Participación de los peroxisomas en las respuestas a herida en Arabidopsis
A- B Plántulas de 11 días cultivadas en medio líquido MS con 0,5 % sacarosa (p/v) fueron tratadas
2.2. Tamaño de los peroxisomas en respuesta a CFB, herida y JA
La tinción citoquímica de los peroxisomas con DAB permitió a su vez determinar el tamaño de estos orgánulos en las situaciones analizadas previamente. Para ello, se determino el área de los peroxisomas en secciones ultrafinas visualizadas con microscopía electrónica de transmisión en las que aparecían teñidos de negro. Esta tinción marcó específicamente peroxisomas ya que la reacción utilizando el compuesto 3-amino-1,2,4- triazol (AT), inhibidor de la catalasa (Fahimi, 1968; 1969; Novikoff y Goldfischer, 1969), no produjo tinción de estos orgánulos (figura 39.A). Paralelamente, con el fin de poder establecer diferencias entre efectos específicos sobre peroxisomas o comunes a otros orgánulos, se analizó en las mismas muestras el área de las mitocondrias. Como se muestra en la figura 39.B, la herida y el CFB no provocaron cambios en el tamaño peroxisomal, sin embargo, la aplicación exógena de JA dio lugar a peroxisomas anormales con un tamaño de aproximadamente 1,5 veces el área de estos orgánulos en el control. Por el contrario, el tamaño de las mitocondrias fue similar en todos los casos analizados, indicando que los cambios originados por la aplicación de JA eran específicos sobre peroxisomas. Por lo tanto, según los resultados obtenidos, el JA originaba una reducción del número de peroxisomas y un aumento del tamaño de éstos, sugiriendo que, al menos en Arabidopsis, el JA interviene en la regulación del tamaño y de la proliferación de estos orgánulos. Por otra parte, en las imágenes de microscopía electrónica no se encontraron asociaciones entre peroxisomas formando agrupamientos o cadenas como sugerían las imágenes de microscopía confocal de plantas MFP2::YFP-MFP2 tratadas con CFB (figura 39.B), indicando que no existían interacciones físicas entre peroxisomas promovidas por CFB y que, por tanto, era únicamente el solapamiento de planos Z el causante de las agrupaciones observadas.
A
B.1
B.2
CON AT SIN AT P Cl Cl P Cl Cl P M M M P Cl M P Cl P P CONTROL M P Cl M P Cl HERIDA CFB JA Área orga nu lo (µm 2) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 CONTROL CFB HERIDA JA MITOCONDRIAS PEROXISOMAS*
Figura 39. Análisis del tamaño de los peroxisomas mediante tinción citoquímica con 3,3´- diaminobenzidina (DAB) y visualización con microscopia electrónica de transmisión en hojas de plantas Col-0 heridas o tratadas con CFB o JA.
Plantas adultas de un mes de edad cultivadas en condiciones de DC se dividieron en grupos de forma aleatoria (3 plantas por grupo). A cada grupo se les aplicó un tratamiento distinto: herida, CFB 2 mM, o JA 0,25 mM. La aplicación exógena de CFB o JA se realizó pulverizando las respectivas emulsiones sobre la superficie de las plantas. La herida se realizó de forma manual, presionando parte de la superficie foliar con pinzas estriadas. Cada conjunto de plantas se aisló del resto para evitar contaminaciones por compuestos volátiles y la tinción citoquímica se realizó a las 24 horas post- tratamiento. A. Los peroxisomas aparecen teñidos en negro por la acción de la catalasa peroxisomal y posterior fijación con OsO4. El control de tinción se realizó añadiendo a la reacción 3-amino-1,2,4-
triazol (AT), inhibidor de la catalasa, lo que impide la tinción de los peroxisomas. B. Medida del área de peroxisomas y mitocondrias en células de hojas control, heridas o tratadas con JA o CFB. (1). Representación gráfica de los valores obtenidos. Cada barra representa la media ± EE del área de todos los orgánulos medidos. Se analizaron aproximadamente 25 secciones ultrafinas diferentes con varios orgánulos por sección utilizando el programa informático ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). * p<0,05 según análisis t-test para cada tratamiento respecto al control. (2). Imágenes representativas de las secciones ultrafinas visualizadas con microscopia electrónica de transmisión de la tinción citoquímica con DAB en los diferentes tratamientos analizados. Se observan peroxisomas (P), cloroplastos (Cl) y mitocondrias (M). Las barras de referencia corresponden a 0,5 µm.
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3..EExxpprreessiióónnddeeggeenneess PPEEXXeennrreessppuueessttaaaaCCFFBB,,aallaahheerriiddaayyaaJJAA..
Las peroxinas (PEX) son un grupo de proteínas implicadas en muchos aspectos relacionados con la biogénesis y mantenimiento de los peroxisomas, entre ellas el ensamblaje de nuevas membranas, transporte de proteínas al interior del peroxisomas y la división/proliferación del orgánulo (Lazarow, 2003; Baker y Sparkes 2005; Hayashi y Nishimura, 2006). Con el fin de investigar si los distintos comportamientos observados, en términos de proliferación de peroxisomas, en hojas heridas o tratadas con JA o CFB eran debidos a una regulación diferencial de los genes PEX, se analizó la respuesta de los genes
PEX1 y PEX14 en las situaciones analizadas. Además, variaciones en la expresión de estos
genes en respuesta a la herida y JA podrían revelar una posible función de los PEX en la defensa frente a herida en Arabidopsis. El gen PEX1 (At5g08470) codifica una ATPasa de membrana tipo AAA relacionada con la biogénesis de peroxisomas (Faber et al., 1998; Titorenko et al., 2000; Titorenko y Rachubinski, 2000), y como se ha comentado, se había descrito la activación transcripcional de PEX1 en respuesta a estrés oxidativo, senescencia, herida y patógenos (López-Huertas et al., 2000). El gen PEX14 (At5g62810) codifica una proteína transmembrana peroxisomal implicada en el importe de las proteínas que contienen los péptidos señal PTS1 y PTS2 (López-Huertas et a., 1999; Hayashi et al., 2000a). El mutante ped2/pex14 presenta peroxisomas anormales morfológicamente y una reducción de las proteínas peroxisomales en el interior del orgánulo, sugiriendo una función esencial del gen PEX14 tanto en la biogénesis como en el mantenimiento de las funciones de dicho orgánulo (Hayashi et al., 2000a). Además, en los análisis realizados se incluyeron los genes KAT2 y JR2 como controles internos de la respuesta a herida, JA y CFB. El tratamiento exógeno con CFB, que conlleva proliferación de peroxisomas, dio lugar a un aumento de la expresión de los genes PEX1 y PEX14 con una cinética de inducción progresiva a lo largo del tiempo. Este patrón de expresión fue similar al observado para los genes KAT2 y JR2 (figura 40.A). Se observó un aumento progresivo de la expresión de los genes PEX1 y PEX14 en respuesta a la herida a lo largo del tiempo, siendo en ambos casos con una magnitud de inducción mucho menor que la de los genes KAT2 y JR2 (figura 40.B). Estos resultados sugerían una posible función de los genes PEX en las respuestas activadas frente a la herida en Arabidopsis. Para profundizar en las vías de señalización que actúan en la activación de los genes PEX en respuesta a la herida, se analizó la respuesta a JA. En este caso, la aplicación exógena de concentraciones crecientes de JA no produjo ningún cambio en la expresión de PEX1 o PEX14 (figura 40.C), sugiriendo que la
activación en respuesta a la herida de los genes PEX discurría por una vía de señalización independiente de JA.
A
B
C
CFB HERIDA JA 0 10 20 30 40 0 5 10 15 20 25 KAT2 JR2 PEX1 PEX14 0 5 10 15 20 25 0 20 40 60 80 100 KAT2 JR2 PEX1 PEX14 Tiempo (h) Tiempo(h)Figura 40. Nivel de expresión de los genes PEX1 y PEX14, implicados en la biogénesis y función de peroxisomas, en respuesta a CFB, herida y JA.
Representación gráfica de los niveles de expresión obtenidos por RT-PCR cuantitativa. Los valores se muestran normalizados según los niveles de ACT2/8 determinados en las mismas muestras. Los datos muestran la media ± EE de 3 réplicas. A. Plántulas Col-0 de 11 días cultivadas en medio líquido MS con 0,5 % sacarosa (p/v) fueron tratadas con CFB 1 mM y se analizó la respuesta en los tiempos indicados después del tratamiento. B. Hojas de roseta de plantas adultas Col-0 fueron heridas mediante pinzas estriadas. Se analizó la respuesta de los genes en los tiempos indicados. C. Plántulas Col-0 de 11 días cultivadas en medio liquido MS con 0,5 % sacarosa (p/v) se trataron con concentraciones crecientes de JA (µM) y las muestras se recogieron a las 6 horas después de realizar el tratamiento.
4
4..AAnnáálliissiissddeellaassrreessppuueessttaassddeesseennccaaddeennaaddaassppoorrCCFFBB,,hheerriiddaayyJJAA
e
enneellmmuuttaanntteeddeeiinnsseerrcciióónnddeeTT--DDNNAA ppeexx1144..
Los resultados de este trabajo indican que en respuesta a la herida no se producen alteraciones en el número o tamaño de los peroxisomas pero si un aumento de la expresión de los genes PEX1 y PEX14, previsiblemente por una vía de señalización independiente de JA. Estos resultados sugieren que las peroxinas codificadas por los genes PEX e implicadas en la biogénesis y mantenimiento de los peroxisomas podrían estar ejerciendo alguna función en las respuestas de defensa activadas frente a herida en Arabidopsis. Para analizar
Ex pres ión t Concentración (µM) 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 KAT2 JR2 PEX1 PEX14 KAT2 JR2 PEX1 PEX14 KAT2 JR2 PEX1 PEX14 o de t ran s c ri re lati v a
la relevancia de los genes PEX en el correcto desarrollo de estas respuestas, se analizaron las respuestas frente a herida, CFB y JA en plantas que presentaban alteraciones en los peroxisomas, tanto morfológicas como en el contenido enzimático. Como se ha descrito anteriormente, el mutante ped2 presenta una mutación en el gen PEX14 que da lugar a defectos en β-oxidación y en fotorespiración debido a una drástica reducción de las enzimas de la matriz peroxisomal como KAT2, además de alteraciones en la morfología de los peroxisomas (Hayashi et al., 1998b; 2000a). En este estudio, se ha seleccionado un mutante de inserción de T-DNA en el gen PEX14 (colección pública SALK) con el fin de conseguir un mutante con pérdida de función. La caracterización de estas líneas transgénicas está descrita en el apartado de Materiales y Métodos. Estas plantas se emplearon para indagar tanto la función del gen PEX14 como la relevancia de la integridad de los peroxisomas en las respuestas de defensa desencadenadas por la herida.