Crecimiento de Grifola sordulenta en sustratos suplementados

La velocidad de colonización hallada con el sustrato basal fue superior a las registradas en el primer TCL para los tratamientos con respuestas de muy alto crecimiento. Sin embargo en este TCL no se pudo superar la velocidad de colonización del tratamiento basal en ninguno de los tratamientos estudiados, si bien algunos tuvieron una mejor respuesta en cuanto a la densidad micelial aparente (Tabla 34).

Las mejoras en la densidad de crecimiento micelial aparente se observaron en los tratamientos S2 (ácido sulfúrico diluido), S4 (Mn(II), 20ppm) y S6 (Zn(II), 100ppm). En el caso del tratamiento del material lignocelulósico con ácido sulfúrico a temperatura elevada, la mejor respuesta de crecimiento micelial de G. sordulenta en relación al observado en medio basal, puede atribuirse a la hidrólisis térmica anteriormente mencionada en la discusión de la respuesta de crecimiento de micelio de G.

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gargal en un sustrato formulado de manera similar. Es evidente que tal tratamiento hidrolítico en medio de ácido sulfúrico contribuye de manera significativa a la biodegradación del material lignocelulósico, como se ha informado en otros casos (Zheng et al., 2009a).

Por otro lado, la mejor colonización por micelio de G. sordulenta en los sustratos conteniendo 20 ppm Mn(II) o 100 ppm Zn(II), con respecto a la observada para el sustrato basal, coincidió con la observada en G. gargal, y entonces se la puede atribuir a una estimulación de enzimas ligninolíticas, especialmente la MnP y otras enzimas dependientes del zinc como cofactor y que estarían involucradas en el metabolismo fúngico (ver discusión en 3.1).

La velocidad de crecimiento micelial y la densidad de crecimiento micelial aparente de Grifola sordulenta en el sustrato base suplementado con sulfato de amonio no fue diferente al observado con el sustrato basal. La habilidad para crecer bien en presencia de amonio es una característica de algunos hongos cuyo nicho es el suelo de bosques con mucha materia orgánica (Soponsathien, 1998; Yamanaka, 1995) y la cual es considerada una adaptación que les permite el acceso a fuentes nutritivas donde otros hongos no pueden desarrollarse. Los hongos del complejo Pleurotus spp. también crecen o son estimulados en presencia de sales de amonio (Stajic et al., 2006; Sharma y Arora, 2010). Es más, durante el cultivo en sustratos a base de cáscara de girasol de Pleurotus ostreatus y otra especie comestible H. erinaceus, se halló que una suplementación con NH4 (I) en el

rango de 200 a 750 ppm incrementaba entre 11 y 27% la velocidad de colonización medida con el TCL (Curvetto et al., 2002a; Figlas et al., 2007). En este ensayo con G. sordulenta, se usó una concentración relativamente baja de la sal de amonio y es probable que dosis mayores pudieran producir aumentos semejantes en la velocidad de colonización.

La suplementación con otras fuentes de lignocelulosa resultó perjudicial para el crecimiento de G. sordulenta, en oposición a lo observado con G. gargal. El agregado de virutas de álamo o roble o de paja de trigo disminuyó significativamente la velocidad de colonización y además la densidad micelial aparente. De acuerdo con lo planteado anteriormente, G. sordulenta obtendría los nutrientes necesarios sólo del sustrato basal, y en todo caso la estimulación del crecimiento podría hacerse por otra vía. Un ejemplo sería incrementar la actividad CDH previamente observada in vitro y así elevar la asimilación de celulosa; algunos estimuladores de esta enzima hallados en un hongo de la pudrición blanca, Schizophyllum commune, fueron: pH acídico, Tween 80, celulosa, polvo de algodón (sin ceras) y también varias sales de amonio especialmente el fosfato ácido de di amonio (Fang et al., 1999). Entonces la presencia de N-NH4 sería responsable también de la mejora en el crecimiento micelial de

195 Tabla 34.Velocidad de colonización por micelio de Grifola sordulenta de diferentes sustratos a base de cáscara de girasol, a los 35 días de cultivo. Sustrato basal (S1): 80% cáscara de girasol entera, 15% sustrato biotransformado por Pleurotus ostreatus y 5% salvado de trigo, sobre la base de peso seco. El sustrato basal fue tratado con ácido sulfúrico, o suplementado con sales minerales o con materiales lignocelulósicos o con aceite de girasol. La densidad aparente se clasificó con 0, +, ++, +++ y +++! (“!”indica que la respuesta de crecimiento micelial resultó ser mejor que en el sustrato basal).

Tratamientos Velocidad de colonización mg PSS/día ± EEANOVA a Densidad aparente del micelio S1 Basal 117 ± 4,7 a +++ S2 SO4H2 0,01N 118 ± 4,7 a +++ ! S3 NH4(I)200ppm 109 ± 4,7 ab +++ S4 Mn(II) 20ppm 111 ± 4,7 ab +++ ! S5 Cu(II) 100ppm 64 ± 4,7 000de + S6 Zn(II) 100ppm 118 ± 4,7 a +++ ! S7 Roble 20% 79 ± 4,7 00cd ++ S8 Álamo 20% 89 ± 4,7 0bc + S9 Paja trigo 20% 64 ± 4,7 000de + S10 Aceite girasol 5% 50 ± 4,7 0000e + a

Los valores de velocidad de colonización fueron transformados con la variable logaritmo natural, corresponden a 6 u.e. por tratamiento. El error estándar se calculó con: EEANOVA = (CMerror /ni) ½. Las distintas letras indican

las diferencias significativas determinadas con el test de Tukey (α=0,05).

La suplementación con Cu(II) a una dosis de 100 ppm inhibió fuertemente el crecimiento en G. sordulenta como pudo observarse en la marcada reducción tanto en la velocidad de colonización como en la densidad micelial aparente. Este marcado efecto micotóxico a esta dosis de Cu(II) no era esperado, ya que cultivos sumergidos de G. frondosa crecen bien aún hasta 200 ppm de Cu(II) (Figlas et al., 2010). Vale mencionar aquí también que una concentración de 250 ppm de Cu(II) resultó ser óptima para la estimulación de la actividad de lacasas en Pleurotus pulmonarius (Tychanowicz et al., 2006). Es más, varios hongos de la pudrición blanca cultivados en medios semisólidos en agar pudieron crecer en presencia de hasta 630 ppm de cobre (Guillén y Machuca, 2008).

Como observación adicional se puede recordar el uso del cobre con fines de preservación de la madera a concentraciones por encima de las 500 ppm, cuando sobrepasa el umbral de atoxicidad biológica (Baldrian, 2003). La comparación de estos valores con el resultado hallado en G. sordulenta estaría indicando que se trata de una especie sensible a este metal pesado, y en todo caso el empleo del cobre como posible inductor del metabolismo ligninolítico debería realizarse con concentraciones del orden de 20 ppm, cercanas a las de la madera de árboles de Nothofagus spp. que coloniza esta especie de hongo.

La suplementación del sustrato base con 5% de aceite de girasol (S10) produjo una marcada inhibición de ambos, la velocidad de colonización del sustrato y el crecimiento micelial aparente de G. sordulenta. Este efecto inhibitorio podría estar relacionado con ciertos metabolitos secundarios en el

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aceite con actividad antifúngica, como fue reportado para hongos ascomicetes (Picman et al., 1990; Ko et al., 2003). En la sección anterior se demostró que en el caso de G. gargal no produjo tal efecto inhibitorio.

Figura 66.Imágenes representativas de cultivos de Grifola sordulenta a los 35 días de colonización. Las formulaciones de sustrato basal (S1) fueron suplementadas con: SO4H2 0,01N (S2), NH4(I)200

ppm (S3), Mn(II)20 ppm (S4), Cu(II) 100 ppm (S5), Zn(II) 100 ppm (S6), virutas de roble 20% (S7), virutas de álamo 20% (S8), paja de trigo 20% (S9), o aceite de girasol 5% (S10).