Taino virus dirige una expresión vascular específica en plantas solanáceas
La introducción vía Agrobacterium tumefaciens en plantas de tomate, papa y tabaco de un fragmento de 597 pb del ADN A de ToMoTV, permitió constatar la actividad promotora de la transcripción de este fragmento y a la vez su patrón de expresión. La actividad de pAC1459::Rep se localizó en los haces vasculares de las tres especies de solanáceas evaluadas.
Varios promotores de virus vegetales con genoma ADN exhiben un patrón de expresión específico del tejido vascular, y en algunos casos también su actividad ha sido observada en células en multiplicación. Ejemplos de ellos son el nanovirus Banana bunchy top virus (BBTV), el mastrevirus Maize streak virus y el badnavirus Rice tungro bacilliform virus (Yin y Beachy, 1995; Dugdale y col., 1998; Mazithulela y col., 2000). Sin embargo, el análisis de los resultados presentados en este trabajo demuestran que pAC1459::Rep no tiene actividad en células meristemáticas. Primero, las suspensiones celulares derivadas de las plantas transgénicas de tabaco que portan la construcción pAC1459::Rep fueron incapaces de hidrolizar el sustrato X-Gluc, y los callos desarrollados a partir de estas suspensiones se tiñeron sólo en algunas de sus partes interiores, probablemente en zonas donde las primeras células floemáticas comienzan a diferenciarse. Sin embargo, los brotes y las plantas regeneradas a partir de estos callos recobraron la tinción vascular específica característica de las plantas a partir de las cuales ellos se obtuvieron. Aunque las suspensiones celulares obtenidas en este trabajo no reproducen de forma absoluta el ambiente fisiológico del tejido meristemático vegetal, las observaciones obtenidas sugieren que pAC1459::Rep no es activo en células indiferenciadas. Segundo, en los experimentos de tiempo en curso (Figura 31 y Figura 32), los tejidos y órganos de las semillas y de las plántulas de hasta siete días de germinadas no expresaron la β-D-glucuronidasa. Sólo las plántulas con más de ocho días de germinadas se colorearon débilmente en una franja cercana al ápice del tallo, una zona donde varios pecíolos convergen.
La actividad desigual en tejidos con diferentes grados de desarrollo de la misma línea celular sugiere que el promotor del gen AC1 de ToMoTV exhibe una regulación dependiente del estadio de crecimiento de la planta. Si consideramos los resultados discutidos anteriormente, es posible sugerir que la expresión dirigida por pAC1459::Rep requiere la presencia de un factor de transcripción, aún por conocerse, el cual está ausente o en bajas concentraciones en las células en división, pero que sí se expresa en las células asociadas al tejido vascular de las tres especies vegetales analizadas. Quizás, esta proteína desconocida se une a elementos de regulación en cis, presentes en pAC1459::Rep de manera similar al mecanismo sugerido para la activación de una versión truncada del promotor del gen AV1 de TGMV (Sunter y Bisaro, 1997). Además, se pudiese plantear la hipótesis de que la activación de pAC1459::Rep en los germinados ocurre en paralelo con la diferenciación de los primeros elementos vasculares. En el caso de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, por ejemplo, el embrión inmaduro no presenta elementos vasculares y la diferenciación del tubo criboso ocurre dos días y medios después de
la imbibición (Busse y Evert, 1999). Sin embargo, detalles equivalentes sobre la embriogénesis del tabaco no han sido estudiados y se necesitan nuevas observaciones histológicas de las plántulas de esta especie para verificar esta hipótesis.
El patrón vascular específico dirigido por los fragmentos pAC1459, pAC1324, pAC1203, pAC1145 y pAC1132 en plantas transgénicas de tabaco y la inactividad de la construcción pAC1115 revelan que todos los elementos esenciales para la actividad del promotor del gen AC1 de ToMoTV están localizados en los 132 nt cuesta arriba del codón de inicio de la traducción de la proteína Rep. Las construcciones pAC1132 y pAC1115 difieren sólo en 17 nt, los cuales albergan una secuencia conservada entre varios geminivirus: la caja G, sitio de unión para un factor transcripcional del hospedante (Katagiri y Chua, 1992; Argüello-Astorga y col., 1994a). La inactividad de pAC1115 sugiere que la caja G es importante en la activación de la unidad de transcripción del gen AC1 de ToMoTV, lo que también se ha señalado en los análisis del promotor del gen AC1 (conocido como AL61) de TGMV (Eagle y Hanley-Bowdoin, 1997). En ese caso se demostró que la caja G activa la expresión del gen reportero luc en casi 50 veces, de ahí se ha planteado que este motivo actúa como un regulador positivo y fuerte del promotor AL61. Secuencias homólogas a la caja G, también están involucradas en la regulación de la actividad promotora del ADN 6 de BBTV (Dugdale y col., 1998).
Los patrones de expresión dirigidos por dos promotores de proteínas asociadas a la replicación geminivirales se han estudiado con anterioridad (Haley y col., 1992; Dry y col., 2000). El patrón vascular específico mostrado por pAC1459::Rep contrasta con el patrón del promotor del geminivirus monopartito Tomato leaf curl virus (ToLCV). El promotor de la proteína Rep de ToLCV dirige la expresión del gen reportero uid A en todos los tejidos del vegetal a excepción de la corteza de la raíz (Dry y col., 2000). En el caso del promotor de la proteína Rep del begomovirus bipartito ACMV (Haley y col., 1992), su patrón de expresión es similar al mostrado en nuestros estudios con pAC1459::Rep. Sin embargo, la secuencia de ACMV ensayada como promotor, es mayor a la región genómica representada en la construcción pAC1203 y menor a la versión pAC1324 evaluada en este trabajo.
La identificación de pAC1132 como el promotor mínimo del gen de la proteína Rep de ToMoTV resalta el papel de los elementos en cis localizados en esta región en la determinación del patrón de expresión. Hasta la fecha en este segmento de genoma, además de la caja G, han sido identificados otros elementos involucrados en la replicación y la transcripción de los geminivirus como son: los iterones, la caja TATA y los motivos CAAA y AG (Hanley-Bowdoin y col., 2000). En el caso de la caja G, es probable que su presencia no determine el patrón de expresión específico del tejido vascular. La caja G se encuentra solamente en geminivirus del Nuevo Mundo tales como PHYVV y ToMoTV, y está ausente en los del Viejo Mundo (ej. ACMV) (Argüello-Astorga y col., 1994a). Sin embargo, los promotores de la proteína Rep de estos tres virus dirigen un patrón de expresión específico del tejido vascular. La contribución de los otros elementos no puede ser evaluada a partir de los datos presentados en este o en otros trabajos publicados por diferentes autores. Se necesitan nuevos estudios para definir cuales elementos
dentro de la región localizada entre las posiciones 2454-2585 del ADN A de ToMoTV, contribuyen con la expresión vascular específica.
La actividad del promotor del gen AV1 de TGMV, en ausencia de la proteína TrAP, se ha estudiado en callos y plántulas de tabaco transgénicos (Sunter y Bisaro, 1997). En contraste con nuestros resultados, el promotor del gen AV1 de TMGV promueve una expresión del gen reportero uid A en todas las células de los callos, lo que sugiere una regulación diferente en células no diferenciadas. Sin embargo, los análisis posteriores en los brotes regenerados a partir de estos callos mostraron un patrón de expresión específico del tejido vascular similar al observado en los estudios con pAC1459::Rep. Análogo a lo que ocurre con pAC1459::Rep, el cual es activado en plántulas con ocho días después de la imbibición, la expresión vascular específica de una versión truncada del promotor del gen AV1 de TGMV es regulada con el desarrollo del vegetal, ya que su actividad no se observa en plántulas con 14 días después de la imbibición (Sunter y Bisaro, 1997). Por lo tanto, el patrón de expresión controlado por ambas unidades de transcripción muestra similitudes, las cuales pueden deberse a la presencia de elementos en
cis compartidos. Es importante considerar que la transcripción en los geminivirus es
bidireccional a partir de la región intergénica, y los genes AV1 y AC1 se expresan desde los extremos opuestos de esta región. No obstante, es esencial recordar que el promotor del gen
AV1 de TGMV requiere del factor viral TrAP para ser activado en algunos tipos celulares
(Sunter y col., 1990; Sunter y Bisaro, 1991), un rasgo muy distintivo de este promotor.
Los resultados presentados demuestran que el fragmento del ADN A de ToMoTV seleccionado, alberga los elementos indispensables para promover la transcripción del gen de la proteína asociada a la replicación. Además, como ninguna proteína puede ser expresada desde este fragmento, es posible afirmar que la expresión específica del tejido vascular dirigida por pAC1459::Rep no es determinada por un factor en trans codificado por el genoma viral.