Participación en otros procesos relacionados con JA.

4.2.2.1. Respuesta a patógenos necrotrofos en plantas transgénicas con niveles reducidos de KAT2.

El gen KAT2 participa en las respuestas activadas frente a herida y tiene una función esencial en la síntesis de JA en respuesta a este factor de estrés. El JA junto con el Et son las hormonas reguladoras clave en la defensa frente a patógenos necrotrofos (Glazebrook, 2005; Halim et al., 2006). Concretamente estas dos hormonas actúan de forma cooperativa en la activación de la expresión de genes implicados en defensa contra patógenos necrotrofos (Xu et al., 1994; Penninckx et al., 1998), y lo hacen a través de la activación de los FT ERF1 y ORA59 (Lorenzo et al., 2003; Pré et al., 2008). Debido a las relaciones existentes entre las vías de señalización en respuesta a herida y patógenos necrotrofos, se analizó la posible implicación del gen KAT2 en las respuestas activadas frente a la inoculación con Plectosphaerella cucumerina. Además, el análisis de la

expresión del gen PDF1.2a (At5g44420), marcador de las respuestas a patógenos necrotrofos dependiente de la vía de señalización JA/Et (Penninckx et al., 1998), en las plantas transgénicas con niveles disminuidos o aumentados de KAT2 (KAT2as y

35S::KAT2), permitió dilucidar un posible papel de este gen en la activación de las vías de

señalización activadas por JA/Et en respuesta a patógenos necrotrofos. Los datos transcriptómicos depositados en las bases de datos indican que KAT2 es el único gen KAT que aumenta su expresión en respuesta a la infección por Botrytis cinerea.

16C 21A 49I COL 12G COL KAT2 KAT2 0 1 2 3 PDF1.2a 0 1 2 3 PDF1.2a KATas 35S::KAT2 0 1 2 3 0 1 2 3 10 20 30 40 50 60 0 Tiempo (d) 5 10 15 20 25 30 0 1 2 3 4 5 0 10 102 103 0 Ex p res ión r e lat iva de tr ans c rito

Figura 22. Nivel de expresión de los genes KAT2 y PDF1.2a, marcador de las respuestas a patógenos necrotrofos dependiente de la vía Et/JA, en plantas Col y líneas transgénicas KAT2as y 35S::KAT2 infectadas con Plectosphaerella cucumerina.

Plantas adultas cultivadas en tierra fueron inoculadas por aspersión con una suspensión de Plectosphaerella cucumerina 5·106 esporas/ml suspendidas en MgSO4. 10 mM estéril. Las plantas se

mantuvieron en condiciones estancas con un alto grado de humedad y se recogieron muestras en los días 1 y 3 postinfección. Las plantas transgénicas homocigotas e independientes 16C y 12G corresponden a líneas KAT2as y la 21A y 49I a líneas 35S::KAT2. Se analizó la expresión de los genes por RT-PCR cuantitativa. Para cuantificar los niveles de KAT2 en las plantas KAT2as se utilizaron cebadores localizados en la región 3´ no codificante del mRNA que no está presente en el transgén y que por tanto solo amplifica el transcrito endógeno (pareja qP-KAT2-2F/ qP-KAT2-2F). En las plantas 35S::KAT2 se utilizaron cebadores localizados dentro de la ORF (pareja qP-KAT2-F/ qP-KAT2-F). Los valores se normalizaron según el contenido de ACT2/8 determinado en las mismas muestras.

Como se muestra en la figura 22, en las plantas Col se produjo un aumento de la expresión del gen KAT2 a partir del día 1 tras la infección con P. cucumerina, observándose niveles máximos de expresión a los 3 días postinfección precediendo a la inducción de PDF1.2a. En las líneas transgénicas KAT2as, la activación transcripcional de PDF1.2a por P.

cucumerina fue relativamente menor que la observada en Col, y por el contrario, las plantas

transgénicas 35S::KAT2 mostraron niveles de inducción de PDF1.2a levemente mayores que Col. Este resultado sugería una correlación entre los niveles de expresión de KAT2 y la magnitud de la inducción del gen PDF1.2a en respuesta a P. cucumerina.

4.2.2.2. Control del crecimiento en plantas transgénicas con niveles reducidos de KAT2.

Las respuestas a estrés afectan al desarrollo y el crecimiento de las plantas. Se han descrito numerosas situaciones de estrés como infección por patógenos, sequía, temperaturas extremas o irradiación alta en las que se produce un adelanto del tiempo de floración junto con un incremento en los niveles de las hormonas relacionadas como etileno, ABA, oxilipinas o SA (Raskin, 1992; Ni et al., 1996; Dempsey et al., 1999; Blée, 2002; Pastori y Foyer, 2002). El JA tiene un papel crucial como regulador negativo en algunos aspectos del desarrollo de plantas (Staswick et al., 1992; Creelman y Mullet, 1997b). En nuestro laboratorio se ha comprobado que tanto el SA como el JA se comportan como reguladores del tiempo de floración ejerciendo funciones antagonistas. El SA actúa promoviendo la floración de plantas de Arabidopsis cultivadas en condiciones estándar, y se requiere además para la floración acelerada por factores de estrés (Martínez et al., 2004). En cambio, el JA parece ejercer como un regulador negativo del desarrollo reproductivo en Arabidopsis dando lugar a un retraso en el tiempo de floración. Ya que las plantas transgénicas deficientes en KAT2 tenían niveles de JA muy reducidos en respuesta a herida y posiblemente, en respuesta a otros factores de estrés relacionados con JA, se analizó si estas plantas presentaban además cambios en el tiempo de floración. En Arabidopsis, existe una buena correlación entre el número de días hasta la producción de la primera flor y el número de hojas producidas (Koornneef et al., 1991), siendo por tanto la forma más común de medir el tiempo de floración el conteo de las hojas totales (de roseta más caulinares). En este caso, se analizó el tiempo de floración en condiciones de día corto (DC), que son

condiciones no inductivas de la floración, para amplificar las posibles diferencias existentes. Como se observa en la figura 23, el número de hojas totales hasta la aparición de la primera flor fue significativamente menor en las líneas KAT2as (20-25 hojas) con respecto a Col (37 hojas), indicando que la menor expresión de KAT2 producía un adelanto de la floración. Para validar los resultados obtenidos se analizó el plastocrono o tiempo necesario para la formación de una nueva hoja (ver apartado 9 de Materiales y Métodos). Diferencias significativas en este índice indicarían alteraciones en la tasa de crecimiento vegetativo y, por tanto, invalidaría las comparaciones entre genotipos basadas en el conteo de hojas. En este sentido, tanto las líneas transgénicas como Col mostraron un valor de plastocrono entre 1,5 y 1,7, sugiriendo que las diferencia observadas en las líneas KAT2as estaban asociadas a eventos relacionados con la transición floral y no con el desarrollo vegetativo de las plantas. Como hemos descrito anteriormente, uno de los factores causantes del adelanto de la floración en las líneas KAT2as podría ser la menor síntesis de JA en estas plantas. Nº d e hoj as tot a les CAULINARES ROSETA

**

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***

***

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Col 16C 12G 38D

Figura 23. Medida del tiempo de floración en plantas Col y líneas transgénicas KAT2as cultivadas en condiciones de DC.

Las plantas fueron cultivadas en condiciones controladas con un fotoperiodo de DC. Las líneas 16C, 12G y 38D corresponden a tres líneas transgénicas homocigotas independientes KAT2as. Se realizó el conteo del número de hojas de la roseta hasta la aparición del botón floral más el número de hojas caulinares. Cada barra de la gráfica representa la media ± EE de 15 plantas. Se ha realizado otro experimento independiente con resultados similares. *** p< 0,001 ** p<0,01 según análisis t-test de cada línea respecto a Col.