1. Introducción
El cultivo de los hongos requiere poseer un profundo conocimiento del ambiente ecofisiológico, i.e. del hábitat natural que ocupan. Ello luego permite el ajuste de la fórmula del sustrato y de los parámetros ambientales para obtener un cultivo artificial optimizado y en otras palabras lograr la domesticación de la especie. De esta manera, los ensayos in vitro realizados con G. gargal y G. sordulenta durante el transcurso del trabajo de esta tesis fueron importantes para conocer las condiciones de crecimiento del micelio y las características morfogénicas que acompañaron al proceso de fructificación.
En este punto y previo al desarrollo del tema central de esta sección, resulta conveniente argumentar algo más detenidamente los aspectos anteriores, en función de la experiencia propia de campo y de los estudios presentados en las secciones previas.
En primer lugar, las especies de G. gargal y G. sordulenta bajo estudio son capaces de degradar lignina, compuestos aromáticos y carbohidratos como celulosa, xilulosa, almidón y pectina (capítulo II.D.). Se observó in situ donde ellas crecen que se desarrollan en un solo hospedante mientras que en condiciones de cultivo in vitro pudieron crecer en sustratos alternativos como granos de cereales y cáscara de girasol (capítulo IV y secciones previas de este capítulo). Asimismo, fue posible demostrar que las cepas que se disponían para este estudio producen particulares respuestas morfogénicas al frío, a la insuficiencia de nutrientes y a la luz (capítulo II.).
Es importante también destacar que el cultivo en estado sólido de estas especies permitiría preservar a los bosques nativos al suplantar la recolección artesanal y evitar así impactos negativos que llevarían eventualmente a un desequilibrio ecológico. Vale recordar ahora que estos hongos son recolectados en los bosques andinos chilenos y son vendidos en mercados de productos autóctonos (Valdebenito et al., 2003).
Dicho lo anterior, resulta entonces apropiado el cultivo de estas especies no sólo por su hipotético valor medicinal sino además para la preservación ambiental. Como es conocido en tantos otros casos de hongos medicinales, aquí también el ajuste de las variables y de las condiciones necesarias para la corrida del micelio de estas especies en sustratos sintéticos y la subsiguiente fructificación permitirán su cultivo industrial, incluso favoreciendo la difusión de la tecnología de cultivo resultante para estas especies hacia otros lugares. Potencialmente, el sustrato gastado puede ser empleado para otros usos (Rinker, 2002).
Asimismo, no hay que dejar de señalar la escasez de cepas disponibles para el estudio que se propuso llevar adelante con estas especies, y que principalmente se enfocó hasta aquí en la comparación de sus características de cultivo, velocidad de colonización y actividad enzimática.
Por último, una limitación no menor y por ello importante de superar es su lento crecimiento, observado especialmente en sustratos lignocelulósicos, lo cual abre una ventana de oportunidad a
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microorganismos competidores, cuando no se dispone de facilidades de infraestructura para asegurar su cultivo axénico. Ello plantea la necesidad de una mayor inversión en la instalación de tales facilidades, que en todo caso a posteriori y dependiendo de la utilidad sería justificable si su explotación resultase igualmente rentable.
Habiendo expuesto estas consideraciones generales, también es de utilidad citar el cultivo de otra especie del género, G. frondosa, que se ha podido realizar en distintos sistemas (Mayuzumi y Mizuno, 1997), incluyendo el que es de interés abordar en el presente estudio, i.e. el cultivo en “troncos sintéticos” con sustratos empaquetados en bolsas de polietileno (Shen, 2001) pero ahora usando a la cáscara de girasol como principal componente del sustrato para este sistema de cultivo. Otros sistemas de cultivo menos empleados en esta especie son el cultivo al aire libre (en camas o en troncos) y el cultivo industrial en botellas; los primeros tienen un ciclo largo de cultivo y los segundos producen fructificaciones demasiado pequeñas (Mayuxumi y Mizuno, 1997).
En los ensayos previos de TCL se determinó que si bien G. gargal y G. sordulenta también crecen en este tipo de sustrato, lo hacen más lentamente en comparación al resto de otras especies cultivadas anteriormente sobre sustrato conteniendo cáscara de girasol (Curvetto et al., 2002a, 2002b; González- Matute et al., 2002; 2010; Figlas et al., 2007).
En cuanto a los estadios de crecimiento y desarrollo reproductivo de G. gargal y G. sordulenta, es esperable, por su relación filogenética con G. frondosa, que muestren una similitud con esta especie, lo cual puede ser una orientación para la estrategia de manejo del cultivo. En la Tabla 35 se muestra una síntesis de tres protocolos para el cultivo de G. frondosa (Stamets, 1993; Huang, 1997; Montoya- Barreto et al., 2008).
A continuación sigue una breve descripción acerca de las fases del cultivo y las operaciones que permiten conducirlo. La etapa inicial corresponde a la corrida del micelio que es el período en que el micelio presente en los granos de spawn coloniza el sustrato. Luego que el micelio cubre completamente la superficie externa del tronco sintético, el micelio madura y comienzan a generarse exudados, indicando que el mismo cambia su metabolismo al de crecimiento secundario con la típica presencia de compuestos del metabolismo secundario en estos exudados. Luego sigue la aplicación de un choque térmico, mediante una disminución significativa de la temperatura, el cual incrementa la formación de exudados y luego induce la formación de primordios. Para completar la fase de fructificación, los primordios formados deben exponerse a una mayor disponibilidad de oxígeno con remoción del CO2, lo cual se logra con una ventilación adecuada, manteniendo condiciones de alta
humedad. Durante su desarrollo, las fructificaciones poseen diferentes formas de diferenciación que según su apariencia se han denominado como cerebro, coliflor y racimo (Stott y Mohamed, 2004).
1.1. Hipótesis
Grifola gargal y G. sordulenta pueden alcanzar la etapa de generación de primordios y eventualmente desarrollar fructificaciones maduras cuando son cultivadas en troncos sintéticos conteniendo sustratos basados en cáscara de semilla de girasol en condiciones que se asemejarían a las
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del cultivo de G. frondosa y una aproximación de las condiciones ambientales normales en el hábitat de fructificación.
1.2. Objetivos
En esta sección se presenta un estudio preliminar con cinco ensayos de fermentación en estado sólido para el cultivo de G. gargal y G. sordulenta en la modalidad de tronco sintético con sustratos elaborados a base de cáscara de girasol.
Tabla 35.Parámetros ambientales y operativos del cultivo de Grifola frondosa según otros autores. A: Stamets, 1993; B: Huang, 1997; y C: de Montoya- Barreto et al., 2008. La ventilación se expresa como el número de volúmenes del aire del ambiente renovado por día.
A Corrida de micelio Inducción de
primordios Fructificación (inicio) Fructificación (desarrollo) Temp. (ºC) 21/ 24 10/ 15,6 10/ 16 13/ 18 HR (%) 95/ 100 95 95 85/ 90
Duración (días) 14/ 30 30 (maduración)
5/10(crecimiento) 10/14 14/ 21 CO2 (ppm) 20.000/ 40.000 2.000/ 5.000 2.000/ 5.000 < 1.000 Ventilación <1 4/8 4/8 4/8 Luz (lux) - 100/ 500 100/ 500 500/ 1.000
B Corrida de micelio Inducción de
primordios Fructificación (inicio + desarrollo) Temp. (ºC) 22/ 23 22/ 23 16/ 18 HR (%) 70 70 85/ 95 Duración (días) 40 7 20/ 25
CO2 (ppm) Tolera alta concentración
3.000 (bolsas separadas) 1.000/ 1.500 Luz (lux) - 50 200/ 500 C Corrida de micelio Formación de exudados Inducción de primordios Fructificación (inicio) Fructificación (desarrollo) Temp. (ºC) 25 (7 días) 20/ 21(resto) 18/ 20 10 16/ 18 16/ 18 HR (%) 60/ 65 60/ 65 60/ 65 70/ 80 70/ 80 Duración (días) 30/ 35 40/ 45 1 7/ 10 3/ 5 Ventilación - - - 2 12 Luz (lux) - - - 50/ 100 50/ 100