El crecimiento de Grifola gargal en sustratos suplementados

La velocidad de colonización del sustrato correspondiente al sustrato basal G1 fue superada por la obtenida en los tratamientos G8 (roble 20%), G9 (álamo 20%) y G4 (Mn(II) 20 ppm) en un 43, 32 y 20 %, respectivamente (p<0,05). Los tratamientos G2 (SO4H2 0,01N), G6 (Zn(II) 100 ppm) y G9 (paja

de trigo 20%) mostraron una mejor densidad aparente micelial respecto al sustrato basal pero no incrementaron su velocidad de colonización. Estos resultados muestran que existe en el sustrato elegido como basal (CG) alguna limitación nutritiva que afecta el crecimiento micelial de G. gargal, que podría disminuirse mediante la suplementación del sustrato.

Es importante destacar que el empleo de fuentes lignocelulósicas como suplementos de la CG mostró efectos beneficiosos sobre la colonización a pesar de su diferencia en cuanto al origen vegetal por tratarse de virutas de árboles de crecimiento lento, virutas de árboles de crecimiento rápido o bien paja.

Al respecto, los resultados en los casos de G7 y G8 conteniendo un 20% de roble pellín o álamo respectivamente eran esperables. Por un lado el roble pellín es el sustrato natural de G. gargal. Por otro lado, si bien el álamo es una especie exótica, se pudo hallar un ejemplar de este árbol en el mismo hábitat donde G. gargal pudo fructificar, lo cual indica que en condiciones naturales podría ser un hospedante facultativo (Pozzi et al., 2009).

Aún es muy llamativa la respuesta de crecimiento de G. gargal a la suplementación con paja de trigo. Si bien la paja de trigo no es un sustrato natural para los políporos, posee características nutritivas que son apropiadas para el cultivo de esta especie, incluyendo un contenido de micronutrientes inorgánicos similar al de las virutas de madera (Baldrian et al., 2005). Algunos políporos que han sido cultivados en sustratos a base de paja de trigo son Ganoderma australe (Rigas et al., 2007), Trametes versicolor, Bjerkandera adusta, Ganoderma applanatum y Phlebia rufa (Dinis et al., 2009), Lentinus tigrinus (Lechner y Papinutti, 2006), Piptoporus betulinus (Valásková y Baldrian, 2006).

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El tratamiento con ácido sulfúrico diluido también mejoró la densidad aparente de colonización. Este tratamiento disminuyó muy poco el valor de pH (pH 4,8) con relación al del sustrato basal (pH 5,1) por eso no se adjudicaron las mejoras a una disminución del pH, sino al efecto hidrolítico sobre el entramado de enlaces de la lignocelulosa. Este resultado preliminar es promisorio y sugiere la posibilidad de amplificar la respuesta de crecimiento utilizando como parte del acondicionamiento del sustrato un pre-tratamiento con ácido sulfúrico y temperatura. Tal ha sido el caso informado para facilitar la producción de biocombustibles con ciertos microorganismos y sustratos (Sun y Cheng, 2005; Guo et al., 2008; Zheng et al., 2009a).

Con relación a la suplementación mineral, los trabajos previos realizados en CG con P. ostreatus (Curvetto et al., 2002a), H. erinaceus (Figlas et al., 2007) y Agaricus blazei (González- Matute, 2009), fueron tomados como referencia y se escogieron las concentraciones que en estos estudios habían producido diferencias de crecimiento micelial significativas sobre el sustrato basal.

El incremento anteriormente mencionado del 20 % en la velocidad de colonización micelial de G. gargal en sustrato suplementado con 20 ppm Mn(II), fue comparable al informado para P. ostreatus y H. erinaceus (Curvetto et al., 2002a; Figlas et al., 2007). En efecto, la suplementación del sustrato a base de cáscara de girasol con 20-200 ppm de Mn(II) produjo incrementos del 10-25% en la colonización del sustrato por estos hongos.

Posiblemente una mayor dosis de Mn(II) podría incrementar algo más la velocidad de colonización; pero es necesario recordar que las sales de Mn(II) pueden inhibir la enzima LiP (Zhao et al., 1996), por lo cual su uso debería evaluarse cuidadosamente. Aquí habría que considerar además que existen otras sustancias y condiciones que pueden aumentar la actividad de MnP como ser Tween 80, pH, temperatura (Ürek y Pazarlioğlu, 2005), o bien cloruro de amonio en combinación con extracto de malta (Sharma et al., 2010), por mencionar algunos de ellos.

La suplementación con 100 ppm de Zn(II) fue beneficiosa para el crecimiento de G. gargal. González- Matute (2011) hallaron un aumento en la eficiencia biológica cuando se incorporó 25 ppm de Zn(I) al sustrato a base de cáscara en girasol para el cultivo de G. lucidum. Otros resultados similares fueron reportados por González- Matute (2009) en el cultivo de A. blazei, esta vez aplicando dosis de 100 y 200 ppm de Zn(II). Las mejoras observadas pueden atribuirse al rol esencial de este metal en el metabolismo de proteínas, ácidos nucleicos y especialmente en un isotipo de la superóxido dismutasa, de particular significación ya que sería responsable en los hongos de su resistencia al daño oxidativo (Jamieson, 1998; Angelova et al., 2005).

Los tratamientos G5 (Cu(II), 100 ppm) y G10 (aceite de girasol 5%) mostraron velocidades de colonización similares a las del sustrato basal, y en el tratamiento G3 (NH4(I), 200 ppm) hubo una

192 Tabla 33.Velocidad de colonización por micelio de Grifola gargal de diferentes sustratos a base de cáscara de girasol, a los 35 días de cultivo. Sustrato basal (G1): cáscara de girasol 50% entera y 30% molida, 15% sustrato biotransformado por Pleurotus ostreatus y 5% salvado de trigo, sobre la base de peso seco. El sustrato basal fue tratado con ácido sulfúrico o suplementado con sales minerales, con materiales lignocelulósicos o con aceite de girasol. La densidad aparente se clasificó como 0, +, ++ y +++, +++!; en este último caso se usa “!” para indicar que la respuesta de crecimiento micelial resultó ser mejor que en el sustrato basal.

Tratamiento Velocidad de colonización mg PSS/día ± EEANOVA a Densidad aparente del micelio G1 Basal 95 ± 4,1 000de +++ G2 SO4H2 0,01N 100 ± 4,1 00cde +++ ! G3 NH4(I) 200ppm 88 ± 4,1 0000e ++ G4 Mn(II) 20ppm 114 ± 4,1 0bc +++ ! G5 Cu(II) 100ppm 99 ± 4,1 00cde +++ G6 Zn(II) 100ppm 107 ± 4,1 0bcde +++ ! G7 Roble 20% 136 ± 4,1 a +++ ! G8 Álamo 20% 123 ± 4,1 ab +++ G9 Paja trigo 20% 112 ± 4,1 0bcd +++ ! G10 Aceite girasol 5% 93 ± 4,1 000de +++

a

Los valores de velocidad de colonización fueron transformados con la variable logaritmo natural, y corresponden a 6 u.e. por tratamiento. El error estándar se calculó con: EEANOVA = (CMerror /ni)

½

. Las distintas letras indican las diferencias significativas determinadas con el test de Tukey (α=0,05).

El contenido de cobre en las virutas de madera de roble pellín, según datos propios, fue de 17 ppm. Por lo tanto en este ensayo se emplearon concentraciones cinco veces superiores a las condiciones naturales. La concentración de cobre utilizada en el ensayo fue considerada suficiente como para eventualmente detectar un incremento en los parámetros de crecimiento del cultivo, si hubiera sido que las lacasas fueran importantes en la biodegradación; además esta dosis no sería micotóxica según fuera informado para G. frondosa en cultivos líquidos (Figlas et al., 2010). La ausencia de una mejora en la respuesta del crecimiento de G. gargal sugiere que en la biodegradación del material lignocelulósico del sustrato basal existiría una participación más importante de otras enzimas, como MnP y Lip respecto a la de las lacasas, en las particulares condiciones de cultivo del ensayo. Apoyando esta suposición se consideran relevantes las mejoras del crecimiento micelial observadas con la suplementación con Mn (II), los bajos valores de lacasas hallados en el primer test de TCL (ver en este capítulo la sección B) y la actividad asociada a Lip observada durante el cultivo en azure B (ver en capítulo II.D).

En cuanto al aceite de girasol, éste no tuvo el efecto positivo esperado sobre el crecimiento de la biomasa de micelio de G. gargal, como sí había sido en el caso con G. frondosa durante su cultivo sumergido (Hsieh et al., 2006; Hsieh et al., 2008). Posiblemente el nivel basal de ácidos grasos no saturados residuales presentes en la cáscara de girasol ya estaban en un nivel de suficiencia en relación

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a un posible efecto estimulante. Cabe mencionar aquí que el contenido de materia grasa de la cáscara de girasol es de 3,5 %, con un contenido de c.a. 1,4 % en ácidos grasos insaturados (National Sunflower Association, 2011).

Finalmente, en el caso del amonio, la respuesta inhibitoria en la densidad aparente de crecimiento encontrada podría atribuirse al hecho de que G. gargal pertenece al grupo de hongos que son intolerantes al amonio (Yamanaka, 1995; Soponsathien, 1998), mientras que en G. sordulenta la respuesta global de crecimiento micelial no se diferenció de la obtenida con el sustrato basal (ver sección 3.2 siguiente).

Figura 65. Imágenes representativas de cultivos de Grifola gargal a los 35 días de colonización. Las formulaciones de sustrato basal (G1), fueron suplementadas con diferentes compuestos para mejorar la velocidad de colonización: SO4H2 0,01N (G2), NH4

+

200 ppm (G3), Mn(II)20 ppm (G4), Cu(II) 100 ppm (G5), Zn(II) 100 ppm (G6), virutas de roble 20% (G7), virutas de álamo 20% (G8), paja de trigo 20% (G9) o aceite de girasol 5% (G10).