Las primeras evidencias sobre la replicación de los geminivirus se obtuvieron de los análisis con ACMV y BCTV (Stenger y col., 1991; Saunders y col., 1991). Ellas revelaron que los geminivirus se replican a través del mecanismo de círculo rodante, el cual es un proceso en dos fases. En la primera etapa, el ADNsc viral sirve de molde para la síntesis de la cadena complementaria con la consecuente generación de la forma replicativa (FR) de dc. En la segunda etapa, la FR sirve de molde para la síntesis de la cadena viral progenie. Sin embargo, estudios posteriores con AbMV demostraron que la replicación del genoma de los geminivirus no es exclusivamente por el mecanismo del círculo rodante, sino que además puede ocurrir la replicación dependiente de la recombinación (Jeske y col., 2001). Ambos mecanismos no son excluyentes.
Muy poco se conoce de la primera fase de la replicación por círculo rodante. En el caso de los mastrevirus, el origen de la replicación de la cadena complementaria está localizado probablemente en la RI menor (Figura 2). Hibridado a esta región, en los viriones de numerosas especies de este género, se encuentra un fragmento pequeño de ADN que funciona como cebador, de 80 nt de largo y que en su extremo 5´ posee ribonucleótidos (Donson y col., 1984; Donson y col., 1987; Andersen y col., 1988; Morris y col., 1992). En otros geminivirus no se ha encontrado ADN adicional a su cadena viral en el virión, pero sí se han encontrado fragmentos de ARN que posiblemente son los cebadores (Saunders y col., 1992). En el caso de ACMV, los extremos 5´ de estas moléculas de ARN, se localizaron en la posiciones 2581 y 221 (Saunders y col., 1992). Hasta el momento no se tienen otros detalles sobre el desarrollo de esta fase.
En la segunda etapa también existen diferencias entre las estrategias seguidas por los mastrevirus y los begomovirus. No se tiene aún suficiente conocimiento de estos procesos en los curtovirus y topocuvirus, aunque se especula que en ellos debe ser semejante a la desarrollada por los begomovirus (Gutiérrez, 2002). Sin embargo, invariablemente del geminivirus del que se trate, el sitio de inicio de la replicación de la cadena viral está localizado en el nanonucleótido TAATATTAC, ubicado en el asa de la horquilla (Figura 3A) (Stanley, 1995). De igual manera, la horquilla representa un motivo estructural indispensable para el desarrollo del mecanismo de círculo rodante en todos los geminivirus (Orozco y Hanley- Bowdoin, 1996). En los mastrevirus el origen de replicación está constituido por tres módulos principales: la región central de 200 nt (posición -178 a la +28, considerando como +1 al residuo A del extremo 5´ después del corte en la horquilla origen de replicación), y dos regiones auxiliares que flanquean la región central (Sanz-Burgos y Gutiérrez, 1998). Otros elementos importantes son los iterones, que en este caso están localizados en el extremo 5´ de la región central y hacia el extremo 3´ de la horquilla (Argüello-Astorga y col., 1994a;
Gutiérrez, 2002). Cerca de la horquilla se encuentra además, una secuencia rica en GC, que también es importante en la replicación (Fenoll y col., 1990). Los ensayos de protección con DNAsa I y las observaciones al microscopio electrónico han sugerido la localización de la proteína Rep sobre el ADN viral (Sanz-Burgos y Gutiérrez, 1998; Castellano y col., 1999). In
vitro, la proteína Rep en monómeros o dímeros, interactúa con segmentos de ADN viral
localizados hacia el extremo 5´ de la región central (coincide con la presencia del iterón) y cuesta abajo de la región auxiliar 3´. Estas dos interacciones son altamente afines, mientras que un tercer complejo de menor afinidad, se forma en la horquilla. Los dos primeros complejos se denominan complejos C y V, y el tercero se nombra complejo O. La diferencia en afinidades parece indicar que el proceso de ensamblaje del complejo de replicación ocurre en etapas. Primero se ensamblan los complejos C y V, y luego el complejo O. In vivo, pudiese ocurrir de forma primaria la formación de los complejos C y V, luego la oligomerización de la proteína Rep, y posteriormente éstos interactúan con la horquilla. El complejo así formado sería capaz de iniciar el mecanismo de círculo rodante después de introducir una mella sitio- específica y generar el OH-3´ necesario como cebador (Gutiérrez, 2002).
Figura 3. Esquema que representa el origen de replicación del begomovirus bipartito TGMV y un modelo de los
primeros eventos de la replicación. A: El origen de replicación de TGMV incluye a los sitios de interacción con la proteína Rep (los iterones), la estructura en horquilla o elemento estructural conservado (EEC), el sitio de corte en la secuencia de nueve nucleótidos (en rojo) conservado en todos los geminivirus, y otros sitios de unión a factores transcripcionales como la caja TATA para el gen AC1. B y C: Modelo secuencial que representa la interacción posible entre las proteínas virales Rep y REn entre sí, y de ellas con otros factores posibles del hospedante. C: El ADN del origen debe plegarse para garantizar la interacción del nanonucleótido y la proteína Rep. FUCA: Factor de unión al motivo CAAA, Rep: Proteína viral asociada a la replicación, FT: Factor transcripcional del hospedante, FUAG: Factor de unión al motivo AG, y FUCG: Factor de unión a la caja G. Esquema modificado del presentado por Monsalves-Fonnegra y col. (Monsalve-Fonnegra y col., 2001).
CCAAAAGTTTATATGAATTGGTAGTAAGGTAGCTCTTATATATTAGAGTTCCTAAGGGGCACGT motivo CAAA GGCGC GC G C C T A C C G G C C G G T A G G C T TA T A AT Iterones caja G motivo AG caja TATA sitio de corte A B C REn ? ? ? ?
CAAA iterones TATAMotivo AG Caja G
(FUCA) (Rep) (FT) (FUAG) (FUCG) CAAA iterones TATA Caja G Motivo AG horquilla Rep T A T C
En los begomovirus, el sitio origen de la replicación incluye la horquilla y varias regiones enmarcadas en aproximadamente 200 nt del extremo 5´ de la RI, o lo que se conoce como la región RC para los bipartitos (Frischmuth y Stanley, 1992; Lazarowitz y col., 1992; Jupin y col., 1995; Choi y Stenger, 1995). En TGMV la zona de interacción primaria de la proteína Rep con el ADN se localizó en 13 pares de bases, que consisten en dos copias de un motivo de 5 nucleótidos (iterones) separados por 3 bases (Figura 3A) (Fontes y col., 1994a; Fontes y col., 1994b). Mientras los motivos del extremo 3´ son primordiales, los del extremo 5´ sólo potencian la interacción con la proteína Rep. Otros motivos con secuencias no idénticas pero sí localizados en igual posición a los de TGMV, se identificaron en la mayoría de los begomovirus y curtovirus (Argüello-Astorga y col., 1994a). Dos sitios de unión a factores transcripcionales, las cajas TATA y G, se encuentra dentro del origen de replicación de TGMV y de otros geminivirus (Argüello-Astorga y col., 1994b; Eagle y Hanley-Bowdoin, 1997). Los estudios con TGMV han demostrado que estos motivos no son esenciales para la replicación de los geminivirus, aunque contribuyen con la eficiencia del proceso. En el caso de la caja G, se ha especulado sobre su interacción con un factor transcripcional que puede facilitar el reclutamiento de la proteína Rep y su interacción con el origen de replicación, modular el ensamblaje de la cromatina y dar acceso al origen de replicación, o estabilizar la conformación del origen (Hanley-Bowdoin y col., 2000). Otros dos elementos están presentes en el origen de replicación de la cadena viral de TGMV: los motivos AG y CAAA (Figura 3A). Ambos contribuyen a elevar la eficiencia de la replicación (Orozco y Hanley-Bowdoin, 1998). El papel del motivo AG también es el mismo en SLCV (Lazarowitz, 1991). La interacción de la proteína Rep con sus secuencias dianas requiere la oligomerización. La formación del complejo de replicación conlleva además, a que otras proteínas Rep interactúen con la proteína REn y estas a su vez con la horquilla y con el complejo Rep-ADN formado primariamente (Figura 3B y C). Luego de la formación del complejo, la proteína Rep produce un corte para iniciar la replicación y el extremo 3´ resultante es el cebador de la síntesis de la cadena naciente. La elongación de la cadena naciente probablemente se lleva a cabo por la maquinaria de replicación nuclear de la planta, ya que ninguna de las proteínas virales tiene una homología detectable con la ADN polimerasa (Hanley-Bowdoin y col., 2000). Una vez sintetizada la nueva horquilla, la proteína Rep a través de su actividad endonucleasa/ligasa, libera la cadena viral progenie.
La replicación dependiente de la recombinación ocurre de la siguiente forma: un fragmento de ADNsc interactúa de forma homóloga con un intermediario de ADNdc y a partir de este sitio ocurre la elongación de la cadena de ADNsc por desplazamiento de la burbuja de replicación. La nueva cadena sirve de molde para la síntesis de una cadena complementaria.
El modelo de la replicación dependiente de la recombinación puede explicar algunos fenómenos que se presentan en la biología de los geminivirus, como por ejemplo la rápida o frecuente recombinación observada entre las diferentes especies. Este mecanismo también puede contribuir a completar la replicación de moléculas que hayan quedado truncadas durante el círculo rodante (Jeske y col., 2001).