Marcaje fluorescente de los peroxisomas en plantas MFP2::YFP-

MFP2.

La técnica llamada Fluorescent Tagging of Full-Length Proteins (FTFLP) se basa en etiquetar proteínas completas con una marca (proteína) interna fluorescente de forma que permite determinar los patrones de expresión y la localización subcelular in vivo de esa proteína en la planta. Además, la expresión de la proteína marcada ocurre bajo la regulación de sus propias secuencias reguladoras nativas, y por tanto se expresa y se localiza únicamente en el tejido o momento del desarrollo donde ocurre de forma natural en la planta (Tian et al., 2004). Plantas transgénicas que expresan proteínas de distinta localización subcelular etiquetadas con esta técnica están disponibles públicamente (htpp://gfp.stanford.edu/). Para nuestro análisis, utilizamos plantas transgénicas (caracterizadas en el apartado de Materiales y Métodos) que expresaban la proteína MFP2 (At3g06860), enzima implicada en el segundo paso de β-oxidación, unida a la proteína fluorescente YFP y bajo el control de la propia secuencia promotora del gen MFP2, localizándose la proteína recombinante dentro de peroxisomas (Tian et al., 2004). La localización peroxisomal de la proteína está descrita también para la proteína MFP2 de

Brassica napus, que presenta un 85 % de identidad con la MFP2 de Arabidopsis (Cutler et

al., 2000).Por tanto, la cuantificación de las señales fluorescentes emitidas por las proteínas YFP-MFP2 localizadas en el interior de peroxisomas, permitiría determinar el número de peroxisomas en cada célula. La visualización de la fluorescencia emitida se llevó a cabo mediante microscopía confocal que permite el estudio de muestras con marcaje fluorescente haciendo secciones ópticas de las mismas (planos), posibilitando el estudio tridimensional de la muestra. Sin embargo, la imposibilidad de realizar una cuantificación de las marcas fluorescentes por célula impidió realizar una estimación cuantitativa real del número de peroxisomas. No obstante, la técnica permitió observar cambios cualitativos entre las imágenes obtenidas procedentes de las distintas situaciones analizadas y, por tanto, determinar de forma relativa la existencia de cambios en el número de peroxisomas. Como

se muestra en la figura 37.A, las plantas MFP2::YFP-MFP2 mostraron señales fluorescentes provenientes de la proteína YFP localizadas próximas a los cloroplastos (autofluorescencia roja), correspondiendo cada punto verde con un peroxisoma. Los peroxisomas de plantas se asocian a cloroplastos para poder llevar a cabo la fotorespiración (Somerville, 2001, Schumann et al., 2007). Para analizar si el CFB actúa como un inductor de la proliferación de peroxisomas en Arabidopsis, se comparó la fluorescencia debida a YFP en hojas de plantas tratadas con CFB respecto a hojas de plantas control. Las plantas

MFP2::YFP-MFP2 tratadas con CFB mostraron una mayor acumulación de puntos

fluorescentes, observándose al realizar el solapamiento de múltiples planos Z de la hoja la formación de aparentes agrupamientos (figura 37.B). Estos resultados sugerían que el CFB era capaz de activar la proliferación de peroxisomas en Arabidopsis. La cuantificación de las señales fluorescentes asociadas a YFP correspondientes a las distintas situaciones analizadas, reveló nuevamente las diferencias observadas de visu. Las plantas tratadas con CFB mostraron un incremento de fluorescencia de 1,5 veces respecto a plantas control, mientras que plantas heridas o tratadas con JA no mostraron diferencias significativas en la fluorescencia emitida (figura 37.C). Estos datos sugieren que ni la herida ni JA dan lugar a cambios en el número de peroxisomas en las células. Ya que la estimación que se realizó estaba basada en la cuantificación de la fluorescencia total de cada imagen y no el número real de puntos verdes por imagen, se analizó la expresión de la proteína YFP-MFP2 en respuesta a los diferentes tratamientos con el fin de comprobar que el incremento en la fluorescencia era debido a un aumento del número de peroxisomas y no a una mayor acumulación de la proteína recombinante. El análisis, realizado mediante Western blot con un anticuerpo que reconoce a YFP, no mostró diferencias significativas en la acumulación de la proteína YFP-MFP2 en respuesta a CFB, herida o JA (figura 37.D). Asimismo, los datos transcriptómicos de las bases de datos públicas (Arabidopsis eFP Browse, Genevestigator), indican que la expresión del gen MFP2 no varía en respuesta a la herida o a la aplicación de JA. Además, en el análisis transcriptómico realizado en el apartado 5, tampoco se encontraron niveles inducidos del gen MFP2 en respuesta a CFB. Todos estos resultados parecían indicar que el aumento de la fluorescencia observado en las plantas

MFP2::YFP-MFP2 tratadas con CFB era debido a un incremento en el número de

peroxisomas y no a un incremento en la acumulación de la proteína YFP-MFP2, y de igual forma, que la herida o el tratamiento de JA no producía cambios en el número de peroxisomas de las células.

A

B

C CFB

C

D

0 0,5 1 1,5 F luores c enc ia relativa C CFB H JA C CFB H JA YFP-MFP2 Rubisco 130 95 250 130 95 72 55 36 28

Figura 37. Análisis del número de peroxisomas mediante microscopia confocal de la proteína YFP-MFP2 en hojas de plantas transgénicas MFP2::YFP-MFP2 heridas o tratadas con CFB o JA.

Plantas adultas de un mes cultivadas en condiciones de DC se hirieron o trataron con JA o CFB. La aplicación exógena de CFB o JA se realizó mediante pulverización sobre la superficie de las hojas con una emulsión acuosa que contenía cada uno de los compuestos. La herida se realizó de forma manual, presionando parte de la superficie foliar con pinzas estriadas. Cada conjunto de plantas con diferentes tratamientos se aisló del resto para evitar contaminaciones por compuestos volátiles. Las imágenes de microscopía confocal se tomaron a las 0 y 24 horas post-tratamiento. A. Las marcas fluorescentes verdes debidas a la proteína YFP-MFP2 peroxisomal indican la posición de los peroxisomas entre los cloroplastos que muestran autofluorescencia roja. La imagen derecha corresponde a la magnificación de una única célula. Las barras blancas corresponden a 20 µm (imagen izquierda) o 5 µm (imagen derecha). B. Imágenes representativas resultantes del

solapamiento de planos Z correspondientes al mesófilo de una hoja control (C) o tratada con CFB (CFB). Las barras blancas corresponden a 20 µm. C. Fluorescencia relativa de hojas heridas, tratadas con CFB o JA respecto a sus correspondientes hojas control. Las medidas se obtuvieron cuantificando los canales de color de las imágenes con el programa informático Adobe Photoshop. Cada valor representa la media del ratio tratamiento/control ± EE de 10 imágenes correspondientes a 3 experimentos independientes. D. Extractos de proteína total procedentes de hojas control (C), heridas (H) o tratadas con CFB 1 mM (CFB) o JA 100 µM (JA) fueron separados mediante SDS-PAGE 10 % y transferidos a membrana de nitrocelulosa. La proteína YFP-MFP2 fue detectada por Western blot con un anticuerpo primario policlonal anti-GFP(Ct) que reacciona contra YFP, y un anticuerpo secundario anti-conejo-HRP. Se incluye la tinción con Coomassie de un duplicado del gel como control de carga indicando la posición de la rubisco.

2.1.2. Tinción citoquímica de los peroxisomas con 3,3´-

In document Función del gen 3-cetoacil-CoA tiolasa 2 (KAT2 ) en defensa y desarrollo. Participación de los peroxisomas en las respuestas (página 162-165)