Respuesta a la aplicación exógena de JA y SA.

Ya que en las respuestas a la herida analizadas parecían estar implicadas tanto la vía dependiente de COI1, y por tanto, dependiente de la percepción de JA, como la vía independiente de COI1, para la activación de los genes KAT5 y KAT2 respectivamente, se quiso comprobar si la aplicación exógena de JA era capaz de activar la expresión de los genes KAT con un patrón de inducción concordante con las respuestas a la herida observadas. Para este propósito, se analizó la expresión de los genes KAT en respuesta a concentraciones crecientes de JA en plántulas Col y coi1-1 con el fin de discernir entre vías de señalización mediadas por COI1 o independientes de ésta. En el análisis Northern blot realizado se observó un aumento progresivo de la expresión del gen KAT5 en plántulas Col a las 6 horas tras el tratamiento con concentraciones crecientes de JA, observándose la máxima inducción entre 50 y 100 µM (figura 13.A). Coincidiendo con estos datos, los análisis transcriptómicos disponibles en las bases de datos indican que el gen KAT5 es el

rRNA

d.h. (h)

S L S L S L S

HERIDA

único de los genes KAT que aumenta su expresión en plantas tratadas con JA (ratio plantas tratadas/control de 2,21 según el Genesvestigator). Este patrón de activación por JA de

KAT5 era similar al mostrado por el gen JR2. Además, en plantas coi1-1 no hubo un

aumento de la expresión de los genes KAT5 y JR2 en respuesta a JA, indicando de nuevo un patrón de expresión similar de estos dos genes (figura 13.A). Estos resultados indicaban de nuevo que la activación de la expresión del gen KAT5 en respuesta a la herida, al igual que la del gen marcador JR2, ocurre por una vía totalmente dependiente de COI1 y de JA. Por el contrario, la expresión del gen KAT2 no se vio alterada al aplicar concentraciones crecientes de JA (figura 13.A), incluso cuando se analizaron distintos tiempos posteriores al tratamiento (figura 13.B), lo que nuevamente indicó que la activación de la expresión del gen KAT2 en respuesta a la herida ocurre por una vía independiente de JA.

KAT2 KAT5.2 JR2 rRNA Col-0 coi1-1 (µm) JA 0 0,1 1 5 10 50 100 250 0 0,1 1 5 10 50 100 250

A

B.1

B.2

KAT2 JR2 rRNA JA 0 3 6 24 t.d.t. (h) Tiempo (h) Ex p res ió n r e lat iv a d e tr a n sc ri to KAT2 0 5 10 15 20 25 0 0,5 1 1,5 2

Figura 13. Nivel de expresión de los genes KAT en respuesta a la aplicación exógena de JA en plántulas Col y en el mutante insensible a JA coi1-l.

Las aplicaciones exógenas de JA se realizaron en plántulas de 11 días cultivadas en medio líquido MS con 0,5 % sacarosa (p/v). La expresión de los genes se analizó por Northern blot con marcaje radiactivo empleando sondas específicas para cada gen. Se incluye la hibridación con la sonda correspondiente al gen JR2, marcador de las respuestas a herida dependientes de JA y la tinción del rRNA con bromuro de etidio como control de carga. A. Las plántulas se trataron con concentraciones crecientes de JA (µM) y las muestras se recogieron a las 6 horas después de realizar el tratamiento. B. Las plántulas se trataron con JA 250 µM y las muestras se recogieron a distintos tiempos después de realizar el tratamiento (t.d.t.). (1) Análisis Northern blot. (2) Los valores de la gráfica representan los niveles relativos de transcrito cuantificados y normalizados al contenido de rRNA correspondiente en cada muestra. Cada punto representa la media ± EE de 3 experimentos independientes.

Existen múltiples evidencias que indican que las vías de señalización activadas por JA y SA son antagónicas (revisado por Kunkel y Brooks, 2002; Rojo et al., 2003; Glazebrook, 2005; Devoto y Turner, 2005; Lorenzo y Solano, 2005; Beckers y Spoel, 2006; Halim et al., 2006; Wasternack, 2007; Loake y Grant, 2007). Con el propósito de determinar posibles interacciones en las respuestas activadas por JA y SA se comparó el patrón de expresión de los genes KAT en respuesta a tratamientos individuales y conjuntos de ambas hormonas. Se ha descrito que aplicaciones a bajas concentraciones (10-100 µM) de ambas hormonas tiene efectos sinergísticos en la expresión de genes dependientes de JA o de SA, y que concentraciones altas (>100 µM) o tiempos largos, produce antagonismo entre las vías de señalización activadas por ambas hormonas (Mur et al., 2006). Se comprobó por análisis Northern blot que el gen KAT2 no modificaba su expresión en respuesta a la aplicación de concentraciones crecientes de SA (figura 14.A), ni a lo largo del tiempo después de realizar el tratamiento (figura 14.B). Coincidiendo con estos resultados, los datos transcriptómicos depositados en las bases de datos indican que el SA no altera la expresión de ningún gen KAT. De igual manera, la expresión de los genes KAT5 y JR2 no varió en el tratamiento con SA (figura 14.A). En cambio, la aplicación conjunta de ambas hormonas reveló diferencias en las vías de señalización que activaban la expresión de ambos genes en respuesta al tratamiento con JA. Mientras que la inducción del gen JR2 en respuesta a JA fue reprimida en el tratamiento conjunto de SA+JA en todas las concentraciones analizadas, la acumulación del transcrito de KAT5 en respuesta a JA fue similar en todos los casos, sugiriendo que el SA no actúa como represor en la activación del gen KAT5 (figura 14.A). Respecto al gen PR1 (At2g14580) marcador de las respuestas dependientes de SA (Ryals et al., 1996), también se observó un efecto inhibitorio en el tratamiento conjunto en todas las concentraciones analizadas (figura 14.A).

A

B.1

B.2

KAT2 PR1 rRNA KAT5.2 JR2 SA JA JA + SA (µM) 0 1 10 50 100 200 0 1 10 50 100 200 0 1 10 50 100 200 Tiempo (h) Ex pre s ió n re la ti v a d e tr a n scr it o KAT2 0 5 10 15 20 25 0 0,5 1 1,5 2 0 0,5 2 6 24 KAT2 PR1 SA rRNA t.d.t (h)

Figura 14. Nivel de expresión de los genes KAT en respuesta a la aplicación exógena de SA, JA y a la aplicación conjunta de ambas moléculas en plántulas de A. thaliana.

Las aplicaciones exógenas de JA y SA se realizaron en plántulas Col de 11 días cultivadas en medio líquido MS con 0,5 % sacarosa (p/v). La expresión de los genes se analizó por Northern blot empleando marcaje radiactivo con sondas específicas para cada gen. Se incluye la hibridación con las sondas correspondientes al gen JR2, marcador de las respuestas a herida dependientes de JA y al gen PR1, marcador de las respuestas dependientes de SA. La tinción del rRNA con bromuro de etidio se añade como control de carga. A. Las plántulas se trataron con concentraciones crecientes de JA y/o de SA (µM) y las muestras se recogieron a las 6 horas después de realizar el tratamiento. B. Las plántulas se trataron con SA 250 µM y las muestras se recogieron a distintos tiempos después de realizar el tratamiento (t.d.t.). (1) Análisis Northern blot. (2) Los valores de la gráfica representan los niveles relativos de transcrito cuantificados y normalizados al contenido de rRNA correspondiente en cada muestra. Cada punto representa la media ± EE de 3 experimentos independientes.

In document Función del gen 3-cetoacil-CoA tiolasa 2 (KAT2 ) en defensa y desarrollo. Participación de los peroxisomas en las respuestas (página 106-109)