Medios de cultivo

En la Tabla13 se muestra la composición de los medios nutritivos empleados en los tratamientos. Un medio basal (C), fue suplementado con vitaminas- aminoácidos (VA), con reguladores (R) o con ambos vitaminas-aminoácidos y reguladores (VA+R). Los medios de crecimiento se ajustaron a pH 4,3 y posteriormente se esterilizaron en los frascos.

Tabla 13. Composición de los medios de cultivo usados para Grifola gargal y G. sordulenta. Medio basal (C), medio basal suplementado con vitaminas y aminoácidos (VA), medio basal suplementado con reguladores de crecimiento vegetal (R) y medio basal suplementado con vitaminas, aminoácidos y reguladores de crecimiento vegetal (VA+R).

Tratamientos Tipo de nutriente Detalle y cantidad

C (control) Carbohidrato principal Fuentes nitrogenadas Sales macronutrientes Sales micronutrientes

18 g/l sacarosa

6 g/l extracto de levadura; 3 g/l peptona

1,65 g/l NO3NH4; 1,9 g/l NO3K; 0,44 g/l Cl2Ca.2H2O; 0,37 g/l SO4Mg.7H2O; 3 g/l PO4H2K 6,2 mg/l BO3H3; 16,9 mg/l SO4Mn.H2O; 8,6 mg/l SO4Zn.7H2O; 0,83 mg/l KI; 0,25 MoO4Na2.2H2O VA Vitaminas Aminoácidos

100 mg/l inositol; 0,5 mg/l ácido nicotínico; 0,1 mg/l tiamina; 0,5 mg/l piridoxina; 0,5 mg/l ácido ascórbico; 0,5 mg/l ácido fólico; 0,5 mg/l riboflavina

150 mg/l triptofano; 150 mg/l alanina; 150 mg/l fenil alanina

R Reguladores 0,1 mg/l ácido indol acético; 0,1 mg/l bencilaminopurina; 0,1 mg/l ácido giberélico VA+R Vitaminas aminoácidos

Reguladores

medio VA medio R

127 2.3. Determinaciones

Luego de 30 días de cultivo, al momento de recolección de la biomasa de micelio, se determinaron los valores de pH, conductividad y contenido de glucosa en los medios de crecimiento. Para este último caso se utilizó un kit de laboratorios Wienner® que usa un método enzimático.

2.4. Análisis de los datos

Los valores de biomasa se analizaron con Anova simple y las medias fueron diferenciadas con el test de Tukey (α=0,05). El error estándar de cada media para la biomasa se calculó con la fórmula EEMEDIA= (STi2/nTi) ½. También se realizaron análisis de correlación entre pH o conductividad con el

peso seco del micelio (α=0,05). Los cálculos se realizaron empleando el software Infostat (Di Rienzo et al., 2010).

3. Resultados y discusión

Mediante este método de cultivo fue posible obtener biomasa de micelio de manera sencilla y con una rápida recuperación. En la Figura 45 se muestran imágenes fotográficas del micelio obtenido; pueden observarse las formas nubosas debida a la baja agitación de los cultivos. Cabe destacarse que el medio siempre se observó traslúcido y que en el caso de G. sordulenta presentó una tonalidad de color más oscura que con G. gargal. Ambas especies produjeron un aroma almendrado que se mantuvo en el medio luego de la extracción del micelio, sugiriendo allí la presencia remanente de estos metabolitos volátiles.

Los suplementos (vitaminas y aminoácidos y/o reguladores de crecimiento vegetal) no produjeron incrementos significativos en el peso fresco ni en el peso seco para ninguna especie (p>0,05). Tampoco se encontraron diferencias significativas en el rendimiento de biomasa (peso fresco o peso seco) entre Grifola gargal y G. sordulenta (p<0,05). Los mayores valores de producción de biomasa (peso seco) en función del volumen del medio estuvieron entre 4 y 6 g/l, respectivamente (Figura46). A pesar de que no se encontraron diferencias significativas pudo observarse que i) G. sordulenta superó a G. gargal en los valores promedio de contenido de biomasa en todos los tratamientos, y que ii) el valor promedio de biomasa correspondiente al tratamiento R superó a los correspondientes valores de biomasa de los demás tratamientos.

Si bien este ensayo se mantuvo por 10 días más que el presentado en la sección anterior, no fue posible alcanzar el mismo rendimiento de biomasa. Posiblemente podría haberse obtenido una mayor biomasa en presencia de CSG, pero en este caso no se agregó a fin de evitar una combinación compleja de metabolitos secundarios, ya que la CSG contiene vitamina E y otras moléculas antioxidantes que luego causarían interferencias al ensayar las propiedades antioxidantes de este material (ver más abajo que prácticamente se usó toda la fuente carbonada). Si se asume que la presencia del aroma almendrado es indicativa de la producción de metabolitos secundarios; el inicio para la extracción de estos metabolitos secundarios podría ser a partir del día 15, cuando comienza a percibirse el aroma almendrado en las condiciones del ensayo.

128 Figura45. Micelio de Grifola gargal y G. sordulenta cultivado en medios nutritivos líquidos durante 30 días, a 20 ±1ºC, oscuridad y 30 rpm. A: frasco con 500 ml de medio de cultivo; B: micelio recolectado; C, D, E, F: masas miceliares con formas esferoidales-nubosas. Las Figuras A, B, C, F pertenecen a G. gargal; y D, E pertenecen a G. sordulenta.

A B

C D

E

129

Se ha visto que la disminución en el contenido del carbono es una señal desencadenante del metabolismo secundario (Lin y Chen, 2007). Al tiempo de la cosecha se determinó que el contenido de glucosa presente en el medio (resultante de la hidrólisis de la sacarosa del medio) disminuyó de 15 g/l a un promedio de 0,5-2,0 g/l, implicando que se utilizó el 86-95 % de la misma. No hubo diferencias significativas en el contenido remanente de este metabolito entre tratamientos ni entre las especies bajo estudio (p>0,05). Es así que durante el tiempo de cultivo, una gran proporción del contenido de carbono se usó en la respiración celular. En la Figura 47 se muestra una representación de Box- Whisker para el contenido de glucosa en cada unidad experimental de cada especie (todos los tratamientos).

Figura 46. Valores promedio de la biomasa de micelio (g) por unidad experimental de Grifola gargal y G. sordulenta. Los tratamientos fueron: medio de cultivo basal (C), C + vitaminas y aminoácidos (VA), C + fitoreguladores (R), C + vitaminas, aminoácido y reguladores (VA+R). Los desvíos corresponden al error estándar de cada media.

Figura 47. Representación Box-Whisker que muestra el contenido de glucosa (g/l) remanente en el medio luego de 30 días de cultivo. Se muestran los valores máximos, mínimos, mediana y las cajas grises que representan el 50% de los datos. El valor inicial de sacarosa en el medio fue de 18 g/l.

Cbnmbnmbn VA bkknmbn R bkknbn VA+R

Biomasa (g)

Glucosa (g/l)

130 Biomasa peso seco (g)

Biomasa peso fresco

(g)

Biomasa peso seco (g)

Biomasa peso seco (g) pH

El remanente de glucosa al día 30 es muy poco y no deja margen para extender el período del cultivo, en estas condiciones la lisis celular puede producir metabolitos secundarios indeseables (Papagianni, 2004). En ambas especies el peso fresco y el peso seco fueron correlativos (Figura48, los datos corresponden a todos los tratamientos de las dos especies) y el contenido de agua del micelio fresco resultó ser del 96 %. No se halló correlación (p>0,05) entre el pH y el peso seco, aunque sí hubo un incremento en la acidez de G. sordulenta pH 4,6, mientras que G. gargal se mantuvo a un pH más alto (Figura49, p<0,05). En cuanto a la absorción de sales del medio por el micelio de G. gargal o G. sordulenta en crecimiento, en el nivel salino de los tratamientos ensayados, resultó ser no significativa. La Figura50. Muestra la ausencia de correlación entre conductividad (μS/cm) y biomasa (peso seco) de todas las unidades experimentales.

Figura 48. Correlación del peso fresco vs. peso seco (gramos) del micelio de Grifola gargal y de G. sordulenta cultivados en frascos. El contenido de agua en el micelio fresco es constante (c.a. 96 %) hasta los 2 g de micelio seco por unidad experimental.

Figura 49. Correlación entre pH (medido al final del cultivo) y biomasa del micelio fúngico (peso seco en gramos) a los 30 días de cultivo líquido de Grifola gargal y G. sordulenta en medios estacionarios.

r=0,31 r=0,24

131 Conductividad

μS/cm

Figura 50. Correlación entre conductividad (μS/cm) y biomasa del micelio fúngico (peso seco en gramos) de todas las unidades experimentales a los 30 días de cultivo de Grifola gargal y G. sordulenta en medio líquido bajo agitación suave.

4. Conclusiones

El cultivo de micelio en frascos permitió obtener con estas unidades experimentales micelio de G. gargal y G. sordulenta de manera más fácil, pero con rendimientos de biomasa menores a los hallados con Erlenmeyers de 250 ml. El agregado de suplementos nutritivos orgánicos no mostró mejoras importantes en cuanto a la cantidad de biomasa. Esta metodología produjo una mayor biomasa micelial en G. sordulenta en comparación a la obtenida con G. gargal y permite la posibilidad de separar muy fácilmente el micelio desde el caldo de cultivo.

Biomasa peso seco (g) r=0,12

132

C. Cultivo de Grifola gargal y G. sordulenta en medio líquido en Erlenmeyers de 500 ml.

Efecto de labencilaminopurina

1. Introducción

Los estudios fisiológicos revelan que los reguladores de crecimiento vegetal también poseen actividad en el reino Fungi. En efecto, se halló que intervienen en la elongación celular y la diferenciación (Yanagishima, 1963; Tomita et al., 1984), en el aumento de biomasa y del contenido proteico en Pleurotus sajor-caju, en Agaricus campestris y en Volvariella esculenta (Mukhopadhyay et al., 2005; Guha y Banerjee, 1974; Jonathan et al., 2004, respectivamente). En Lentinus subdunus cultivado en troncos se observó que aumentan la productividad (Kadiri y Arzai, 2004) y además se encontró que estimulan la germinación de esporas en G. frondosa (Isikhuemhen y Vaughans-Ward, 2005).

Entre todos los reguladores vegetales conocidos, las citocininas han recibido una atención especial por su intervención en la relación simbiótica planta-micelio de los hongos micorrícicos. De hecho, este grupo de hongos sintetizan citocininas como parte de estas interacciones (Kraigher et al., 1991; Dutra et al., 1996), incluso se conoce que ciertos aminoácidos incrementan su producción durante el cultivo líquido (Kampert y Strzelczyk, 1990).

Como en los vegetales, las citocininas regulan el intercambio de iones a través de las membranas celulares del micelio, la división y elongación celular, movilización de nutrientes y participan en el retraso de la senescencia (Dua y Jandaik, 1979). Asimismo, regulan el metabolismo secundario como se ha demostrado en Agaricus bisporus en relación con la producción de aroma y maduración del basidiocarpo (Pohleven 1990; Champavier et al., 2000; Braaksma et al., 2001).

1.1. Hipótesis

El crecimiento de G. gargal y de G. sordulenta puede ser estimulado por una citocinina, la bencilaminopurina.

1.2. Objetivos

El propósito del estudio fue evaluar la influencia de la bencilaminopurina (BAP: 0,1-10 mg/l) en el crecimiento del micelio cultivado en medio nutritivo líquido en agitación. Como un objetivo adicional se estudiaron dos metodologías de homogenado de micelio para elaborar el inóculo. En el capítulo IV se presenta la evaluación del micelio resultante en su actividad antioxidante (“GgLC-BAP 0 0,1 1 5 y 10” y “GsLC-BAP 0 0,1 1 5 y 10”).

133 2. Materiales y métodos

En este ensayo se realizaron modificaciones para obtener una menor variabilidad: como recipientes de cultivo se emplearon Erlenmeyers de 500 ml (conteniendo 125 ml de medio de cultivo dando una relación inicial volumen de medio: volumen total de 1:4) y como inóculo se utilizó un homogeneizado en medio líquido del micelio cultivado en cajas de Petri en medio MYPA modificado.

Para la obtención del inóculo líquido se empleó una licuadora doméstica de mano, en condiciones de asepsia, siguiendo en general el protocolo de Stamets (1993) que en este caso resultó ser útil, aunque como este autor menciona, no todas las especies son tolerantes a este tipo de manejo. Es así que en el ensayo preliminar, que se describe en la siguiente sección, se pudo observar con esta metodología que G. gargal mostraba valores más homogéneos de biomasa entre las réplicas, aunque en promedio resultaron ser menores que en el caso de los obtenidos usando ya sea la inoculación con discos de agar o bien cuñas de micelio, sugiriendo que este procedimiento disminuyó los puntos de crecimiento por ruptura celular. Se asumió que también sería este el caso para G. sordulenta.