MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO MICROBIANO

El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de técnicas de siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos de un medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversos estudios morfológicos, de identificación, bioquímicos, de patogenicidad y ecológicos, entre otros. Existen diferentes técnicas de siembra: por suspensión de la muestra en medios líquidos; extensión de diluciones de un cultivo en superficie de medios en placa de Petri; por estría en placa de Petri y en tubos con medios solidificados en forma inclinada; por piquete o picadura en tubos con medios sólidos o semisólidos. Con la aplicación de cada técnica se obtiene información de importancia para el estudio básico o aplicado de los microorganismos de interés.

En la naturaleza, los microorganismos generalmente se encuentran en poblaciones, formando parte de comunidades de gran complejidad, por lo que uno de los objetivos de estudio más importantes en microbiología es aislarlos. El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos, mediante la técnica de estría cruzada para producir colonias aisladas en cultivos sólidos y así, obtener un cultivo puro o axénico, también conocido como cepa, que contiene un solo tipo de microorganismo con la misma composición genética. Cuando la técnica por estría se aplica para aislar un microorganismo de interés a partir de mezclas donde se encuentra en pequeñas cantidades, generalmente se obtendrán las bacterias dominantes. En este caso, se utilizan medios selectivos o de enriquecimiento, los que contienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura que incrementarán la población del microorganismo de interés y se facilitará su aislamiento.

Si se agregan a los medios de cultivo otros componentes como: sangre, colorantes, indicadores, es posible distinguir entre especies bacterianas por la forma en que metabolizan los sustratos y que se manifiesta por cambios en la apariencia del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como medios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterización e identificación de especies bacterianas.

II. COMPETENCIAS:

 Reconoce y diferencia a los medios de cultivo sólidos/líquidos; comunes/especiales.

III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales:

a. De Laboratorio (por mesa de trabajo)

 03 Placas con cada uno de los siguientes medios de cultivo: Agar Mueller – Hinton, agar

nutritivo, agar Sangre, agar chocolate, agar MacConkey, agar manitol salado, agar SS, agar cetrimide y agar sabouraud.

 06 Tubos con cada uno de los siguientes medios de cultivo: TSI, LIA, Citrato de Simmons, caldo

úrea, caldo RM-VP, medio SIM, caldo nutritivo.

 Cultivo microbiano en caldo.

 Cepa bacteriana en vial.

 09 tubos de ensayo estériles.

 03 asas bacteriológicas (02 en anillo y 01 en punta).

Equipos instrumentos y otros

 01 Incubadora microbiológica

 03 mecheros bunsen o de alcohol

b. Del Alumno: (individual)

 Manual de prácticas impreso y anillado.

 Libreta de apuntes y lapicero.

 Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro

 01 Marcador indeleble

c. Del alumno: (Grupal)

 Paquete de hisopos de toma de muestra microbiológica (por mesa de trabajo).

3.2. Procedimiento: Para realizar la siembra es necesario observar las siguientes reglas microbiológicas:

 Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes de empezar el trabajo y al finalizar.

 Colocar todo el material que se requiera para la siembra sobre la mesa de trabajo.

 Evitar las corrientes de aire. No hablar durante la siembra.

 Esterilizar el asa bacteriológica antes y después de la siembra.

 Emplear medios de cultivo estériles.

3.2.1. Siembra de microorganismos en medios líquidos

La siembra se realiza llevando el inoculo o la muestra con el asa en anillo o en punta al medio líquido y se deposita o mezcla. También pueden emplearse pipetas estériles.

Flameado Flameado

3.2.2. Siembra de microorganismos en medios semisólidos

Colocar la muestra por puntura en el Medio Gelatina, utilizando el asa en punta. Sembrar también en Medio Tioglicolato; luego de la inoculación, agitar suavemente los tubos por rotación entre las palmas de las manos para obtener una dispersión.

3.2.3. Siembra de microorganismos por diseminación en superficie

Se emplean porque ofrecen mayor área de siembra y permiten diferenciar a los microorganismos por sus características culturales. Con el asa bacteriológica tomar la muestra y realizar un estriado muy junto en el primer tercio de la placa (agotar) y luego realizar estrías en forma de zigzag más separadas hasta el lado opuesto. También se puede realizar el estriado utilizando los cuadrantes de la placa; en dos cuadrantes o cuatro cuadrantes.

3.2.4. Siembra en tubos con agar inclinado

Se emplean tubos de prueba con agar inclinado o pico de flauta. La siembra se realiza mediante estrías en la superficie inclinada y en algunos casos se realiza una puntura hasta las dos terceras partes de profundidad; o una puntura seguida de estrías en la superficie. En estos casos se emplea el asa bacteriológica en punta.

Flameado

Muestra Medio semisólido

Flameado

Incubación

A). 1 cuadrante b). 2 Cuadrantes c). 4 Cuadrantes

Siembra en profundidad (Picadura profunda) Siembra en estría en superficie inclinada. Pico de flauta Asa en punta.

3.2.5. Siembra por difusión en placa - por incorporación:

Utilizado para el recuento total de gérmenes a partir de una muestra líquida. La siembra se realiza colocando una alícuota (1 mL.) de la muestra sobre la superficie de una placa Petri estéril vacía. Luego agregar de 12 a 15 mL. de agar Nutritivo enfriado a 45 – 50ºC. Homogenizar mediante movimientos de rotación y traslación. Dejar solidificar. Las placas se llevan luego a incubación.

3.3. Manejo de residuos.

Todo el material de vidrio que tenga contacto con microorganismos debe ser esterilizado en autoclave a 121°C /15 libras de presión / 15 minutos para descarte o reutilización.

IV. RESULTADOS: Pinta los medios de cultivo observados en práctica y responde lo que se le solicita.

Resultado típico de la siembra por extensión en superficie. La muestra se pipetea

sobre la superficie del

agar (0,1 mL o menos). La muestra se extiende uniformemente utilizando un asa de Drigalsky estéril. Incubación