2.1 ESTUDIO DE LA ACCIÓN DE VIP SOBRE EL PROCESO DE OLIGODENDROGÉNESIS DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO

2.1.1.- Efecto de VIP sobre el número de precursores de OD y de OD maduros VIP es un importante factor regulador del crecimiento embrionario (Gressens et al., 1993, 1994, 1998; Hill et al., 1994, 1996, 1999; Glazner et al., 1999; Spong et al., 1999; Servoss et al., 2001). En cultivos de embriones enteros de ratón del día E9.5 el tratamiento con VIP produce un crecimiento dosis-dependiente (Gressens et al., 1993; Glazner et al., 1999; Hill et al., 1999) junto con un aumento de la división celular (Gressens et al., 1998). El tratamiento con VIP aumenta el número de cuerpos celulares y el contenido de ADN y proteína (Gressens et al., 1993; Glazner et al., 1999; Hill et al., 1999), manteniendo constantes las proporciones morfológicas de los embriones. El bloqueo de la acción de VIP mediante el tratamiento de ratones preñados con un agonista de VIP (Gozes et al., 1989, 1991) entre los días E9-E11 resulta en una inhibición significativa del crecimiento embrionario (Gressens et al., 1994), al igual que ocurre al tratar los cultivos de embriones enteros del día E9.5 con un anticuerpo anti VIP (Glazner et al., 1999), demostrando que VIP es necesario para mantener la tasa de crecimiento normal. A pesar de todas las evidencias sobre las acciones tróficas de VIP en el desarrollo embrionario, son escasos los estudios sobre el papel de VIP en la mielinización del cerebro en desarrollo.

En nuestro modelo experimental de cultivo primario mixto, el análisis inmunocitoquímico muestra que VIP es capaz de aumentar el número de OD. Este efecto fue evidente en OD inmaduros (O4+) y en OD maduros (MBP+) siendo más marcado en los OD maduros. Como sucede con otras acciones de VIP el efecto fue más evidente con las dosis más bajas ensayadas (Lorenzo et al., 1989).

Estos resultados son la primera evidencia de que VIP estimula la proliferación de los precursores de OD y promueve su diferenciación a OD maduros y que, por tanto, VIP actúa como un factor mediador de la transición de OD O4 (+) a OD maduros. Además sugieren la implicación de VIP en el proceso de mielinización y consecuentemente en la maduración cerebral durante el desarrollo embrionario.

2.1.2.- Efecto de los inhibidores LY, PD y H89 en la inducción de MBP y/o O4 por VIP

Demostrada la capacidad de VIP de activar las vías de señalización de PKA, MAPK y PI3K en células cerebrocorticales (datos no mostrados) estudiamos, mediante la estrategia del bloqueo con inhibidores específicos, la participación de estas vías en el proceso de oligodendrogénesis y en el efecto de VIP sobre el mismo.

Nuestros resultados indican que las vía PI3K, MAPK y PKA, participan en la oligodendrogénesis inducida por VIP. El bloqueo de cada una de ellas conduce a una disminución en el número de OD maduros que se desarrollan en respuesta a VIP y en consecuencia a una disminución en la expresión de MBP inducida por VIP cuando se analiza por inmunocitoquímica. Además, la vía de la PKA participa en la proliferación de OD inmaduros inducida por VIP, como sugiere el hecho de su bloqueo conduce a una disminución en la expresión de O4 inducida por VIP.

Al igual que en experimentos previos observamos una disminución de la expresión basal de MBP en los cultivos tratados solo con los inhibidores LY294002, PD098059 y H89, sugiriendo, como hemos comentado anteriormente, la participación de las vías PI3K, de MAPK y PKA en la diferenciación de los OD.

2.1.3.- Efecto de VIP sobre la activación de CREB

Estudios previos realizados en diversos tipos celulares (Hokari et al., 2005; Persson et al., 2005; Guan et al., 2009), incluidas células hipofisarias en cultivo en nuestro laboratorio (Fernández et al., 2005), han demostrado que VIP es un factor estimulador de la fosforilación de CREB. Nuestros resultados confirman en un cultivo de células cerebrocorticales que VIP induce la activación de CREB.

Estudios previos han evidenciado que las vías de señalización PKA (Fernández et al., 2005; Persson et al., 2005; Guan et al., 2009) y MAPK (Fernández et al., 2005; Guan et al., 2009) están implicadas en la activación de CREB por VIP. En este trabajo hemos demostrado que ambas vías de señalización participan en las acciones de VIP en el proceso de oligodendrogénesis por lo que es posible que estás vías estén involucradas en la fosforilación de CREB en respuesta a VIP.

2.2.- ESTUDIO DEL EFECTO DE VIP SOBRE LA REMIELINIZACIÓN DEL CEREBRO EN EL ENVEJECIMIENTO

2.2.1.- Efecto del tratamiento con VIP subcutáneo sobre la remielinización del cerebro de ratas viejas

Durante la última década varios estudios han sugerido que VIP pueda estar implicado en la etiopatogenia de enfermedades que cursan con alteraciones de la mielina como la esclerosis múltiple (Fernandez-Martin et al., 2006; Sun et al., 2006) o la encefalitis experimental

autoinmune en ratones (Gonzalez-Rey, Fernandez-Martin, et al., 2006). Estos antecedentes junto con el estímulo por VIP del proceso de oligodendrogénesis in vitro que habíamos

observado nos llevó a estudiar el efecto del tratamiento con VIP in vivo sobre la

hipomielinización del cerebro de ratas viejas.

Nuestros resultados demuestran, por primera vez, que VIP estimula la remielinización del cerebro de la rata vieja. Este efecto se evidencia en la corteza cerebral anterior pero no en el hipocampo sugiriendo una acción área-específica. Estos hallazgos confirman las acciones neuroprotectoras de VIP sobre la sustancia blanca que han sido descritas previamente en modelos de seccionamiento del nervio ciático (Rayan et al., 1991, 1995; Zhang et al., 2002), en modelos de leucomalacia periventricular en ratón (Gressens et al., 1997, 1998, 1999) y en un modelo de lesión excitotóxica neonatal (Husson et al., 2005). Como hemos demostrado, la GH induce la expresión de VIP en el cerebro de las ratas viejas, lo que sugiere que VIP actúe como uno de los mediadores de GH en su acción remielinizante. 2.2.2.- Papel de BDNF en la remielinización inducida por VIP en el cerebro de ratas viejas

Una vez demostrada la capacidad de VIP de estimular la remielinización in vivo en el

cerebro de las ratas viejas, nos planteamos dilucidar los mecanismos implicados en las acciones de VIP sobre la mielina.

Además de sus acciones directas, se ha demostrado que VIP ejerce acciones indirectas mediadas por la liberación por las células gliales de factores como el ADNF y el ADNP (Gozes et al., 2003), la IL-1α (Brenneman et al., 2003) y la proteasa nexina 1 (Festoff et al., 1996) o potenciando la acción de neurotransmisores (Magistretti, 1986). Uno de los factores a considerar como mediador de las acciones de VIP es el BDNF cuya expresión es inducida por VIP (Pellegri et al., 1998). Este hecho junto con las conocidas acciones de BDNF en la mielinización, nos llevó a plantear si BDNF podría ser un mediador de las acciones remielinizantes de VIP. Los resultados evidencian que el bloqueo de ambos receptores de BDNF resulta en una disminución de la expresión de MBP en respuesta al tratamiento con VIP. Nuestros datos demuestran la implicación de BDNF en la acción remielinizante del VIP en la corteza cerebral anterior de las ratas viejas confirmando estudios previos que demuestran que BDNF media las acciones neuroprotectoras de VIP sobre la sustancia blanca (Husson et al., 2005). Al analizar si el efecto de VIP sobre la remielinización podría deberse a un incremento de BDNF tras la administración de VIP, observamos que VIP no modificaba la disminuida expresión de BDNF en corteza cerebral anterior ni en el hipocampo. Estas evidencias sugieren que BDNF facilita, por mecanismos aún no conocidos, la acción remielinizante de VIP.

El hecho de que el efecto inhibidor de las acciones de VIP se pone de manifiesto al bloquear tanto el receptor TrkB como el P75NTR_{, indica la participación de ambos receptores en}

el efecto mielinizante de BDNF, como se había observado en estudios previos (Taniuchi et al., 1988; Gai et al., 1996; Du, Fischer, et al., 2006; Du, Lercher, et al., 2006; Van’t Veer et al., 2009).

2.2.3.- Papel del IGF-I en la remielinización inducida por VIP en el cerebro de ratas