Efecto de la luz sobre el crecimiento vegetativo de Grifola gargal

Se inoculó medio MYPA en cajas de Petri con la cepa A de Grifola gargal y se incubó en oscuridad por 72 h a 21 ±1°C. Luego de este período, las cajas de Petri como unidades experimentales (u.e.) se distribuyeron aleatoriamente en los tratamientos: Luz Azul, Luz Verde (n=8); y Luz Roja, Luz Blanca y Oscuridad (n=9). El tratamiento de luz consistió en irradiar a las unidades experimentales con una radiación de flujo fotónico de 4 µmol m-2s-1 emitida por un tubo fluorescente de luz blanca (20 watts, Philips TLT 20W/54 RS daylight) ubicada a 60 cm.

Las colonias se cultivaron durante 33 días con un fotoperíodo de 12 h bajo las condiciones mencionadas de irradiación de energía lumínica, las cuales se obtuvieron utilizando hojas de celofán de color azul, verde o rojo (tratamientos denominados Luz Azul, Luz verde y Luz roja, respectivamente) acorde con Galston y Satter (1974), sin filtro de celofán (Luz Blanca) y un control en ausencia de irradiación que se realizó envolviendo las colonias en papel de aluminio (Oscuridad). En las Figuras 34 y 35 se muestran imágenes representativas de las condiciones del ensayo.

El análisis de crecimiento se realizó midiendo el diámetro promedio de dos mediciones perpendiculares cada 3 días. También se compararon las velocidad de crecimiento al día 33 (mm día-1) Estos dos análisis se analizaron con Anova simple (α =0,05) (Di Rienzo et al., 2010).

Por otra parte, con el fin de detectar manifestaciones atribuíbles al cambios morfogénicos: exudados y agregados miceliales, se observó su presencia o ausencia cada 3 días, y luego se analizaron comparaciones da a pares con el test de Fisher según Lowry (α =0,05) (2011).

La temperatura del cuarto se controló con un equipo de aire acondicionado ajustado para un rango térmico de 21 ±3°C y se registraron periódicamente las temperaturas máximas y mínimas. Los valores de temperatura se muestran en la Figura 36.

90 Figura 33. Horarios del amanecer, ocaso y duración del fotoperíodo en el Parque Nacional Lanín. Fuente: www.infoclima.com.ar.

Figura 34. Cuarto de cultivo e irradiación de luz. En la figura de la izquierda se muestra la disposición de los tratamientos, y en la de la derecha la ubicación del tubo fluorescente.

91 Figura 35. Placas que muestran los efectos de los tratamientos a 30 días del comienzo del ensayo. Luz blanca (A), oscuridad (B), Luz azul (C), Luz verde (D), Luz roja (E). Obsérvese el crecimiento y apariencia contrastante de micelio en los tratamientos con luz y en oscuridad.

Figura 36. Evolución de las temperaturas máxima (●), mínima (□), y rango térmico (×) registrados durante el período del ensayo. La temperatura máxima promedio durante el ensayo fue de 22,1ºC, y la mínima de 19,1ºC y los mayores valores del rango térmico diario se registraron entre los días 7 y 12.

A

B

92 2.1.1. Tipo de irradiación lumínica

Los espectros de absorción de cada tratamiento lumínico se registraron con un espectrofotómetro Spectroquant UV/VIS Spectrophotometer Pharo 300© (Figuras 37a-c nótese que es el complementario al espectro de emisión). La energía de radiación del tubo fluorescente, según datos del fabricante en µW por 5 nm por lumen, se muestra en la Figura 37d.

Asimismo se determinaron las correspondientes densidades de flujo fotónico a nivel de las cajas de Petri mediante un equipo de medición de PAR (photosinthetically active radiation) LICORMR. Las mismas fueron de 4 µmol m-2s-1 (blanca), 2 µmol m-2s-1 (azul), 3 µmol m-2s-1 (verde) y 2 µmol m-2s-1 (roja).

Figura 37.Espectros de absorción de los filtros preparados con hojas de celofán. Se emplearon hojas de color azul (a), verde (b) y rojo (c), también se muestran como referencia los colores de las diferentes longitudes de onda. Espectro de emisión del tubo fluorescente en el rango de 380- 800, fuente: http://www.ecat.lighting.philips.com (d).

2.2. Fotomorfogénesis en Grifola gargal y G. sordulenta

Se prepararon cultivos de G. gargal (cepa Ay B) y G. sordulenta en medio MYPA modificado contenido en cajas de Petri. Los detalles de las condiciones del ensayo se presentan en la Tabla 4.El cultivo se realizó en una cámara de cultivo CCC-20 (Lab. Electrónica, CCT-CONICET Bahía Blanca) con control de temperatura, fotoperíodo y humedad. La humedad permaneció constante a 90% durante todo el ciclo de cultivo. Éste comenzó en las condiciones mencionadas como óptimas en la literatura para el crecimiento vegetativo: oscuridad y temperatura normal (17 y 19ºC); luego de la colonización

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completa, el cultivo continuó en oscuridad y se disminuyó la temperatura para producir un choque térmico. Este pre tratamiento se realizó con el propósito de llevar el micelio a un estado fisiológico y nivel térmico de manera que permitiera que la inducción lumínica tuviera lugar.

Culminado el pre tratamiento, las colonias (u.e.) se distribuyeron en 6 u.e. para cada tratamiento (Luz blanca, Oscuridad, Luz azul, Luz verde y Luz roja) de G. gargal (cepas A y B). En el caso de G. sordulenta, los tratamientos Luz blanca y Luz roja consistieron en 6 u.e. cada uno (una u.e. del tratamiento de luz roja se contaminó y fue descartada), mientras que los demás tratamientos contaron con 7 u.e. cada uno.

Los tratamientos lumínicos se lograron empleando láminas de acrílico de PlexiglasMR de 4 mm de espesor para los colores azul, verde y rojo, (ver características en 2.2.1 y en la Figura 38). Para el tratamiento luz blanca las cajas se expusieron directamente a la fuente luminosa y para el de oscuridad se evitó la incidencia lumínica protegiéndolas mediante una barrera de acero inoxidable. Además, con el propósito de imitar las condiciones existentes en los hábitats naturales en la época de fructificación de estos hongos (ver Mayo-Junio en la Figura33), se aplicó un fotoperíodo de 10 h y una oscilación térmica de 12ºC para el fotoperíodo y de 2ºC para el nictoperíodo.

Las cajas se rotaron de posición semanalmente. El crecimiento del micelio se registró fotográficamente. A partir del día 92 las colonias se destaparon momentáneamente (ventilación) y también se fotografiaron, procedimiento que fue repetido en adelante dos veces más, una vez por semana. Se utilizó el test Chi2 y el test de Fisher (α=0,05) acorde a Lowry (2011), para la comparación del número de u.e. presentando cambios primarios: exudados, aroma almendrado, pigmentos, poros; y secundarios: agregados (cúmulos de micelio <5 mm), lamelas, primordios (agregados esféricos >5 mm) entre tratamientos.

Tabla 4.Fases y condiciones del experimento para el estudio de la fotomorfogénesis en Grifola gargal y G. sordulenta.

Inicio Crecimiento

vegetativo

Inducción del

metabolismo 2rio Irradiación

Irradiación + ventilación

Procedimiento Inocula-

ción

Cultivo en

oscuridad Choque frío

Inspección semanal (a) Inspección semanal (b) Período desde la inoculación (días) 0 1-22 22-58 58-92 92-119 Período de duración de cada fase (días) - 22 36 34 27 Fotoperíodo - No No 7 h 7 h Control de temperatura 18°C 7 h a 19ºC 17 ha 17ºC 5ºC 7 h a 10ºC 17 h a 2ºC 7 h a 10ºC 17 h a 2ºC Ventilación - No No No 1 cambio semanal (a) Las observaciones fueron realizadas con la caja de Petri cerrada; y luego (b) con la caja de Petri abierta.

94 2.2.1. Tipos de irradiación lumínica

La fuente luminosa incorporada en la cámara de cultivos fue un tubo Philips TLD 36W/54. Los espectros de absorción de cada tratamiento lumínico fueron registrados con un espectrofotómetro Spectroquant UV/VIS Spectrophotometer Pharo 300© (Figuras 38A-C) nótese que es el complementario al espectro de emisión). La energía de radiación del tubo fluorescente (según datos del fabricante PhilipsMR, en µW por 5 nm por lumen) se muestra en la Figura 38D.

Asimismo se determinó las correspondientes densidades de flujo fotónico a nivel de los cultivos medidas mediante un equipo de medición de PAR (photosinthetically active radiation) LICORMR. Las mismas fueron de 4 µmol m-2s-1 en blanca, 2 µmol m-2s-1 en azul, 3 µmol m-2s-1 en verde y 2 µmol m-2s-1 en roja.

Figura 38.Espectros de absorción de los filtros de acrílico medidos con espectrofotómetro. Espectros de: luz azul (a)con unancho de banda de emisión máxima entre 440-500 nm; de luz verde (b) con un ancho de banda de emisión máxima entre 505-560 nm y de luz roja (c) con un ancho de banda de emisión máxima > 620 nm. Espectro de emisión del tubo fluorescente en el rango de 380- 800, fuente: http://www.ecat.lighting.philips.com (d).

95 3. Resultados y discusión

3.1. Efecto de la luz sobre el crecimiento vegetativo y la morfogénesis de Grifola gargal