Respuesta a la deshidratación y a la aplicación exógena de ABA.

Como se ha descrito anteriormente, el gen KAT2 se induce en respuesta a la herida por una vía independiente de COI1/JA. Esta vía de señalización es responsable de la activación génica a nivel local (Rojo et al., 1999; León et al., 2001). Sin embargo, KAT2 también aumentó su nivel de expresión en respuesta a la herida a nivel sistémico por un mecanismo COI1 independiente y por tanto insensible a JA. Estos datos sugerían la participación de otra molécula móvil generada por la herida distinta del JA que actuase a

nivel sistémico (y podría actuar también a nivel local), activando a genes insensibles a JA, entre ellos KAT2. En solanáceas, la herida produce la acumulación local y sistémica de JA y ABA (Peña-Cortés et al., 1995; Birkenmeier y Ryan, 1998), y aunque en Arabidopsis la función conjunta de JA y ABA en la respuesta a la herida ha sido desacoplada (León et al., 2001), todavía no se ha determinado con exactitud las posibles funciones reguladoras del ABA en las respuestas a herida. Además, en las zonas dañadas se produce una desestructuración del tejido que va acompañado de una drástica pérdida de agua (Reymond et al., 2000; 2004), siendo la respuesta génica activada en herida, una combinación del daño y del estrés hídrico producido (Birkenmeier y Ryan 1998; Reymond et al., 2000). En este sentido, el ABA tiene una función esencial en las respuestas a estrés hídrico desencadenadas por la deshidratación producida en la herida (Christmann et al., 2006). Ya que los genes KAT2 y KAT5 responden a herida de manera diferencial, se analizó la expresión de estos genes en respuesta a la deshidratación y al ABA.

Figura 15. Nivel de expresión de los genes KAT en respuesta a la deshidratación y a la aplicación exógena de ABA en plántulas de A. thaliana.

La expresión de los genes se analizó por Northern blot utilizando sondas radiactivas específicas para cada gen. Se incluye la hibridación con la sonda correspondiente al gen RAB18, marcador de las respuestas a deshidratación dependientes de ABA y la tinción del rRNA con bromuro de etidio como control de carga. A. Plántulas Col se cultivaron en medio líquido MS con 0,5 % sacarosa (p/v). A los 10 días se deshidrataron eliminando el medio de cultivo de las placas y colocándolas sobre papel Whatman. Las plántulas se pesaron antes de la deshidratación y a distintos tiempos, calculando el porcentaje de deshidratación como el cociente entre el peso fresco posterior a la deshidratación y el peso fresco inicial de cada plántula. B.1-2. Las aplicaciones exógenas de ABA se realizaron en plántulas Col de 11 días cultivadas en medio líquido MS con 0,5 % sacarosa (p/v). (1). Las plántulas se trataron con concentraciones crecientes de ABA (µM) y las muestras se recogieron a las 6 horas después de realizar el tratamiento. (2). Las plántulas se trataron con ABA 50 µM y las muestras se recogieron a distintos tiempos después de realizar el tratamiento (t.d.t.). (3) Monitorización del nivel de luminiscencia emitido por plantas de dos líneas transgénicas homocigotas e independientes KAT2::LUC (1A y 12C) en respuesta a la aplicación exógena con ABA. Las plantas fueron rociadas con una disolución 0,1 mM de luciferina y a las 12 horas se realizó el tratamiento con ABA 100 µM. Las imágenes fueron obtenidas a los tiempos indicados desde la aplicación con ABA con una cámara de baja luminosidad Hamamatsu C2400. El código de colores correlaciona con la intensidad lumínica detectada, siendo el azul el nivel más bajo y el rojo el nivel superior. Se incluye el tratamiento con luciferina como control negativo.

B.1

A

B.2

KAT2 KAT5.2 RAB18 rRNA ABA (µM) 0 0,1 0,5 1 5 10 25 50 100 250 0 0,5 1 2 4 8 24 ABA KAT2 rRNA t.d.t. (h) KAT2 KAT5.2 RAB18 rRNA 0 15 20 25 40 80 DESHIDRATACIÓN (%)

B.3

0 h 2 h 6 h 24 h 1A 12C + + - - ABA ABA + +

Como se muestra en los análisis Northern blot de la figura 15, el comportamiento de los genes KAT fue distinto en ambos casos. El gen KAT2 presentó una fuerte inducción en plántulas deshidratadas proporcional al porcentaje de deshidratación. En plántulas con un 15 % de deshidratación, KAT2 mostró niveles inducidos y en situaciones de una gran pérdida de agua (>40 %), se observó el máximo nivel de inducción, presentando por tanto una sensibilidad mayor a la deshidratación que la del gen RAB18 (At5g66400), marcador de las respuestas a deshidratación dependientes de ABA (Lang y Palva, 1992) (figura 15.A).

Por otro lado, el análisis de la expresión en plántulas tratadas con diferentes concentraciones de ABA, mostró que KAT2 también responde a ABA de manera dependiente a la concentración aplicada, siendo el patrón de inducción similar al del gen

RAB18 (figura 15.B.1). La cinética de inducción del gen KAT2 en respuesta al ABA fue

similar a la observada en respuesta a la herida, mostrando un máximo de expresión a partir de las 4 horas y manteniendo niveles inducidos a las 24 horas (figura 15.B.2). Contrariamente, los datos disponibles en las bases de datos de análisis transcriptómicos indican que ningún gen KAT aumenta su expresión por ABA. En este caso, además de los análisis Northern blot, se comprobó si plantas transgénicas KAT2::LUC mostraban un aumento de actividad luciferasa en respuesta a ABA. Como se observa en la figura 15.B.3, la aplicación exógena de ABA en las plantas KAT2::LUC dio lugar a niveles altos de luminiscencia de forma generalizada en toda la planta, con una cinética de inducción similar a la observada para el análisis Northern blot. Este resultado sugería que la activación del gen KAT2 en respuesta a deshidratación estaría mediada posiblemente por ABA. Sin embargo, el gen KAT5 no mostró sensibilidad al ABA y únicamente en casos con un porcentaje de deshidratación muy alto, próximo al 80 %, se observó una ligera acumulación del transcrito de KAT5 que no se relacionaría con la señalización dependiente de ABA (figura 15.A-B.1). Estos resultados sugerían que en la activación del gen KAT2 en respuesta a la herida podría participar ABA.

Aunque las vías de señalización activadas por ABA y JA son independientes, se han descrito interacciones entre las vías de señalización de ambas hormonas en las respuestas de defensa frente a herida y patógenos (Hildmann et al., 1992; Peña-Cortés et al., 1995; León et al., 2001; Anderson et al., 2004; Adie et al., 2007b). Con el fin de determinar si la inducción de KAT2 en respuesta a ABA era independiente de la señalización de JA, se analizó la sensibilidad de este gen a ABA en plántulas coi1-1, a las que se les aplicó concentraciones crecientes de ABA. También se comprobó la cinética de la respuesta del gen KAT2 analizando distintos tiempos después de la aplicación exógena del ABA. En el análisis Northern blot se observa que el patrón de inducción del gen KAT2 en respuesta a ABA en el mutante coi1-1 fue similar al obtenido en plantas silvestres Col, ya que concentraciones crecientes de ABA provocaron un aumento progresivo de la expresión del gen (figura 16.A). Además, el máximo de expresión en respuesta a ABA se producía también a partir de las 4 horas, manteniendo niveles inducidos a las 24 horas (figura 16.B). Estos datos indicaban que la inducción de la expresión del gen KAT2, al igual que la del

gen RAB18, se producía de manera independiente de COI1, y sugería nuevamente que la activación del gen KAT2 en respuesta a la herida a nivel sistémico era debida a una vía de señalización totalmente independiente a la activada por JA.

B

A

KAT2 RAB18 rRNA (µM) ABA 0 0,1 0,5 1 5 10 25 50 100 250 KAT2 rRNA t.d.t. (h) ABA 0 0,5 1 2 4 8 24

Figura 16. Nivel de expresión de los genes KAT en respuesta a la aplicación exógena de ABA en plántulas coi1-1, insensibles a JA.

Las aplicaciones exógenas de ABA se realizaron en plántulas de 11 días cultivadas en medio líquido MS con 0,5 % sacarosa (p/v). La expresión de los genes se analizó por Northern blot utilizando sondas radiactivas específicas para cada gen. Se incluye la hibridación con la sonda correspondiente al gen RAB18, marcador de respuestas dependientes de ABA y la tinción del rRNA con bromuro de etidio como control de carga. A. Las plántulas se trataron con concentraciones crecientes de ABA (µM) y las muestras se recogieron a las 6 horas después de realizar el tratamiento. B. Las plántulas se trataron con ABA 50 µM y las muestras se recogieron a distintos tiempos después de realizar el tratamiento (t.d.t.)

En resumen, los resultados obtenidos sugerían que la activación de los genes KAT en respuesta a la herida se produce a través de dos vías de señalización distintas. Por un lado, la vía dependiente de JA estaría interviniendo en la activación transcripcional del gen

KAT5 y por otra parte, una vía independiente de COI1/JA (y posiblemente dependiente de

4.2. Participación de KAT2 en la biosíntesis de JA en respuesta a la

In document Función del gen 3-cetoacil-CoA tiolasa 2 (KAT2 ) en defensa y desarrollo. Participación de los peroxisomas en las respuestas (página 109-114)