los haces conductores se identificaron en la impresión debido a la huella profunda producida por las traqueidas del xilema en la membrana de Hybond. Las zonas en las que se localizan los puntos se corresponden con las posiciones en las que se distribuyen las células del floema.

ToMoTV–potato [Boyeros] CATATTTGTAAATATAGGATGTT CCCCCAATT GCTCT ToMoTV–potato [S. J. Lajas] CATATTTGTAAATATAGGATGTT CCCCCAATT GCTCT ToMoTV–potato [G.de Melena] CATATTTGTAAATATAGGATGTT CCCCCAATT GCTCT ToMoTV CATATTTGTAAATATATGATGTT CCCCCAATT GCTCT *

ToMoTV–potato [Boyeros] CTCTCACAAAACTCATATC AATTGGGGG AACTGGGGG ToMoTV–potato [S. J. Lajas] CTCTCACAAAACTCATATC AATTGGGGG AACTGGGGG ToMoTV–potato [G.de Melena] CTCTCACAAAACTCATATC AATTGGGGG AACTGGGGG ToMoTV CTCTCACAAAACTCATATC AATTGGGGG AACTGGGGG

ToMoTV–potato [Boyeros] AACA TTTATA CTAGAACCCTCTATAGAACTTTTAATC ToMoTV–potato [S. J. Lajas] AACA TTTATA CTAGAACCCTCTATAGAACTTTTAATC ToMoTV–potato [G.de Melena] AACA TTTATA CTAGAACCCTCTATAGAACTTTTAATC ToMoTV AACA TTTATA CTACAACCCTCTATAGAACTTTTAATC *

ToMoTV–potato [Boyeros] TCATTCATACACGTGGCGGCCATCCGCTA TAATATTAC ToMoTV–potato [S. J. Lajas] TCATTCATACACGTGGCGGCCATCCCCTA TAATATTAC ToMoTV–potato [G.de Melena] TCATTCATACACGTGGCGGCCATCCGCTA TAATATTAC ToMoTV TCATTCATACACGTGGCGGCCATCCGCTA TAATATTAC *

Rep

Caja TATA

Horquilla

Figura 23. Alineamiento de la secuencia nucleotídica de la región común (desde el codón de inicio de la traducción

del gen AC1 hasta el nanonucleótido del elemento estructural conservado (EEC)) de tres aislamientos de ToMoTV- papa y ToMoTV. Los asteriscos muestran variaciones en las secuencias. Flechas: Iterones. Recuadros: Caja TATA correspondiente al gen AC1 y nanonucleótido del asa de la horquilla (EEC) en la región origen de la replicación. Flecha en escuadra: Codón de inicio de la traducción del gen AC1. El alineamiento múltiple se realizó con el programa CLUSTAL W.