1 EFECTO DE GH SOBRE LA OLIGODENDROGÉNESIS EN CÉLULAS CEREBROCORTICALES EMBRIONARIAS

1.1.- Efecto de GH sobre el número de precursores de OD y de OD maduros

El papel de GH sobre el proceso de mielinización in vitro apenas ha sido explorado. En

estudios aislados se ha observado que la GH es capaz de estimular la diferenciación de OD en agregados celulares cerebrales (Almazan et al., 1985).

En este estudio nos planteamos confirmar el efecto de GH en el proceso de oligodendrogénesis durante el periodo perinatal e investigar las vías de señalización intracelulares implicadas utilizando cultivos de células cerebrocorticales embrionarias. El estudio de la acción de GH sobre los pre-OD se efectuó mediante inmunocitoquímica frente al antígeno lipídico O4 que es un marcador de OD inmaduros. El efecto de la GH sobre el número de OD maduros se investigó mediante inmunocitoquímica frente a MBP.

En la Figura 8 se muestran los resultados del tratamiento con GH sobre los precursores de OD y OD maduros. La GH indujo un incremento tanto en el número de las células O4 (+) como de células MBP (+), lo que indica que, en las condiciones descritas, la GH es capaz de incrementar tanto la proliferación de OD inmaduros (expresión de O4) como la progresión de los mismos a OD maduros que expresan MBP.

Figura 8. Efecto de GH en el número de células inmunoreactivas a O4 y MBP. Después de 7 u 8 DIV, para los experimentos de O4 o MBP respectivamente, las células cerebrocorticales fueron incubadas con GH (50 ng) durante 4 días. Transcurridos estos tiempos la expresión de O4 y MBP se determinó mediante inmunocitoquímica. Los resultados se expresan como la media ± EE de 3 experimentos independientes. ***, p < 0,001.

0 50 100 150

***

***

O4

MBP

Estos resultados sugieren que la GH es un importante factor de la diferenciación de los OD en células cerebrocorticales embrionarias confirmándose la implicación de GH en el proceso de mielinización y consecuentemente en el proceso de maduración cerebral durante el desarrollo embrionario.

1.2.- Activación de MAPK y Akt: estudio tiempo-respuesta

Una vez demostrada la efectividad de GH en el proceso de oligodendrogénesis in vitro,

nuestro objetivo fue estudiar la implicación de las vías MAPK y PI3K en el efecto de la GH en dicho proceso.

Se llevó a cabo un estudio tiempo-respuesta para valorar la capacidad de GH de activar la vía MAPK en nuestro sistema. El estudio de la activación de la vía MAPK (ERK1/2) se realizó mediante Western inmunoblot donde se determinaron las variaciones en la concentración de las formas fosforiladas y no fosforiladas de las isoenzimas ERK1 y ERK2 en respuesta al tratamiento con GH.

El tratamiento con GH produjo una rápida estimulación de la fosforilación de ERK1/2 que alcanzó un pico máximo de activación entre los 5 y 10 minutos regresando a los niveles basales a los 30 minutos. Los niveles de ERK1/2 total no se modificaron. (Figura 9)

Figura 9. Curva tiempo-respuesta de la activación de la vía MAPK (ERK1/2) por GH. Después de 8 DIV, las células cerebrocorticales fueron incubadas con GH (50 ng) durante 5, 10, 30 y 60 minutos. Autorradiografía representativa de un Western inmunoblot, donde se empleó un anticuerpo monoclonal que reconoce las formas fosforiladas de MAPK (ERK1/2) (panel superior). En el panel inferior se representan los controles de carga obtenidos mediante el empleo de un anticuerpo policlonal que reconoce las formas fosforiladas y no fosforiladas de ambas proteínas.

Como reflejo de la activación de la vía PI3K se determinó la variación en las formas fosforiladas y no fosforiladas de Akt en respuesta a GH. (Figura 10). El tratamiento con GH resultó en un incremento de Akt fosforilado que fue evidente a los 5 minutos y máximo a los 30, manteniéndose los niveles elevados hasta los 60 minutos. Los niveles de Akt totales no se modificaron durante este tiempo.

-

+ + + +

0 5 10 30 60

minutos

GH

Figura 10. Curva tiempo-respuesta de la activación de la vía PI3K/Akt por GH. Después de 8 DIV, las células cerebrocorticales fueron incubadas con GH (50 ng) durante 5, 10, 30 y 60 minutos. Autorradiografía representativa de un Western inmunoblot, donde se empleó un anticuerpo monoclonal que reconoce la forma fosforilada de Akt (panel superior). En el panel inferior se representan los controles de carga obtenidos mediante el empleo de un anticuerpo policlonal que reconoce la forma fosforilada y no fosforilada de la proteína.

Estos resultados confirman la capacidad de GH de activar las vías de señalización MAPK (ERK1/2) y PI3K en células cerebrocorticales de embriones de rata.

1.3.- Efecto de los inhibidores PD y LY en la inducción de O4 y MBP por GH

Demostrada la capacidad de GH de activar las vías de señalización de las MAPK y de la PI3K estudiamos la participación de cada una de estas vías de señalización en el proceso de oligodendrogénesis y en el efecto de GH sobre el mismo.

Para ello, tras bloquear con inhibidores específicos cada una de las vías se estudió la expresión de O4 y MBP por inmunocitoquímica en células cerebrocorticales tratadas y sin tratar con GH. Para la inhibición de la vía de las MAPK se utilizó el inhibidor PD098059 (PD). La vía de señalización de la PI3K se bloqueó con el inhibidor LY294002 (LY). Finalmente procedimos al bloqueo simultáneo de ambas vías mediante la adición conjunta a los cultivos de ambos inhibidores.

En la Figura 11 se observa como el bloqueo de la vía de las MAPK con el inhibidor PD098059 (15µg) y de la vía PI3K con el inhibidor LY294002 (2.5 µg) disminuyó marcadamente el efecto estimulador de GH sobre el número de células O4 (+) y MBP (+). Tanto PD como LY disminuyeron el número de células O4 (+) y MBP (+) en ausencia de GH. La presencia simultánea de ambos inhibidores abolió por completo la inducción de células O4 (+) y de MBP (+) en respuesta a GH.

Estos resultados indican que la activación de las vías de señalización MAPK y PI3K está implicada en el proceso de oligodendrogénesis y en la inducción de dicho proceso por GH.

0 5 10 30 60

AKT-P

AKT-T

57 kDa

minutos

- + + + +

GH

Figura 11. Efecto del bloqueo de las vías MAPK (ERK1/2), con el inhibidor PD098059, y PI3K/Akt, con el inhibidor LY294002, sobre la inducción de O4 y MBP por GH. Las células cerebrocorticales se trataron con GH (50 ng) en presencia o ausencia de PD098059 (15 µM), LY294002 (2,5 µM) o ambos simultáneamente. El número de células positivas a O4 y MBP se analizó por inmunocitoquímica.

1.4.- Efecto de GH sobre la activación de CREB

El factor de transcripción CREB juega un importante papel en la diferenciación de los oligodendrocitos y en la síntesis de mielina (Sato-Bigbee et al., 1999). En estudios previos demostramos (Palacios et al., 2005) que CREB es necesario para la inducción de MBP por IGF-I. Estos datos nos llevaron a investigar el efecto del tratamiento con GH sobre la activación del factor de transcripción CREB en células cerebrocorticales embrionarias en cultivo. Puesto que la fosforilación de CREB en el residuo Ser133 se correlaciona con su actividad transcripcional, la capacidad de GH para activar este factor se evaluó mediante la determinación de la forma fosforilada de CREB.

Como se muestra en la Figura 12, el tratamiento con GH indujo la fosforilación de CREB, que fue evidente a los 5 minutos y se mantuvo hasta los 60 minutos después de la adición de GH. La concentración de CREB total no cambió en este tiempo indicando que GH induce la activación de la proteína y no su nivel de expresión.

PD

LY

PD-LY

PD

LY

PD-LY

PD

PD

LY

LY

PD-LY

PD-LY

O4

MBP

Figura 12. Activación del factor de transcripción CREB por GH: estudio tiempo-respuesta. Después de 8 DIV, las células cerebrocorticales se incubaron con GH (50 ng) durante 5, 10, 30 y 60 minutos. Se muestra la autorradiografía de un Western inmunoblot representativo realizado con un anticuerpo específico frente a la forma fosforilada de CREB (panel superior). La misma membrana se incubó con un anticuerpo que reconoce tanto la forma fosforilada como no fosforilada de CREB (panel inferior).

Estos resultados demuestran que la GH promueve la activación de CREB. Dado que CREB es necesario para la inducción de MBP por IGF-I, estos hallazgos sugieren la participación de CREB en el proceso de oligodendrogénesis inducido por GH.

2.- ESTUDIO DEL EFECTO DE GH SOBRE LA REMIELINIZACIÓN DEL CEREBRO