3 EFECTO DE GHRP-6 SOBRE LA ACTIVACIÓN DE CREB EN EL CEREBRO DE RATAS VIEJAS

El papel de los GHS en la activación de CREB ha sido poco explorado. Estudios recientes donde se evidencia que tanto la ghrelina (Ma et al., 2011) como GHRP-6 (Tian et al., 2010) activan CREB, sugieren un papel de los GHS en la transcripción mediada por CREB. Estos antecedentes nos llevaron a estudiar si GHRP-6 podría activar la fosforilación de CREB en el cerebro de la rata vieja.

Con este objetivo, un grupo de ratas de 29 meses se trataron con GHRP-6 s.c. (20 µg/Kg / 2 veces día) durante 15 días. Finalizado el tratamiento se determinó la activación de CREB por Western inmunoblot en la corteza cerebral anterior e hipocampo.

Como se observa en la Figura 21, la administración de GHRP-6 a ratas viejas no modificó la disminuida activación de CREB ni en la corteza cerebral anterior ni en el hipocampo.

Estos resultados indican que en nuestras condiciones experimentales GHRP-6 no activa la fosforilación de CREB en el cerebro de la rata vieja.

Figura 21. Efecto de GHRP-6 sobre la activación del factor de transcripción CREB en el cerebro. Inmunoblot frente a CREB de extractos proteicos de la corteza cerebral anterior e hipocampo de ratas adultas jóvenes (3m) y ratas viejas (29m) controles y tratadas con GHRP-6 s.c. (20 µg/Kg/ 2 veces día / 15 días). Se muestran las autorradiografías de Western inmunoblots representativos realizados con un anticuerpo específico frente a la forma fosforilada, CREB-P (paneles superiores). Las mismas membranas se incubaron con un anticuerpo que reconoce tanto la forma fosforilada como no fosforilada, CREB-T (paneles inferiores). Las gráficas representan la cuantificación densitométrica de CREB-P corregida por la forma no fosforilada de CREB-T. Los resultados se expresan como la media ± EE y en porcentaje respecto al grupo de 3 meses. *, p < 0,05; ns, no significativo.

0 50 100 150

CORTEZA CEREBRAL ANTERIOR

* 3 meses 29 meses C C GHRP-6 ns CREB-P CREB-T 43 KDa 43 KDa 3 meses 29 meses C C GHRP-6 0 50 100 150 HIPOCAMPO 3 meses 29 meses C C GHRP-6 * 3 meses 29 meses C C GHRP-6 CREB-P CREB-T 43 KDa 43 KDa ns

D.- ALTERACIONES DE BDNF RELACIONADAS CON EL

ENVEJECIMIENTO

1.- Expresión del ARNm de BDNF en el cerebro de ratas viejas: efecto del tratamiento con GH o GHRP-6

Numerosos estudios han implicado a BDNF en los procesos que regulan la mielinización tanto en el SNC como en el SNP (McTigue et al., 1998; Chan et al., 2001; Cosgaya et al., 2002; Hempstead y Salzer, 2002; Notterpek, 2003; Tolwani et al., 2004). El efecto del envejecimiento en la expresión del ARNm de BDNF y de su proteína en cerebro es controvertido. En función de la especie, el área estudiada y la técnica de cuantificación utilizada se han descrito aumentos (Katoh-Semba et al., 1998), disminuciones (Narisawa-Saito y Nawa, 1996; Hayashi et al., 1997; Croll et al., 1998; Murer et al., 2001; Hattiangady et al., 2005; Silhol et al., 2005) o no alteraciones (Croll et al., 1998; Katoh-Semba et al., 1998; Webster et al., 2002; Bimonte et al., 2003) de su expresión.

Estudios previos indican la existencia de una interrelación entre BDNF y el sistema GH/IGF-I. Se ha observado que la infusión periférica de IGF-I produce un aumento cualitativo en la inmunotinción de BDNF en el hipocampo (Carro et al., 2001), e incluso revierte parcialmente la disminución de BDNF debida a una lesión (Kazanis et al., 2004). El tratamiento con ghrelina induce la expresión de BDNF en el hipocampo (Ma et al., 2011). Estos antecedentes nos indujeron a analizar la expresión de BDNF en el cerebro de ratas viejas y su posible modulación por GH o GHRP-6.

Con este objetivo un grupo de ratas de 29 meses se trataron con GH s.c. (150 µg / 2 veces día) durante 7 días o con GHRP-6 s.c. (20 µg/Kg / 2 veces día) durante 15

días. Se analizó la expresión del ARNm de BDNF por PCR a tiempo real en la corteza cerebral anterior e hipocampo.

Como se observa en la Figura 22 tanto en la corteza cerebral anterior como en el hipocampo los niveles del ARNm de BDNF en ratas viejas fueron significativamente menores que en las ratas adultas jóvenes. El tratamiento con GH incrementó la expresión del ARNm de BDNF en la corteza cerebral anterior, mientras que GHRP-6 la disminuyó. No se observó ningún efecto sobre la expresión del ARNm de BDNF en el hipocampo tras el tratamiento con GH o GHRP-6.

Figura 22. Expresión del ARNm de BDNF en el cerebro. Cuantificación de los niveles del ARNm de BDNF en la corteza cerebral anterior e hipocampo mediante PCR a tiempo real en ratas adultas jóvenes (3m) y viejas (29m) controles y tratadas con GH s.c. (150 µg / 2 veces día / 7 días) o GHRP-6 s.c (20 µg/Kg / 2 veces día / 15 días). Los resultados se expresan como la media ± EE y en porcentaje respecto al grupo de 3 meses. *, p < 0,05; **, p < 0,01; ns, no significativo.

2.- Expresión del ARNm de BDNF en la hipófisis de ratas viejas: efecto del tratamiento con GH o GHRP-6

Aunque la presencia de BDNF y de su receptor TrkB en la hipófisis se evidenció hace más de una década (Kononen et al., 1995; Conner et al., 1996; Höpker et al., 1997) su función no está claramente definida. Se ha sugerido que el BDNF de la hipófisis anterior está involucrado en el control de la función tiroidea (Rage et al., 2007) así como en la regulación del eje hipofisio-adrenal (Kononen et al., 1995). No existe consenso sobre las alteraciones en la expresión del ARNm de BDNF y de su proteína en la hipófisis durante el envejecimiento.

En este estudio hemos investigado los cambios en la expresión del ARNm de BDNF hipofisario relacionados con el envejecimiento y su posible regulación por manipulaciones del eje somatotropo. Para ello hemos utilizado el diseño experimental expuesto en el anterior apartado. 0 50 100 150 0 50 100 150 3 meses 29 meses C C GH 3 meses 29 meses C C GHRP-6

**

**

*

**

CORTEZA CEREBRAL ANTERIOR

0 50 100 150 0 50 100 150 3 meses 29 meses C C GH 3 meses 29 meses C C GHRP-6

**

**

En la Figura 23 se muestran los niveles del ARNm de BDNF en la hipófisis en el envejecimiento y el efecto del tratamiento con GH o GHRP-6. De acuerdo con algunos estudios previos (Rage et al., 2007) observamos un aumento de la expresión del ARNm de BDNF en la hipófisis de ratas viejas que disminuyó tras el tratamiento con GH pero no con GHRP-6.

Figura 23. Expresión del ARNm de BDNF en la hipófisis. Cuantificación de los niveles del ARNm de BDNF mediante PCR a tiempo real en ratas adultas jóvenes (3m) y viejas (29m) controles y tratadas con GH s.c. (150 µg / 2 veces día / 7 días) o GHRP-6 s.c. (20 µg/Kg / 2 veces día / 15 días). Los resultados se expresan como la media ± EE y en porcentaje respecto al grupo de 3 meses. ***, p < 0,001; ns, no significativo.

Estos resultados indican que el envejecimiento induce cambios en la expresión del ARNm de BDNF que son específicos de tejido, aumentando en la hipófisis y disminuyendo en las áreas cerebrales estudiadas.

El tratamiento con GH, pero no con GHRP-6, revierte los cambios en la expresión del ARNm de BDNF en la corteza cerebral anterior e hipófisis, lo que sugiere una relación entre GH y BDNF en ambos órganos, y evidencia que la GH regula la expresión de BDNF en el envejecimiento 0 100 200 300 400 500 0 100 200 300 400 3 meses 29 meses C C GH 3 meses 29 meses C C GHRP-6 ns

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E.- ALTERACIONES INFLAMATORIAS EN EL CEREBRO

RELACIONADAS CON EL ENVEJECIMIENTO

1.- EXPRESIÓN DE CITOQUINAS EN EL CEREBRO DE RATAS VIEJAS: EFECTO