Fermentación sumergida en condiciones de cultivo estacionario

El medio empleado fue el propuesto por Lee et al. (2003) para G. frondosa: 30 g glucosa, 6 g extracto de levadura, 2 g peptona de carne, 0,5 g SO4Mg.7H2O, 0,14 g SO4Mn.5H2Oy 0,5 g PO4HK2,

por litro, a pH 4. Después de agregar el medio (500 ml) a las fuentes de vidrio de 4 litros de capacidad (10 u.e. por especie), se envolvió el conjunto en bolsas de polipropileno resistentes a alta temperatura y

138

se procedió a su autoclavado a 121ºC durante 30 minutos. El inóculo, correspondiente a cada una de las dos especies de Grifola bajo estudio, se agregó en una proporción del 10% v/v del medio de cultivo contenido en las fuentes. El cultivo se realizó durante 48 días, en oscuridad y a 20°C.

2.3. Análisis de los datos

A los 48 días de cultivo, el micelio de las dos especies había cubierto la superficie del medio de cultivo. Se dio por finalizado el ensayo y el material se filtró con una malla de nylon (ϕ30 µm) y se liofilizó. Posteriormente se conservó en desecador hasta la determinación de sus propiedades antioxidantes (ver capítulo VI). El rendimiento de biomasa se analizó con el test t de Student (α=0,05).

3. Resultados y discusión

En la Figura 53 se muestran las secuencias de la técnica utilizada. De las 10 fuentes usadas por tratamiento quedaron 4 en G. sordulenta y 7 en G. frondosa. El resto del material se perdió por contaminación, lo cual es relativamente esperable cuando se debe manipular asépticamente estos sistemas y donde la experiencia del operador es muy importante.

Al día 11 de cultivo se tomó una alícuota (1 ml) de los diferentes medios de las fuentes y se realizó un subcultivo en medio MYPA modificado, con el propósito de cuantificar el crecimiento micelial de estas especies en las condiciones especificadas. Luego de 15 días de este cultivo se encontró que G. frondosa produjo c.a. de 17 colonias mientras que G. sordulenta produjo 8 colonias.

Al día 48 del cultivo líquido estacionario, algunas unidades experimentales (fuentes) tenían una gran proporción de masa micelial creciendo por encima del nivel del cultivo líquido (Figura54). Las otras unidades experimentales eran como las de la Figura53C, mostraban un buen crecimiento pero no sobresalían del medio líquido. Se consideró que este tiempo de cultivo había sido suficiente y para evitar la entrada del micelio a la fase de lisis celular por sobrecrecimiento, se recolectó y liofilizó el material.

Los rendimientos expresados como biomasa de micelio seco obtenido por u.e. de 500 ml, en los cultivos estacionarios de G. sordulenta y G. frondosa, se muestran en la Figura 55. Grifola sordulenta obtuvo en promedio 2,8 g/l, y G. frondosa 2,4 g/l, sin diferencias significativas entre ambos (test t de Student p>0,05). Si bien G. frondosa había iniciado el crecimiento con mayor rapidez, como se determinó para el día 11, ambas especies se encontraron en la meseta de crecimiento para el día 48, resultando rendimientos de biomasa similares sobre la base de peso seco.

Fue llamativo encontrar que en este sistema G. sordulenta desarrolló también la pigmentación verde oscura análoga a la comentada en el cultivo en frascos y en Erlenmeyers (en cultivo con BAP). Además G. sordulenta mostró manifestaciones del metabolismo secundario en la superficie i.e. exudados, pigmentación y formación de agregados, mientras que G. frondosa no las desarrolló. Este inicio de cambios morfogénicos señala la posibilidad de realizar cultivos hidropónicos de manera similar a lo informado por Chang y Miles (2004) para el caso del shiitake. Así se muestra que este tipo

139

de cultivo no solo es útil para el estudio de variables que intervienen en la fructificación sino que eventualmente puede representar una alternativa productiva.

Finalmente, en la Tabla 14 se comparan los rendimientos de micelio obtenidos en los diferentes sistemas i.e.: Erlenmeyers de 250 y de 500 ml, frascos y fuentes. Además de las diferencias que se observan en los rendimientos, es importante recalcar que las formas de cultivo pueden condicionar las propiedades químicas del micelio y los productos vertidos por éste al medio.

La metodología de Erlenmeyers de 250 ml resultó como la mejor en cuanto al rendimiento para las tres especies. Mientras que en G. gargal y G. sordulenta con el cultivo en frascos, se obtuvieron mejores rendimientos que con Erlenmeyers de 500 ml. Por otra parte cuando G. sordulenta se cultivó en fuentes, se obtuvo la mitad del contenido de micelio que en frascos de 3 litros y además en el doble de tiempo. El rendimiento de biomasa micelial de G. frondosa producida en fuentes fue menor al logrado en otra cepa con el uso de un biofermentador (Lee et al., 2004).

Figura 53. Cultivo de micelio en medios líquidos estacionarios. A: fuentes de vidrio con medio de cultivo envueltas con polipropileno resistente al autoclavado y esterilizadas en autoclave durante 30 minutos a 121°C. B: luego de su cultivo en oscuridad se retiran de la bolsa protectora. C: Antes de efectuar la recolección del micelio se observa para determinar la ausencia de contaminación y se anotan los caracteres que presenta el cultivo. D: el cultivo se filtra con una malla de nylon (ϕ30 µm) y finalmente se liofiliza.

A B

140 Figura54. Cultivos estacionarios de Grifola sordulenta y de G. frondosa a los 48 días de cultivo. Las fuentes contenían 500 ml de medio. El micelio de G. sordulenta presentó agregados pigmentados y exudados en las zonas de micelio que sobresalían de la superficie. En el caso de G. frondosa se observó sobrecrecimiento abundante de micelio blanco sin formar agregados ni exudados.

Figura 55. Representación Box-Whisker que muestra los rendimientos de biomasa (peso seco del micelio por u.e.) de Grifola sordulenta y G. frondosa obtenido en cultivo en medio líquido estacionario. Las fuentes contenían 500 ml de medio de cultivo. El micelio se durante 48 días a 20°C y en oscuridad. G. sordulenta G. frondosa 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Biomasa micelial (g) G. sordulenta G. frondosa

141 Tabla 14. Comparación del rendimiento de biomasa micelial (peso seco) entre las especies de Grifola estudiadas en relación al tipo de recipiente y volumen de medio. Las especies fueron cultivadas en medio líquido con agitación (Erlenmeyers a 90 rpm y frascos a 30 rpm) y medio estacionario (fuentes). Se incluyen datos de la misma cepa de G. frondosa cultivada en Erlenmeyer de 250 ml y de otra cepa de G. frondosa cultivada en un biofermentador de 5 litros.

Especie Sistema de cultivo

Volumen de medio (ml) Rendimiento (g/l) Días de cultivo Referencia

G. gargal Erlenmeyers 250 ml 50… 8,0…… 20 Postemsky et al., 2006

Erlenmeyers 500 ml 125… 3,3…… 20 Esta tesis

Frascos 3 l 500… 4,0…… 30 Esta tesis