CUERPO CALLOSO

2.2.- Efecto del tratamiento subcutáneo con GH sobre la remielinización del cerebro de ratas viejas

Una vez comprobado el efecto remielinizante de la administración i.c.v. de GH estudiamos la efectividad de GH administrada periféricamente como un tratamiento alternativo más próximo a una posible aplicación terapéutica. Con este objetivo, ratas de 29 meses de edad se trataron con GH s.c. (150 µg / 2 veces día) durante 7 días y se analizó la expresión de MBP por Western inmunoblot. La MBP es una proteína constituida por varias especies moleculares de distinto peso molecular cuyo patrón de expresión varía con la edad (Sugiyama et al., 2002). El análisis por Western inmunoblot permite, por tanto, analizar posibles cambios en las distintas especies moleculares de MBP.

Como se observa en la Figura 14, nuestros resultados muestran que en las ratas viejas existe una clara disminución de los niveles de la isoforma de 21 kDa, tanto en la corteza cerebral anterior como en el hipocampo, lo que resulta en una menor expresión de MBP inmunorreactiva total, como hemos expuesto en los resultados obtenidos mediante inmunohistoquímica. Además, se observan distintas bandas de bajo peso molecular que corresponden con formas degradadas de MBP cuya abundancia también varía con el envejecimiento. El tratamiento con GH s.c. durante 7 días no modificó los niveles de la banda de 21 kDa ni en la corteza cerebral anterior ni en el hipocampo. Estos resultados contrastan con los obtenidos mediante inmunohistoquímica donde observamos que la GH administrada por vía i.c.v. indujo un incremento en la expresión de MBP en el cerebro de las ratas viejas.

Figura 14. Efecto del tratamiento con GH s.c. sobre la expresión de MBP en diferentes áreas del cerebro.

Western inmunoblot frente a MBP de extractos proteicos de corteza cerebral anterior e hipocampo de ratas adultas jóvenes (3m) y ratas viejas (29m) controles y tratadas con GH s.c. (150 µg / 2 veces día / 7 días). Las gráficas representan la cuantificación densitométrica de la banda de 21 kDa de MBP corregida por ß-actina. Los resultados se expresan como la media ± EE y en porcentaje respecto al grupo de 3 meses. ***, p < 0,001; ns, no significativo.

CORTEZA CEREBRAL ANTERIOR

0 50 100 150 3 meses 29 meses C C GH *** ns β-actina 42 kDa MBP C C GH 3 meses 29 meses 21 kDa 14 kDa 3 meses 29 meses C C GH HIPOCAMPO 0 50 100 150 *** ns β-actina MBP 3 meses 29 meses C C GH 42 kDa 21 kDa 14 kDa

2.3.- Mediación del IGF-I en los efectos de GH sobre la remielinización del cerebro de ratas viejas

Diversas evidencias apoyan la posibilidad de que la GH ejerza acciones directas en el cerebro. Las acciones directas de GH en el SNC están avaladas por la presencia de su receptor en diversas áreas del cerebro, incluidas aquellas implicadas en la memoria y en la función cognitiva (Lobie et al., 1993; Nyberg, 2000), y por la evidencia de que la GH cruza la barrera hematoencefálica (Pan et al., 2005). Sin embargo, muchos de los efectos de GH están mediados por el IGF-I, factor con reconocidos efectos neuroprotectores (Fernandez et al., 1998, 1999; Carro et al., 2000, 2001). Por lo tanto, la GH puede actuar en cerebro directamente o a través de la inducción del IGF-I periférico o cerebral.

Con el objetivo de confirmar si la administración de GH s.c. ejercía o no una acción remielinizante en el cerebro de ratas viejas, seguimos el mismo diseño experimental que en el apartado anterior sólo que utilizando ratas más jóvenes (24 meses) y determinando la MBP por inmunohistoquímica, técnica más sensible que el Western inmunoblot. Además, con la finalidad de definir el papel del IGF-I en el efecto de GH sobre la remielinización del cerebro de ratas viejas, estudiamos la repercusión del bloqueo del R-IGF-I sobre la expresión de MBP en cerebro inducida por GH. Para ello en un grupo de ratas de 24 meses se bloqueó el R-IGF-I mediante la administración de JB-1 (10 ó 30 µg), antagonista del R-IGF-I, 30 minutos antes de la administración s.c. de GH (150 µg / 2 veces día) durante 7 días. Se analizó la expresión de MBP mediante inmunohistoquímica en diferentes áreas cerebrales.

Los resultados obtenidos se muestran en las fotografías correspondientes a las regiones de la comisura blanca anterior, del cuerpo calloso y del giro dentado del hipocampo de diferentes ratas de cada uno de los grupos experimentales (Figura 15). Se observa una marcada disminución en la expresión de MBP en la comisura blanca anterior, cuerpo calloso y en el giro dentado del hipocampo de las ratas viejas. El tratamiento con GH s.c. revirtió parcialmente los bajos niveles de expresión de MBP en el cerebro de las ratas viejas, cambio que no llegó a ser estadísticamente significativo. El bloqueo del R-IGF-I abolió la expresión de MBP inducida por GH en todas las áreas cerebrales estudiadas.

En las condiciones experimentales de este estudio se aprecia la tendencia de la acción remielinizante tras GH s.c. en el cerebro de las ratas viejas. Además, se confirma la mediación del IGF-I en el efecto remielinizante de GH.

Figura 15. Efecto del tratamiento con GH y JB-1 sobre la expresión de MBP cerebral. Inmunohistoquímica frente a MBP en secciones de tejido cerebral de ratas adultas jóvenes (3m), ratas viejas (24m) control y ratas viejas tratadas con JB-1 (10 y 30 µg) previo a la administración de GH s.c. (150 µg/ 2 veces día/ 7 días). Las fotografías corresponden a las regiones de la comisura blanca anterior, cuerpo calloso y giro dentado del hipocampo. El diagrama representa la cuantificación densitométrica de la intensidad de la inmunotinción correspondiente a la comisura blanca anterior. Los resultados se expresan como media ± EE. **, p < 0,01; ns, no significativo.

CONTROL CONTROL GH GH+ JB-1(10µµµµg) GH +JB-1(30µµµµg) 3 meses 24 meses

CUERPO CALLOSO

3 meses 24 meses

CONTROL CONTROL GH GH+ JB-1 (10 µµµµg) GH +JB-1(30µµµµg)

COMISURA BLANCA ANTERIOR

CONTROL CONTROL GH GH+ JB-1 (10µµµµg) GH +JB-1(30µµµµg) 3 meses 24 meses

GIRO DENTADO DEL HIPOCAMPO

3 meses 24 meses C C GH GH GH + + JB1(10) JB1(30)

A

**

**

**

2.4.- Efecto de GH sobre la activación de CREB en el cerebro de ratas viejas

La GH es una de las señales extracelulares implicadas en la regulación de la transcripción mediada por CREB (Cui et al., 2008). En los resultados expuestos en un apartado anterior demostramos que la GH activa CREB en cultivos de células cerebrocorticales. El descenso de GH en el envejecimiento podría contribuir a la disminuida activación de CREB observada en el SNC de roedores (Foster et al., 2001; Hattiangady et al., 2005; Williams et al., 2008). Estos antecedentes nos llevaron a evaluar el papel de GH en la activación de CREB en el cerebro de la rata vieja.

Con este objetivo un grupo de ratas de 29 meses se trataron con GH s.c. (150 µg / 2 veces al día) durante 7 días. Se determinó la activación de CREB por Western

inmunoblot en la corteza cerebral anterior e hipocampo.

Como se muestra en la Figura 16, existe una pronunciada disminución de la activación de CREB en la corteza cerebral anterior e hipocampo de las ratas viejas. La administración de GH s.c. a ratas viejas no modificó la activación de CREB ni en la corteza cerebral anterior ni en el hipocampo.

Estos resultados indican que, en nuestras condiciones experimentales, la GH no activa la fosforilación de CREB en el cerebro de la rata envejecida.

Figura 16. Efecto de GH sobre la activación de CREB. Inmunoblots frente a CREB de extractos proteicos de corteza cerebral anterior e hipocampo de ratas adultas jóvenes (3m) y ratas viejas (29m) controles y tratadas con GH s.c. (150 µg / 2 veces día / 7 días). Se muestran las autorradiografías de Western inmunoblots representativos realizados con un anticuerpo específico frente a la forma fosforilada, CREB-P (paneles superiores). Las mismas membranas se incubaron con un anticuerpo que reconoce tanto la forma fosforilada como no fosforilada, CREB-T (paneles inferiores). Las gráficas representan la cuantificación densitométrica de CREB-P corregida por la forma no fosforilada de CREB-T. Los resultados se expresan como la media ± EE y en porcentaje respecto al grupo de 3 meses. *, p < 0,05; ns, no significativo. 0 50 100 150 3 meses 29 meses C C GH * ns

CORTEZA CEREBRAL ANTERIOR

C C GH 3 meses 29 meses CREB-P CREB-T 43 KDa 43 KDa 0 50 100 150 3 meses 29 meses C C GH * HIPOCAMPO C C GH 3 meses 29 meses CREB-P CREB-T 43 KDa 43 KDa ns

C.- ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE GHRP-6 SOBRE EL PROCESO

DE MIELINOGÉNESIS

1.- EFECTO DE GHRP-6 SOBRE LA DIFERENCIACIÓN DE OD EN CÉLULAS