4 e c h n de tenninnciónt Nombre d e l t u t o r ex- terno, puestoy Pds-

f'

L

r

i

r

r

i

i

c

t:

Met

rí

cui R :

4 r r e r n :

Trimontre:

Horns

Semnnn:

PROYECTO FINAL

.

D i m e

LugeniR C P n t A

Flores.

L U C ~ P

Ylores

Roaen.

79335025

79

2371

50

J

c$3

I n g e n i e r í a Uioqufinicn I n d u s t r i e l .

aocenvo.

75 horns.

I n s t i t u t o Nncioníll de Higiene. Mnrieno Escobedo

#

20

Col.

Popotlp.

r

i

r'

L

r

1

L

P

c

c

L

r

L

c

4 e c h n de tenninnciónt

/Nombre d e l t u t o r ex- terno, puesto y Pds- c r i p c i 6 n :

/ T i t u l o

d e l Proyecto:

Asesor ( firmn

1.

30 Be octubre de

1984

2

ing.Bioau1mico

A d r i h

Nedina Garcia.

Jefe d e l Depto. de Vocunola

-

Becterinnas.

"Producci6n por fermentaci6n

de

l e

toxina d l f t é r i c n u t i l i zada en

In

elRbornci6n de

l a

vnciinn t r i p l e

DPT".

-

c

L

Proyecto

f i n a l

d e l

S e r v i c i o Social. r e a l i z a d o

p o r :

Diem? ihgenie Cnntú F l o r o s .

793350

2

5

Y

Lucfa P l o r e s

Rosas.

r!

L,

b

c

i

L

c

L c

I' Producci6n por Perment~ci6n

de

1s

Toxina

D i f t é r i c n

utilizodfl en I n

-

eloboraci6n

de

l e vncunn

triple

DPT

".

I n s t i t u t o Nacional de Higiene. Secretorin de Salubridad y

---

A s i s t e n c i a .

I -L P

-I

bbi

I n d i c e .

Ob j e t i.vo R.

I n t

r

o du c

c

i ón

.

Descripcidn d e l p r o c e s o de producción de l a Toxina D i f t k - r i c a . ( I n s t i t u t o

Nacional

de Higiene

) .

...

4

1.- C n r i c t e r i s t i c a s g e n e m i e s

...

4

11.- Etnp?s d e l p r o c e s o de produccidn

...

6

111.- ActividPdes d e s a r r o l l a d a s , m a t e r i a l e s y métodos.... b

1.- Preparncihn de m r t e r i a l e s . . .

7

1.1.- A c t i v i u a d e s . . .

7

2.- Formulacidn y p r e p a r ~ c i ó n d e l medio de c u l t i v o :J r e a c

-

tivos...

8

2.1.- Consideraciones t e ó r i . c a s : Reouerimientos n u t r i - e i o n a i e s

...

8

2.1.X.- Cnrbono...

3

2.1.7.- F i e r r o

...

10

? . 7 . - Actividndes d e s n r r o l l r d n s . Preperacidn d e l me--

...

d i o de c u l t i v o y r r n c t i v o s 1 3 1 7 -

....

.1.- I3io:imina

...

.13

7.2.3.- NaOH 10 N

...

1 5

7.2.4.- MPltosa r l 50%

...

?.5

7.7.5.- C l o r u r o de c r l c i o a l 17.5%

...

16 2.7.7.- Ríedio de Muller and M i l l e r . . . l 4

s- s:sncre,

U111

y T S A

...

16

2.7.7.-

Suero

t i t u l o

Wlf/ml.

...

17

.

e .?.P.-

N a C 1

a1 0.85%..

...

17

3.-

F r e p a r r c i ó n d e l I n ó c u l o de C.diphtheriae. Cepa

CN-

7000.

...

18

3.1.-

C o n s i d e r a c i o n e s t e ó r i c a s : C r r p c t e r f c t i c a s gene r91eF .y m o r f o l o c f u d e l m i c r o o r p n i s m o . .

....

.18

3.7.-

A c t i v i d i d e s . PropaKación de I n s e m i l l a .

...

1 9

3.7.1.- P r o c e d i m i e n t o p p r a r b r i r e l

v i

d....

20

3.7.2.- Siembrfl d e l V i a l

...

20

3.?.3.-

Puse P mPtrRz..

...

?0

3.7.4.- Pase n p r r s f ó n

...

21. 3.?.?.- P r e p u r a c i ó n d r i . i n ó c i i i o f i n a l con

----

t r r n s f e r e n c i a a l fermentador...Li. o

4.- P r o c e s o de Fermentación

...

23

4 . 1

.-

C o n s i d e r a c i o n e s t e ó r i c n s : C r r r < i I : e r f s t i c a s d e l - fermentador

...

23

4 . 7 . -

A c t i . v i d a d e s .

...

26

4 . ? . i

.-

L1enrdo Y vctt?r.iiI.znción

...

2 0

4.*..?.- Torna de mi.ip:-~~tr~s p w n veri.f'i.car 1.73 es-

t e

r

ii. i z i i c i

6n

...

?:?

4.?.

3.- I n o c i l i - c i ó n con

li!

c e p ~ de C.diphthe-- r i n e CN-2000

...

79

4.2.4.- A d i c i ó n de

la

f u e n t e de carbono:

m l - -

-

-

t o s a

2 1

50%

...3

o

4.F.5.-

A d i c i ó n d e l a g e n t e ccuelrnte: c l o r u r o

-

.-"'

..

L:

c - i'

- Í

L

I - I c c

-.

,

4.2.7.- R e g i s t r o de

los

pardmetros de l a Fer--

ment~ci6n...

...

32 4.7.8.- V e r i f i c a c i ó n de 18 p u r e m del. c u l t i

-

v o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3

4.2.54.-

Determinación de 18s unidades Lf de l a

t o x i n ? d i f t é r i c n . .

...

33

4.?.9.i.-

ConnI.derrciones t e b r i c n s :

--

Fiindr'mentos d e l

Método.,

.

.:j3

4.?.4.?.- A c t i v i d a d e s . D e s c r i p c i ó n

d e l

mQtodo..

...39

4.7.Q.3.- i i j e r n p l o de deterrninncinn de- unidpdes Lf...42

5.- S e p v r ? c i b n d e l Producto.

5.1

.-

C o n s i d e r p c i o n e e t e ó r i c a s : P i l t r r c i 6 n y desto- xif'ic:>cibn.

...

44

5,.

.

n

.-

A c t ivid:-cles..

...

. 4 4

”. .

1

r.

L .

r.

I

-C

C.

-.

I

I

O b j e t i v o s .

-

1

.-

ViriculDr _{l o s} c o n o c i m i e n t o s t é ó r i c o s a d r a i r i d o s

duran-

t e 1;. formrcidn Pcadémice!; con l a t e c n o l o g í a invo1ia.-- crada en l a producción p o r f e r m e n t a c i ó n de

12

t o x i n a -

d i f t k r i c a u t i l i z a d a en l a e l a b o r a c i ó n de l a vacuna

--

t r i p l e

DPT.

T

.-

D e s a r r o l l a r lr> capacidad para. t r a n s f o r m a r intearnlmeg

t e l o s r e c u r s o s n a t u r a l e s r e n o v n b l e s y l o s no renova- b l e s a t r a v é s d e l a i s l a m i e n t o , a n á l i s i s e i d e n t i f i c a -

c i ó n a p a r t i r de é s t o s , de s u s t a n c i a s con actividad-- f a r m r c o l 6 g i c a , aprovechstbles en e l d e s a r r o l l o de l a

-

i n tiu s t r i R nu f rn i c

o

f a r m p c eú t i c a.

( contemplPdo en

l o s

o b j e t i v o s g e n e r ? l e s d e l P l a n de-

e s t u d i o s de l a L i c s n c i r t u r P de l n g e n i e r f r l!iooufmica I n d u s t r i a l )

.

3.- ik!:?cri~t>ir

e l

proceso de producción vue :;e renlizFi en-

el. I n s t i t u t o Nricionsl de IliEiene y e f e c t u a r

un:)

r e v i -

s i d n b . i b l i o f < r A f i c r sobre e l terna. E s t o con el. pro--

p ó s i t o d c r e a r un antecedente m e sirva como base

--

p ~ r ’ a trab:) j o s p o s t e r i o r e s , qui76 de i n v e s t i g s c i ó n ,

--

flue sdrn d e s a r r o l l p d o s p o r o t r o s comp:iReroc de 18 Un2

2

I-.

c

I

c

c

...

c

-.

I n t r o d u c c i 6 n .

(Irii:inr>lmrnte

I n

1,oxi.na d i f t é r i c n ne obteníri eri e l

-

Xnsti,t;uto Nnci.on(,l de l l i g i e n e d e I r S e c r e t a r f e dr :hiubr&

dnd y A s i s t e n c i a por medii0 d e l c u l t i v o e s t a c i o n e r i o . De

-_

b i d 0 P Ln c r e c i e n t e demmda d e l producto, que se r e q u i e r e

p a r a 1~ e l n b o r ~ ~ c i 6 n de In vrcun8 t r i p l e D I T , e l p r o c e s o

-

r c r i i l t b i m p r A c t i c o

e

i n s u f i c i e n t e .

En

1981

j u n t o con

-

1.a c o n s t r u c c i ó n d e un nuevo e d i f i c i o para e l Laboratori.0- dc f e r n e n t a c i o n e s .y l a adquisici6:r de fermentadoroc de l a

Kew brimswick S c i e n t i f i c Co., se r e a l i z a un cambio a cul- t i v o c!irner~:ido, con l o que se e s p e r a w t i s f a c e r l a c r e

--

c i f n t f i d i i m n n d : ? .

h i c i r ' l m r n t e

e l

p r o c e s o de producción se be36 e n ln- tecni?l.<:,!?ln e m p l e a d a en e l R i j k s I n s t i t u t Voor de Volksr>;e$

,

de l o s p n f s e s b:?jos.

Zl

empleo d e l

zontiheid ( H I V )

medio de L i n g g o o d p r e s e n t 6

In

üesventnja de oue su. prepo-

r a c i d n e r a cnmplicada 9;' r u e i n v o l u c r a b a l a reinosión

del-

ccbo d e l a carne de _p;:mado vncuno ( f u e n t e de n i t r d g e n o )

y su p o s t e r i o r d i g e s t i ó n ; adem& d e b i d o a O U E l a m i i d a d -

de Ir cprne n o e r a siempre l e misma,en o c a s i o n e s s e obte-

n f n n l o t e s de t o x i n 7 d i f t é r i c a con v a l o r e s

a l t o s

de uni-- dades

Lf

y en

o t r a s ,

l o s u a l o r e s eran muy b a j o s .

( b )

O t r o i n c o n v e n i e n t e d e l p r o c e s o _{l o} c o n s t i t u f a e l he-- cho d e que

13

e s t c r i l i x i c i b n d e l medio SE t e n l a nue h r c e r

p o r f i l t r a c i ó n , y a flue s i se h c i a c a l e n t a n d o con c o r r i e n t e de v:-ipor., s e podf:.n d e s n P t u r a i i a a r 1 ~ 1 s protcjfnas de l a

3

de e s t o s problemos se h i c i e r o n e s t u d i o s y m o d i f i c a c i o n e s s o b r e 1;odo en l o vue B C r e f i e r e R l a f o r m i i i s c i 6 n y preps-

r n c i ó n d e 1 medio de c u l t i v o . h r n n t e un tiempo se _cRm--

b i d

l a

f u e n t e d e n i t r 6 g e n o ( cprne de t e r n e r a

1,

p o r

los

6 c i d o s c r s a m f n i c o s de l a marca D i f c o , p o s t e r i o r m e n t e fue-

ron

d i f f c i l e s de o b t e n e r

por

l o

nue se cambió a o t r a

---

f u e n t e de n i t r ó c e n o conocida como b i o m i n a de

Ir

m:>rcR

--

b i o x o n , flue e s e l r e a c t i v o m e se u t i l i z n nctunlmente.

--

,

Los dem$s c o n s t i t u y e n t e s d e l medio responden a l a s n e c e

-

s i d ? d e F de 1~ c e p a C . d i p h t h e r i a e

PW-8

CN-3000 nile se don6

en Pcr.rr8 l i o f i l i z 7 d n de Cuba. En e l

RIV

de Fiolanda l a

-

crp:. US:?^? e s I n de Park W i l l i a m s no. 6 ( PW-?,

)

m e fue-

ot:teniri- d e 1.1.1s l . ~ ~ b o r o t o r i o s Well.come Reoenrch y est6 m z r

c - d p CO’110 CN-?000.

_-

e

D c s c r i n c i b n d e l p r o c e s o de produccidn de 1.a T o r i n a D i f t é r i c n . ( I n s t i t u t o Nncionpl de Jiipi.ene

1

-

c ).

L. , ._ .. . -I

._

C", -. I L I -. c

-

I 7

.-

-.

L c

-

-

-. _I< "_ ,I. __

-

I _

-

-.

1.- C a r - c t e r i s t i c n s p e n e r r l e s .

E l p r o c e s o de o b t e n c i 6 n de 1 r t o x i n a d i f t é r i c a oue

-

se i ~ i , i l . i z ? en P I I n s t i t u t o N n c i o n c l de I l i c i e n e p e r t e n e c e

n l t i p o de ferrnentpcibn bíitch, cuy:as c r r n c t e r f s t i c n s

--

enuncin Atkin-on (') en

1974.

1nvol.iicra invariablemen-.,

ti- 11ri:i s c r . i c d e pnsos i i s o c i r d o c con e l d e s : i r r o l l o dc!l

--

microorir n i m i o , dosde 1~ c c p n o r i c i n p r i a o v i a l ( n r e pn-

r n r i o 1 j o ! ' . i ~ i:T.icio )

,

nnswicio p o r

su

dcsnrroi.io en CiRFr

--

inri I~ri:>(io, m - t r n z n c : i t n d o y f'in:>lriente

por

Ir siernbr:! de

1.3 :;cmill,? yropngrda en I r etnpn de producci6n. Ln

pri

-

m t ' r n f a s e i m p l i c a l a p r o p n p c i 6 n sobre Ir s u p e r f i c l e de-

un

niedio e s t é r i l , f o r m n d o

p o r

n u t r i e n t e s , y oue adem4s

-

e s só1.ido p o r 1.73 ~ d i c i d n de a p r . fin l a segunda fese,

un? p o r c i b n d e l c u l t i v o r n t e r i o r s e t r a n s f i e r e , u c m d o

-

iinn T S P estéril P un rnitrnz erlenrneyer de 500 rnl conte

-

n i e n d o 100 m l de medio l f m i d o de X ú l l e r rnd M i l l e r , se-

i.ncub:- en iin s p i t p d o r r o t a t o r i o í' l r s s i f y i i e n t e s rondi..--

r!i one s : ?O0 rpm/ 35OC/ lrlhr.

Con c.11 d e s r r r o l l o o b t e n i d o en e l rnntrnz se i n o c u l r n dos- pari-afonrn tie 4

i

c u e

s o n

incubndos íi 1.25 rprn/35 C/24hrs

i,n ::emill;. n u e s e o b t i e n e e s t a p r o p a c ~ c i 6 n sj.rve

CO-IIO i n 6 c i i l o d e l fermentador de 70 1 n u e se usn en e l

--

p r o c e so

.

O

"'1

...

. &

c . ,

.

..

-.

6

d e l p r o d u c t o son d i f e r e n t e s en l o que :i temper:itur?, p1.i

y Crndo dc a i r e a c i ó n y a g i t a c i ó n se

refiere; p o r

1.0 que

puedj s e r n e c e s a r i o c w b i r r e s t o s prr5metros de opera

-

c i 6 n durnntc e l p r o c e s o de fermentación, en tmse :I 1.a

-

c i n k t i cn observnda durante su desnrro1.l.o.

11.- Etap:?s d e l p r o c e s o de producción.

En e l s i g u i e n . t e cuadro s e d e s c r i b e n l a s e t z p o c del.

p r o c e s c de producción de l a t o x i n a d i f t é r i c a COCIG zr?

--

r e a l i 7 , g en e l I n s t i t i i t o N a c i o n a l de H i g i e n e .

( Cundro no. 1 j .

111

.-

.Ac t i v i d ? d e 6 de 3 n r r o l l a d n s

,

rn:? t e r i : 11 e $3 y rii6t odor,.

J,:as a c t i v i d a d p s d e s a r r o l l n d n n durante

EL

s e r v i c i o soci:.l f u e r o n

1.3s

r e l n c i o n n d a s con e l p r o c e s o de prvduc-

c i ó n tic I n toxinri d i f t 6 r i c a .

En

l o s i n c i r : o s d e l 1-5

se detril.1an I n s a c t i v i d a d e s r c n l i x a d n n _{a n i} como Ins r e s -

1

T''

Cuadro n o .

i

: Etapas d e l p r o c e s o de produccidn de l a

-

t o x i n a d i f t e r i c n . ( I n s t i t u t o hircional de H i g i e n e ) .

1.- P r e p e r a c i ó n de

ma-

t e r i : ? l e s .

7.- Formulación y pre- p a r a c i ó n d e l medio de- c u l t i v o y r e a c t i v o s ~

3

.-

P r e p r r x c i ó n d e l

i n ó c u l o de C.diphthe

-r i - i e cepa C N - X " . 2 s

Contro.1 de

4.-

P r o c e s o de f e r - l a e s t e r i l i

-

r n e n t ~ c i ó n . h u i p o : z a c i ó n y

ve

fermentad o r e s IF-70

r i f i c a c i b n - hew Hruswick, capa-

de 1.3 pure- cidnd nominal 50

1.

7a d e l cul- tiempo: 64-72

hrs.

t i v o cada

-

24 hrs.

5.-

Separación d e l

p r o d u c t o p o r f i l t r a c i ó n .

b.- Elnborncidn de l a va-

cuna IlPT.

7

.-

Acond.icionomiento.

De

t erminri c i 6 n de

18s irnidades l f -

de _{l a} t o x i n a d i f

-_

t é r i c p

cr-ida 34

-

7

1.- P r e p n r : ~ c i ó n de m o t e r i n l e s .

1.1.- A c t i v i d a d e s .

Las R c t i v i d P d e s d e s a r r o l l a d a s son:

a).- P r e p r r a c i ó n de p i p e t a s F a s t e u r y compresas de

-

algod6n _y gasa p a r a a b r i r l o s v i a l e s .

b).-

P r e p r r a c i 6 n de m r t r n c e s y g a r r a f o n e s con medio

de c u l t i v o m o d i f i c a d o de M ü l l e r and M i l l e r p a r a

l a

propa-

g r c i 6 n de In cepa de C.diahtheriae CN-2000.

c )

.-

Prepnrnci6n de e q u i p o s d e l

no.

8

( Ver f i m r a

-

no. 1 por:. q d i c i o n n r i n 6 c u l 0 , m r l t o s a y c l o r u r o de c a l -

c i o n lo:. fermrntr,dores

1P'-70

New Urunswick.

d).- P r e p ~ r n c i 6 n de tubos de ronca y p i p e t a o para

--

I n determinPci6n de 18 r e a c c i 6 n t o x i n a - a n t i t o x i n a , con l a

que s e c u p n t i f i c a n l a s unidades L f ( unidades de f l o c u l a -

c i 6 n ) 'de Ir t o x i n a d i f t é r i c n .

e )

.-

E ~ t e r i i i e a c i ó n de l o s r n r t e r i a l e s .

temperatura

-

-

l?1°

p r e s i ó n

-

-

1 5

lb

Figura

no.

1 -

G a r r a f ó n

,y

m a t r a z

e r l e n m e y e r con

trnns-

f e r e n c i p

a l

f e r m e n t p d o r .

2.- Pnrmuirción y p r e p ~ r q c i ó n d e l medio de c u l t i v o y

-

r e g e t L V O S .

? . I

.-

C o n s i d e r a c i o n e s t e ó r i c a s : Requerimientos nutri-- c i o n r l e s .

Drew g Niueller ( d i s e q a r o n un medio completamente d e f i n i d o ,

~1

c u a l soportn e l c r e c i m i e n t o y 1íi prodiicci6n

d e .toxin3 r p o r t i r de

12

cepa PIV-8. Contiene b-alnnina,

6 c i d o n i c o t í n i c o , 5 c i d o p i m é l i c o , c g s t i n a , g l i c i n a , v a l i -

n:., I.eiicin?, m e t i o n i n n , p r o l i n a , á c i d o g l u t á m i c o , t r i p t o -

f a n o , i h n :irnonio y spies de m a w e s i o , c o b r e , c i n o , rnr,ngr-

n c s o v fierro. E1 medio de h i d r o l i . z n d o de cnseín-, de--

i t u e l . l ~ r r n d P i l . l e r ( 4

1

e s m+s p r á c t i c o , e i t 6 norrnnl.men- t e m o c i i f i c r d o p ? r r rue se l e piic3d;i a d i c i o n r r ElutnmF!t»,

-

p ~ ~ r i t o t o n s ~ t o y t r i p t o f r n o (

w c

) i o c i i r ~ i tom:$ e n cirent:i

1 9:; n í ~ c i ~ . . i i l : ~ d e : . d e

un:!

grrm v : , r i e d e d de cepas.

C i e r t o s Erupos de C o r g n e b p c t e r i a no pueden c r e c e r en

e p t o s medios R menos vue 1- t i n m i n ? trmbikn e s t k !lreEente.

),e

la:; cep: s normrlmrnte u t i l i 7 , ~ d a s en e l 1Pboratori.o de-

Lrne K:Arks;dr<le ( U n i v e r s i t y School o f m e d i c i n e :mi inedi--

cr.1. ccnt,er

of

New York ) , s610 17,s cepns i n t e r m e d i p s de--

j ; , n <ir c r p c c r en medio I ' G T

rn:<:;

t i 5 , m i n R . Iirtr, e t r i l o b t u

v i e r o n u n c r e c i m i e n t o r:i:T,on:ibl.emrnte biieno de ceppr;

i n t e x

m e d i : , ? rohrc- medio PGT í i i cii:,l r d i c i o n r r o n - c c t n t o y I.Rc- t:il.o. R i i i ( i i . 1 c r :-n (!ohen c n c o n t r r r o n nut: (:1 ~ ( : - L ~ c J o l e i c o -

:!umentó e l t:'m,?ío dri

1.

7 c o l o n i ? ? d e C.diphttieri:..e crc- .-

r i e n d o r o h r i ~ un medio s ó l i d o . F r r n e l n i s l v i i e n t o y 1n

c - , r - c t e r i : - , c i ó n de c o l o n i a s de c o r v n e b r c t e r i n g para l a

--

produccihn c o m e r c i n l de t o x i n ? ( con r:'ric e x c e p c i o n e s j s e i i t i 1 1 ~ 7 n medio- complejos.

~.

9

2.1.1.- Cnrbono.

L o s b n c i l o s d i f t é r i c o s son o r g m i s m o s a e r o b i o s f p c u l - t p t i v o s y e s b i é n c o n o c i d o nue Ir f e r m e n t a c i ó n de l a @U--

cosn por C.diphtheriae conduce a l a

formnción

de sibstan-- ci:.n b n c t e r i c i d a s en

e l medio l f n u i d o de c u l t i v o .

s i n

_-

emb.-.r.h:o c u m d o s e p r o p o r c i o n a rnaltosn como f u e n t e de cner-

gfe l o s n i v e l e s b r c t e r i c i d n s de fícido no s e producen. ( 7 )

e x p l i c a de manera s e n c i l l a e e l empleo

( 8 , )

Van Iiemert

de l a maltosa como f u e n t e de carbono, mencionn que de acuez doa Tn:,mnn y Brandwijk

I

1937-40

1,

en c u l t i v o s de C.diph

-

t h e r i a e l a g l u c o s a s e c o n v i e r t e rRpidamente

en

á c i d o s c a r

-

b o x f l i c o s ( t a l e s como: f ó r m i c o , a c é t i c o , p r o p i b n i c o ,

l á c

-

t i c 0 .y s u c c f n i c o ) y tpmbién se d e t e c t a l a p r e s e n c i a de et- n o l . Curndo s e emplea m a l t o s a , l a formaci6n de á c i d o s c a z

b o x f l i c o s e s l e n t a y a que e l rompimiento de e s t e riisacBrido en plucosn c o n s t i t u y e un paso i i r n i t m t e p a r e SU formaci6n.

( : » n n i i i , i I f n i i o ~ t : todn

l:~

,qlucosa e l PI1 s e n i v e l a . La

íorma-

c i 6 n d e 3 c i d o se c o n s i d e r a una verdndera des:?similaci6n

---

fermtint;ritiv-). cnquemn df! c o n v e r s i ó n de l n m:iltosn O D

-

sen c i

1

l , o :

co

+

II*O

3

2

p l u c o s a

---

ác. c p r b o x f i i c o

---

m a l t o s : '

---

1

y e s c l : > r o oue e l pH se v e i n f l u c n c i n d o p o r l a s tasas de

--

produccinn de I n s r e a c c i o n e s

1;

2 y

3.

L? r e a c c i ó n 2 e s

-

12 !n?s rfipida, por l o n u e

l;!

z c u : ~ ! u l ~ c i 6 n de 6 c i d o s w r b o x f -

l i c o c depende de cue tan rApidnmente s e añnda g l u c o s a y de-

m e tnn rApidnmente s e o x i d e n los; ~ c i t l o s c p r b o x f l i c o s ; e s t a

i l l t i r n r a ctnp? depende a su v e z de l n d i s p o n i b i l i d a d de o x í g e n o l i b r e , l r i cii:-.l e s b o j 7 c i i : ~ ~ d o l a a i r e a c i ó n es bajn. (

asf

se-

10

Debido R que

1-

.Las8 de c r e c i m i e n t o t i e n e lugar

n

un

pli difcr(.rití:, no S R vk ;ifect;id;?

p o r un n i v e l b a j o de :.ireg

cihrl. _1';: p r o b n b i e o u e h ~ y r conccci6n e n t r c

1.0

deoasjrnilg

c i ó n (ir! l o s c n r b v h i d r n t o s y In producción dr t o x i n n .

?.1.2.- F i e r r o .

( 7 )

G.L. Eichhorn

llam6

a.1 f i e r r o e l

más

v e r s 5 t i l de to-

dos l o s m e t a l e s bioqufmicamente F e t i v o s . Un problema

--

que cixiste en Ir producci6n de t o x i n a d i f t d r i c a p a r a l a -

r l a h o r a c i 6 n de t o x o i d e e s e l mejoramiento de l o s reridi

--

m i e n t o s de t o x i n a , e l f i e r r o e s un elemento que se encueg t r n e n t r e l o r m e t a l e s importante-: p r r a e l c r e c i m i e n t o de-

C.di.]?hI;hí:riPe _{y ?} que e s e s e n c i n l p n r a su c r e c i m i e n t o y e l

i n d r i r n o c r r c i m i e n t o e s n su v e z n o c e s n r i o p a r a obtenq!r un-

mfixiixo rtsiitiiviento de t o x i n a

.

Xn

1 9 3 1

Locke y "I:-in, y en

lc!??

I ope, r' p o r t n r o n nue e l f i e r r o en grandes concen-

t r F c i o n e s t i r n e un e f e c t o i n h i b i t o r i o s o b r e l a producci6n

de I? tioxina. E s t o s i n v e s t i g p d o r e s emplearon medioi-:

--

cornple,j,or en s u s e s t u d i o s .

t r a b a j a r o n con

-

un rne aio d v f i n i d o e independientemente d e s c u b r i e r o n e l

--

e f e c t o i n h i b i t o r i o d e l f i e r r o s o b r e 1.a produccidn de

to--

xinn. :,:-:t-s o h s e r v n c i o n e s i n d e p e n d i c n t e s d i f i e r e n en _{a l}

menos un punto irnportnnte. Toric t r a b a j d con un medio

--

comnlcso ccntcnivrido

atentes

m i e l m t e s

en

e l que e l e f e c - t o d c l f i e r r o sobre 1.9 p r o t i i i c c i h de t o x i n n no f u e drarná-

t i c o . l'?i-,rtmhvimer us6

un

iriedio di f i n i d o en e l i.uo se

-

ncAcer,itó :'tiici o n ? r menos f i e r r o p P r a r e d u c i r e l rend.iniien I

t o de t o x i n ? . Curndo un e x c e s o d e i6n c a l c i o y f o i f r i t o - ( 7

1

En

1 9 3 0 Pappenheimer y Johnson

11

e s t 6 n n r e s e n t e s en un medio d e f i n i d o ,

e l

e f e c t o i n h i b i t o - r i o n o c?? t p n dramático,

es

1:. conciuoi6n nue r , ~ o b t i e n e

d c

los

e x p e r i m e n t o s de Pope y Prppenheimer y con est:i in-

f o r n r c i 6 n e.;

cl.?ro

nue e l f i e r r o n u e l e t a d o no i n h i b e I n

-

:>ro{,i.iccihti d c t o x i n a cn c l m i m o p a d o oiie l o iirice e l f i e

-

r r o l i b r e .

Ldwors y Seamer eximin,.ron e l e f e c t o d e l

i6n

f e r r o s o y

f k r r i c o cobre e l c r e c i m i e n t o y prodiicci6n de toxin:'!.

h

&

contrnron

nuc

1 c s formps f e r r o s a y f é r r i c n f u e r o n b i é n

--

aceptrldas p o r o r p n i s m o s flue produjeron t f t u l o s f i n F i e s

-

s i r n i l i r e s de t o x i n ? . S i n embargo p a r e c e que e l i 6 n fe-- r r o s o e j e r c e m X s r 8 p i d o su e f e c t o s o b r e l a s í n t e s i s de

to

xinn nue e l

i 6 n

f e r r i c 0 ( en e l p e r i o d o de c r e c i m i e n t o

) .

Ver C u - d r o no. 7 . Así esto-: a u t o r e s s u g i e r e n oue " nui-

:.á s ó l o e l

16n

f e r r o s o

e s

i n h i b i t o r i o y nuc e l

i6n

férri-

c o r c n u i e r e s e r c o n v e r t i d o it I n form? f e r r o s n Par:> e j e r

-

c e r si1 e f e c t o " .

Tic11 o h r e r v 6 curvRs d<: c r o c i m i e n t o de p o b l r c i o n e c de- t r e s cenrin d e hr'cilos d i f t d r i c o s nut? c r e c i e r o n inici:tlniey t e r n . n i . v e l o s d e f i e r r o :~decurdos, PPI':' oue ne d i v i d i e r a n

P su r n a ~ y i . m ~ ~ u, p o s t e r i o r m e n t e

lqv6

I n s cél.ulrrs y l ~ s

cul-

tivó

niit?vimen.te en p r e s e n c i r de 0.15 ii~g de Pe/ml de medio

y en medio a l cue n o a d i c i o n ó f i e r r o . Ambos grupos de

-

c é l u l n s p r e s e n t n r o n u n a f a c e l o g de c r e c i m i e n t o , p e r o

--

s61.0

12s

oue c r e c i e r o n en arcsenci;. de 0.15 ug de Fe/ml

-

de medio p r e s e n t - r o n 1 8 rnáximr u f i j n d p p o r

é l

en su ex--

yerimento. Cunndo c u l t i v 6 l a s t r e s p o h l p c i o n e s de b a c i -

l o s d i f i . h r i c o s en pr e n c i r de 1 . 0 , 0.075 y 0.0 u g de-

1

Cuadro no. 7 : P r o d u c c i ó n de

t o x i n a

p o r PiV8 s e m i l l R CN-2000

c r e c i e n d o en un

m e d i o

con d i f e r e n t e s c o n c e n t r p c l o n e s tie

--

i one F (

h)

f e r r o s o s v f é r r i c o s .

- .

l h p t i p o d e Amt de

r f i r o

up?m€.

i 6ri.

A f e r r o so 1.34

L

u

f ‘ 4 r r i c o 1 .?7

-

C f e r r o s o 0.55

-

I

”_

D f

érr

i c o O

.R5

-,

p o r hora 6 1 2 1 8 2 4 30 ₃₆ 42

48

0 0 0

3

7

27 4h 5 4

( 8 )

Amt d e t o x i n a

0 1

₄

17

73 35

55

OH

O

O

O 55

98

133 1 6 4 176

0 4 1 2

31

58 7 4 97 108

R e x p r e s n d o cono unidode!: de f l o c i i l p c i 6 n

(Lf)

p o r m i l i l i t r o

h d c K i i r : , r ( l c : wid S;r:.mer ( The 1 l r J t P k P o f i r o n by Cor.ynobnc-- t < J r i u r n i i i . u h t h e r i n e Erowing i n submerged c u l t u r e )

1 2

-.

L

F-

ir

....

I I' F. 7-r rii r:p r:n d i 6 t ?rn\-iic?n en me d i r , dv sf eri':'t ? d

o

; o iiservd

nue ~ 1 . crecimic:nt.o nile preocntnbnn ern

c l r e l ' l e j o

dfi ].no

r e s e r v p s tie Fe de 1 9 s c k l i i l P s de ced:. p o b l ~ c i 6 n (

V e r

--

fipm:r no. 7 ) . En 1 ñ f i g u r a no. 2 e s e v i d e n t e que l a -

p o b ~ I a r i 6 n con m5s Ire de r e s e r w e s C R ~ R Z de incrementar-

s e en su d e m c i d n d 6 p t i c n ( e o u i v p l e n t e R d.or dimensio--

n e s ) ? Funnue a una u más b r j ? m e 13

n o r n a l .

CuPndo

-

e s t 7 u c é l u l a s s e o b s e r v r r o n 21 m i c r o s c o p i o f u e r o n mucho-

mAs K r " n ( i e s c u e 1 7 s c k l u l ? s norm-les, no se d i v i d i e r o n

-

p e r o .prr::tant?ron muchi. e l o n K ? c i ó n . E l frric,-co de ret- so cri 1.r d j . v i s i 6 n ;Jnr'?Ce ::er cr,iis:.do p o r e]. . p e r í o d o de

-

p r i v r ' c i h ( hnmbre ) de f i e r r o p o r e l n u f i í i t r n v i e c ? n I n s

... .

,,.,

.. I

._

c

.-

-

-" i

-

L

c

I-

-.

,

- I ₁

._. a-

I

minutos

nue

s i g i e n a 18 reous-

pcnsidn en medio d e s f e r r a t a d o .

t ox+

1 3

7.7.- A c t i v i d r d e s d e s a r r o l l a d a s . P r e p a r a c i ó n d e l medio- de c u l t i v o y r e a c t i v o s .

c

I L.

c

2.3.1.- Hionrnina.

Sil f o r m u l a c i ó n e s i r s i g u i e n t e :

Órden de i n g r e d i e n t e s . fdl

1:ioni.iinr ( nz canse t t )

...

33.33

Nn,HPO

...

1.3

KH

₂

?O

4

₄

...

0.43

C R c l 7

...

1.3

Ama

d e s t i l n d a

...

depende

-

de 1. c r n t i d a d de medio de M ü l l e r and ! r i i l l e r out? se va

-

r p r e p a r a r . Se u t i l i z p n

1 5

1 de boamina p o r cada 50

1

de medio.

Pre

o ,- rn c i

6n.

.An hiowninn se Tifiadea ñproxim7dsmente

_-

1 5

1 d. agua- dcstilncin ( o a l a c a n t i d a d n e c e s a r i a s e n i n i o n l i t r o s

de medio p r e p a r r d o s ) aue previamente

h m

s i d o c a l e n t a d o s

a 60' C ,

se

r f : i t ñ h a s t ? d i r o l u c i 6 n complcta.

Se rilrden rmbos f o s f r t o s , p r e v i m e n t e o i s u e l t o s en

-

agus d e s t i l a d a p o r sep;rrndo, s e c r l i e n t a hnstFc

79

C, se

-

o j u s t ? e l pH R

9.3.

>.Finalmente s e :,Ende e l c l o r u r o de-

c p l c i o , tnmbién d i s u e l t o en 3guu:l d i ~ s t i l n d a y s e e l c v a l a - O

t e m p e r - t u r r h a s t ? 85'

c.

-a.

-...-

...,-

..__

.,. ,

;~proxi.rnrd:mrnte ) s e r e c o l e c t r t e l sobrenadnnte m e e s l o

?u(? rc u t i l j . z , o p n r a e l medio de c u l t i v o .

2.7.3.- %/ledio de \ : t i l l e r m d M i l l e r .

S u f o r m n l a c i ó n e s

l a

s i g u i e n t e :

g/l

6rden de i n r r e d i e n t e s .

NR

HPO

...

1.0

7 4

N n C I .

...

0.8

D"&O

.7H

0

...

0.72

€3- P 1v.n i n a

...

O .O

11

5

6ci.do r i i c o t í n i c o

...

0 .O115 R c i d o p i n i é l i c o

...

0.00584 CuS04.5H20

...

0.005

ZnSO

.-/HZO

...

0.005

h C 1 2 .

4H

O

...

O .O05

L - c i s t i n n

...

0.2 CaCl,,.;'H O

...

O .O96

clorhidrato de tizrnina

...

O .O0048

hici-mi.i? (

P(%

c:'sr:e

TT

...

1 5

1

/

50 1

4

7

4

7

, . ?

de rncidio.

A p i n d r i s t i l ~ d -

...

se

i i t i l . i : < n

-

1 n ri,nuerid:i p n h s e r l número d e ferir:c!nt:1dorc::: ( cr,nnci-

d r d nominn'l. 50 1 n u e eihkn operrndo

m 6 c

unos l i t r o : . ; mAs

p a r ? l l e n i . , r l o s m r t r p c e s y g:arrs3fones m e s e emplear1 en, ,-

I ...

i

, *, ...

” L ..

- .

.”.

-.

1 5

Z l

pH de

Ir

bioamina se b n j a a 8.2 con 6 c i d o a c é t i -

c o h r s t n e l momento dc u t i l i e n r s e . C F d a uno de l o s

--

r e ? c t i v o s s e d i s u e l v e en e l s o l v e n t e adecu-do y se

van

-

,o”i-ciiendo a l tanciue m e z c l r d o r en e l 6rden e s p e c i f i c p d o . Se ,-fora con rgua d e s t i l a d a h r s t a e l voldm<m r e n u e r i d o .

F11 p H d6.l medio s e ? j u s t a 8 7.6 con h i d r ó x i d o de s 2

d i o 10

PI.

A c o n t i n i i ? c i 6 n s e mex:, una _forrar de 6rden de con- t r o l <ir! iirodiicci6n, l e c u r l debe l l e n o r s c i cndr vr17, oue

-

SF preprirr. un l o t e de t o x i n n d i f . t d r i c R .

Su forrnulrci6n e s l r s i g u i e n t e :

N r G H

...

400 g

Amin d e s t i l a d a

...

l a nece

-

sarin nrr:? . - f o r m a 1GOO

m3..

F r e p r r - c i ó n .

c

-

._

I

- -

c

... .

Se t r n t r d c un? s o l u c i ó n al’or:jd?. Se emplee para- aju3t.r

&l

pH

de

In

s o l . de b i o m i n a y d e l medio de ciil-

t i v o curndo e s n e c e s g r i o .

Su forrnuloción e s I n r i g u i e n t e :

r .

" .

_{I .}

" ,

Lot e 9 A Cant $ d ed

33.33

.-

4

1.3

7.43.

1.3

--

---

< .

1 b

-I

Agua d e s t i l r d a

...

l a

necesa-

r i r p a r a

o f o r r r

a 100 m i .

” L

Pi,eparnción.

_..

- -

I-.

...

La

--.

Se t r a t r de un? s o l u c i ó n a f o r a d a . Se emplea como

í‘uent e de cPrbono.

2.2.Yi.- C l o r u r o de c n l c i o a i

17.5%-

Su f o r m u l a c i ó n e s

l a

s i g u i e n t e :

C R C l

...

. . .

12.5

e;

Ami? d e s t i l a d - .

...

l a necesa- r i a p ? r a ::forr’r a 100

ml.

2

P r e p a r a c i ó n .

Se t r a t a de LUIR s o l u c i ó n e f o r n d a . E s t R concentra-

c i ó n se emplen para 50

1

de medio de c u l t i v o

,

pornue

--

p o r

crdn l i t r o s e deben r d i c i o n a r 0.35 p; de c l o r u r o de

c a l c i o ( 0.25 g x 50 =

12.5

g

1.

La

s o i u c i d n se emplea

como a g e n t e o u e l r n t e d e l f i e r r o p r e s e n t e en e l medio.

7.2.6.- Tubos con medio de t i o g l i c o h t o , g e l o s r sPngre,- B H I _y TSA.

Son p r o p o r c i o n a d o s a l l a b o r a t o r i o de fermentaciones p o r e l Ilepto. de medios de c u l t i v o d e l i n s t i t u i o . Unica- mente se v e r i f i c a su e s t e r i l i d a d a n t e s de u s a r s e . Se

-

c i ó n de l o s f e r m e n t r d o r e s y pnra v e r i f i c n r l a pureza d e l

c u l t i v o R medida oue avanzr e l p r o c e s o de fermenkación,

6 F t r filtirna pruebn s e

r a l i m

cnda

74

hra.

?.?.7.-

Suero t i t u l o _50.

Es proporcionado

a 1 h b o r a t o r i o de f e r m e n t a c i o n e s

-

p o r e l d e p t o . de Sueros d e l I n s t i t u t o . U n i c m e n t e se

-

d i l u y e c o n c l o r u r o de

s o d i o

r l

0.85

$

para o b t e n e r e l

--

titulo

deseado y

se

v e r i f i c r su e s t e r i l i d s d a n t e s de us-

s e . Se emple? p8ra d e t e r m i n r r 1,"s unidpden

If

de l a t o -

xina

d i f t é r i c n producido p o r e l microorganismo, l o prue

-

ba s e r e r i i z , r C Z ~ R 74 h r s .

7 . f . P . -

l ' i ~ C l ~1 0.85

$.

Su f o r r n u i r c i h e s

l:>

s i p i e n t e :

N R C l

...

0.85

g

A w ? d e s t i l r d a

...

l a necera-

r i p p r m

;.form

a 100

ml.

P r e p a r P c i ó n .

Se t r t p de u n a s o l u c i ó n v f o r n d a . Se emplea p?ra

-

d i l u i r e l suero u s r d o en l o d e t e r m i n ~ c i d n de l a s unidades

18

- I

I,

-.

P I

3.-

P'r.epr'r:lri6n d e l In6ci11o d r C.diphtheri8e. Cepa

-

C1~-?000.

?.i.-

C * a r r c t e r i s t i c R s g e n e r a l e s y m o r f o l o g f e d e l rnicro-

o r k r - n

I rmo

.

S e q h 3 r r k s d n l e (

'

C.diphtheriae e s un8 d e s i g n r c i 6 n

c o l e c t i v a pxrn

l o s

miembros d e l g é n e r o Corynebacterium oue

for1 cap-ces de p r o d u c i r en. l o s s e r e s humrmos pseudomembra- nao cue s e e x t i e n d e n sobre

1ss

rnembran-s mucosas y en 13

-

p i e l ; plgunrs v e c e s _causan s e r i a s o b s t r u c c i o n e s en

1

.

1 9

-

r i n c e y en l a trñouen, 1 p s i n f e c c i o n e s r a r a s v e c e s ocurren

e n Los nnirnales.

T r l c r e c i m i e n t o

e s un? e x p r e s i ó n de l a

v i r u l e n c i : ' d e l b : * c i l o d i f t é r i c o y e s t 6 relracionadn con Y - - ciiertas D r o t e f n p s y componentes l i p o i d i c o s e s o c i n d o s con

-

sus s u p e r f i c i e s .

kin 1~ n o t u r a l e z n C.diphtheriae s e encuentra en e l

--

sictenin r e ? , p i r r t o r i o , en l r s h e r i d p s o en I r p i e l de per-- sonss i n f e c t a d ? ?

o

de p o r t a d o r e s normnles. A p m t i r de

-

a h í , Pos b p c i l o s s e diserninrn p o r g o t i t a s

o

p o r c o n t e c t o

-

d i r e c t o ? l o s i n d i v i d u o s i u s c e p t i b l e s . L o s b p c i l o s v i r u - l e n t o s c r e c e n en l x s mucosss y empiezrn a p r o d u c i r t o x i n 8 d i f t E r i c a cue e s w1 p o l i p é p t i d o t e r m o l A b i l ( PM 6 2 OQO

)

-

niie niiede s e r l e t 2 1 n

18

d o s i s de 0.1 up/kg (

'l.

pracc-so f e r m c n t n t i v o , l a cepp r.m!,lead? p P r a l a prouucci6n--

de t o x i n a d i f t 6 r i c a en e l

H I V

y

e n

e l I N F i e s una v n r i m t e - de

In

C P ~ ? F'd

8

conocida coqo CN-?OOQ, e.t:; cepa fcrmenta- r.4nidrmente 2 1 r g l u c c e r y relri;iv~mc.rit;i. l e n t o R l a r n F i t o -

La cepa o u e

-

si>, ndernXs e s ? l t P m e n t e toxinoE6nicn

.e u t i l i z r i en e l I N H se e x p o r t ? de Cuba.

En

e l

( 7

( 7 )

-

19

+. I- ? <

..

..

r I -C" c L I

.--

d e s c r i b e a C . d i p h t h e r i r e

como

ima cepR b a s t a n t e pieomórfi- ca.

Un

f r o t i s t e 6 i d o p o r l a t é c n i c a de G m t r n , e s n r i n c i p a l - mente grm +, se observan v a r i t a s encorvqdns y zmunadas

--

vue d r n l o i m ~ r e s i ó n de c n r n c t e r e s c h i n o s ,

211

f i n p i IR

ma--

gorfr-. de l : ? s v , o r i t a g e n g r u e s m g se o b s e r v m r r r h u 1 . o ~ metn-

c r o r n f i t i c o s , s i Fie t i ñ e a

IPS

c é i i i i n s d e i>ci>.er-.cio i!Pieioser.

mencionn cue 1:qs c k l u l ~ s de i i ~ . n s o l a

--

ceD:' d e _C. d i p h t h e r i n e pueden s e r desde m i d a d e s o v o i d e s

--

g r r m

+

de 0.5-1.0 urn de diRmetro, h r s t r b ? s t o n e s d e pram--

v r r i o b l e de 1.5-5.0 urn de 1 P r g o . C i e r t n s nutan.tes de la--

cepe Pfi8 c u m d o c r e c e n s o b r e a g n r sangre fomm f i l a m e n t o s - de

cram

v r r i - b l e . La migoria de l o s b p c i l o c d i f t 6 r i c o s

.-

e x h i b e n _forma u n i f o r m e curndo c r e c e n a su

rndxima

u en

un

--

medio nue snt i s f r c e todo. -us r e c i i e r i m i e n t o s n u t r i c i o n r l e s

( e l tiempo de g e n e r r c i ó n o b t e n i d o b a j o c o n d i c i o n e s ó p t i m r s

de c r e c i m i e n t o e s mug p r e c i s o p r r a cada cepa ) . Cabe n c l a I

rpr m e n u n w e t o d p s I n s cepas b p j o t a l e s condicione?, ne

-

incrementan l o r r i t r n i c a r n e n t e ,

no

t o d a s e s t á n c r e c i e n d o

ne

-

( 2 )

1hrksdnl.e

c e c r r i - m e n t e a su mfixirna u.

3.;

.-

A c t i v i d a d e s . P r o p r g p c i ó n de

l a

s e m i l l a .

Para sembrar e l o l o s f e r m e n t a d o r e s IF-70 NewBruswick, de i g u a l mnnerr que en e l R I V , se u t i l i z a

un

i n ó c u i o en

un-

medio de c u l t i v o l f o u i d o , é s t e p r o v i e n e de

un?

cepr l i o f i l i

zada oue se c n r p c t e r i z r p o r est:"r , g " r d i d a en un tubo de

--

v i d r i o enwnchndo por un l r d o en formo de e s f e r a

e l a

rue se den om i n a

"VIAL"

.

-

20

,.

3.1.1.- P r o c e d i m i e n t o p n r a r b r i r

el

VIAL.

Se encuentra d w c r i t o en e l rnrnunl de i n s t r u c c i o n e s

( 7

1

p r - 1- p r e p ~ r a c i b n de v c c u n r s b r c t e r i a m s d e l H I V

Conr:irte en h r c e r una rnnrca c i r c u l a r con unn seguetn en 1- p p r t e c i l f n d r i c R d e I r m p o l l e t a , s e flarnea en e l si- t i o de l? m r r c r , con precnucibn, cuidrndo que n o s e

ca

-

l i e n t o en 15. n r r t e ecYéricR. Se e n v u e l v e e l t u b o en

--

~ I . ~ : o ( i b i n o l r n r e s t é r i l , se rompe c u i d m d o f l u e e l punto

-

de r u p . t u r r e s t é c u b i e r t o con e l algodbn o l a n a ,

asf,

sb-

l o a t r n v e p de e s t o s m a t e r i a l e s se i n t r o d u c e e l a i r e ya-

o u e l a rmpollet:, s e encuentra envnsqda

a l

v a c i o .

En

e l

INH

se us:m cornpresgs de d g o d b n e n v u e l t o en-

f?j~sa e s t é r i l e s para c u b r i r l a s o m p o l l e t a s y a n t e s de m r y

crrlc:: con I r s e g u e t e , se l i r n p i m con una s o l u c i ó n de

--

brocal.

3.7.7.- Siembra d e l VIAL.

I'or medio de unn p i p e t a P n s t e u r e s t 6 r i i se c r n n s f i e

rer? :,loynn? c o t a s de medio de M i i l l e r 2nd M i l l e r d e n t r o

-

de IF cmpoll.etn [ p r r t e e s f é r i c n

)

p r r a humedecer e l

l i g

fili7T7i:o. Se a s p i r a e l cor!tenido t o t a l den.tro de l a

--

pipet:¡, s;ixi?.i&idose de una p r o p i p e t a y se t r n n n f i e r t -

--

sskaticPrneni,e E c u s t r o t u b o s con medio de 1IHI. Se incu-

ba 24 h r u . a 37 C.

-

O

3.2.3.-

P ~ r e r m ~ t r a 7 .

2 1

r ' ,_

i."

'L

- !

8 .

._

L.

L . .

-

L

a?pdrLs d c 1 c u l t i v o c o n t e n i d o en l o s tubos de B H I a ma

-

t r n c e s de 500 m l , conteniendo 100 ml. de m e d i o de !:ül.ier

m d ! ? i l l e r . Se ponen a a g i t a r en un n g i t a d o r Newh-ur,- wick a 725 rpm y P

35

O C durante 7 4 ' h r s .

S e u t i l i z a un tubo de E F I I p o r crin3 mptrriz erlenme- !fer de 500 r n l .

3.7.4.- I':tse g a r r a f ó n .

F h c o n d i c i o n e s a s k p t i c a s , se t r a n s f i e r e n 25 r i l d e l

i n ó c u l o que c r e c i ó en l o s mntraces a p r r a f o n e s de

4 1,

c o n t e n i e n d o 1

1

de medio de M ü l l e r and N i l l e r . Se po-

nen :> -gitr;r en un a g i t P d o r Newlkuswick a ₂₇₅ rpm y R

-

35'

C

durante 24 h r s .

Se u t i l i 7 P un matraz p o r cada g n r r a f ó n de

4

1.

-

Como f u e n t e de carbono, a n t e s de i n o c u l a r , a

los

ciatra- c e s s e l e s rñpde 5 m l de m r l t o s a a l 50$ y a l o s gprra--

fone:3 50

ml.

Desnuds se cubrcn con t a p o n e s de algodón

Y P : : R y f i n r l m e n t e con p p p e l nue s e s u j e t a con una li-

pri

.

3.?.5.-

P r e p a r a c i ó n d e l

inóculo

f i n a l con t r m s f e r e n

--

c i r :.1 ferrnentrdor.

A n t e s de p r e p p r a r s e s e debe checar l a pureza d e l

-

c u l t i v o m e d i m t e un ex6men m i c r o s c ó p i c o , ppra _{l o}

cusl

-

s e e l ? b o r a n f r o t i s t e q i d o s p o r

Ir

t é c n i c a de Grrm.

Un? vez comprobada 1~ p u r e z p d e l c u l t i v o , se l e

--

23

n e s a s k p t i c p s . T m t o e l e o u i p o d e l no.

8

corno

In

'uocn

del. p ~ r r i t f ó n deben f'lrmenrse ant<??, de incru.--t?rse

uno

-

en e i o t r o , v e r f i w r a no.

1

.

121 g p r r a f h prepara

-

do como _{l o} rnuec.trr

1,-

fi-rp se encuentra l i s t o p r r a

--

c o n e c t a r s e a una l f n e a d e e n t r a d ? a l fermentador IF-70.

-

..

I ' 23

.'

,

...

I " ! I , 1

.^

, i. *.

- - L

..I. c

."

-. L -. - I

4 . -

P r o c e s o de I ~ e e e e n t ~ c i ó n .

4.1.- C o n s i d e r - c i o n e s t e ó r i c a s : C P r r c t e r f s t i c a s d e l f e r - mentpdor.

Corresponden R l o s de un fermentador modelo

IF-70

c o n s t r u i d o por l a :iew Erunswick S c i e n t i f i c Co. de E d i

-

.

E l s i r t e m a conste de l o s s i g u i e n

-

( 6 )

son, New Y e r s e y

t e r elementos p r i n c i p a l e s .

a)

.-

R e c i p i e n t e pnra c u l t i v o ( b i o r e r c t o r

.-

con

-

m e r e s p e c t i v a s l í n e a s de entrada y w l i d a , ts'pr y agi- t r d o r .

b)

.-

W6dulo pare t u b e r i a . - i n c l u y e v á l v u l a s par? e l

c o n t r o l y o p e r z c i d n de

1~

e s t e r i l i z a c i ó n , conecciones

--

e l é c t r i c a s y c o n e c c i o n e s de t u b e r f a .

c)

.-

I n s t r u m e n t ~ c i ó n para c o n t r o l de temperatura,

-

c o n t r o l de f l u j o de a i r e , control. de R K i t n c i ó n , c o n t r o l - de t'snurnn, c o n t r o l de p H y c o n t r o l de 11.0.

L a s p r i n c i p s l e s e s p e c i f i c a c i o n e s d e l fermentador

--

p r o p o r c i o n q d r s p o r e l f r b r i c a n t e son I p s s i m i e n t e s :

a )

.-

Número de módulos.- son dos: módulo de tube

-

r f r s _y d e l fermentador y módulo p r r a l a instrumentación.

b)

.-

Dimensiones t o t a l e s . - l e caprcidad t o t a l d e l

-

fermentador e s de 70

1.

--

i

._

*-

i

“ L

. t

_Ln

c

P

*

DimenFionen d e l mddulo del fermentndor.

11

Ancho:

31

(

78.7

cm

A l t o :

76-1/8“

(

193.3

cm

Xsp e

cor

:

I1

4-I/? (

105.4

cm

DimeiirioneP d e l módulo de i n ~ t r u m e n t a c i 6 n .

C )

.-

Fotenciti d e l motor impulsor.-

3/4

HY.

d)

.-

P o t e n c i e e l e c t r i c . p r r ? e l fermentndor.-

??OVAC/l$/ 60Iiz/6

.6KVA.

e’)

.-

Wxim?

p r e s i ó n de vnpor permitid:!.-

ChrrruptP:

35

PSIG.

F e n e n t n d o r : 40 PSIG.

P)

.-

Mfixirnn p r e s i 6 n de n g y a permitido.-

Chppuetn:.

35

PSIG.

Permerit?dor: 40

PSIG.

A).- BlAxirna t e s e de

flujo

de a i r e . -

80 SLPirl w/o D.O.

Control.

76

SL€M w/ D.O. Control.

h).- !,.fiximn v e l o c i d r d de

~ c i t n c i 6 n . -

500

RPM.

i )

.-

Enuipo no stRhdflr.- niny,uno.

jil

.-

Inctrumentnción

no

stÁnd.nr.-

control

de pH,

-

c o n t r o l

D.O.,

c o n t r o l de espumn y r e g i s t r n d o r de tern

--

p e r r t i m r

.

k)

.-

CnrscterísticPs b i o i n g e n i e r l 1 e s . -

DirJrnetro d e l fermentndor ( Dt

Alturn del fermentridor ( Ht )

2.2.

_.

-

"iDt

t l

14

31''

1j.-

Tipo de impulsores.- Turbina de Hoja

Plana.

m)

.-

Ndmero

de impuleores (proporcionndos )

.-

t r e s .

11

n )

.-

D i h e t r o d e l impulsor (

D.

.-

4-3/4

1

o)

.-

Número de Reynolds ( DH?O,

m6x.

~ ~ i t e c i b n y

-

7ooc

1

.-

"He

-

-

I i D * P / u =

1.2

x

10

5

36

4.2.- A c t i v i d n d e s .

( 6 )

4.7.1.- Llenado y e s t e r i i i z ~ c i ó n

Antes de procedtar con

1~

e s t e r i i i e : . c i 6 n s e debe po-

n e r en mnrcha e l p r o c e s o de c i r c u l ~ c i ó n de agua a trn

--

VES

d e l sistema. La chaouetn rrueda l i s t a cuando s e puz

de o b s e r v r r una c o r r i e n t e de v a p o r de agua que s a l e por- l a l i n e ? de desagüe. Hastp entónces s e r e a l i z m l o s

--

s i g u i e n t e s p r s o s .

a).- s e i n s e r t a e l e l e c t r o d o de

pH d e n t r o d e l f e r

-

mentPdor en e l c a s o de que s e vaya a u t i l i z e r .

‘b)

.-

Se i n s e r t n e l e l e c t r o d o D.U. d e n t r o d e l f e ?

-

mentrsdor en e l caso de nuc! sic v : ’ ~ Y ‘ a u t i l i z a r .

c)

.-

Se c i e r r a n todRs l a s l i n e a s de s n l i d a c o l o c a

-

d?s en l o base d e l fermentador.

dj.-

Se l l e n a e l fermenibndor con e l medio de cul--

t i v o ( m o d i f l c n d o ) de M ü l l e r Pnd M i l l e r . Se recomien-

da un volúmen de o p e r a c i ó n de 52.5 1

.

e )

.-

El

c o n t r o l o d o r de temperatura s e c o l o c a en l a

temperatura de o p e r a c i ó n deseada (

35

O

1.

f)

.-

Se c o l o c p l a t r p a a l fermentndor y se v e r i f i -

27

E)

.-

Se c o l o c a

l a

trsn de f l u j o de p i r e dcsenda

-

( 70 l/min ) ,y l a p r e s i 6 n d e l r e c i p i e n t e dPsePda ( ‘2

-

l b / i n ) p a r a m e e l fermentpdor opere después de

In

--

e

s t e r i . 1 i 1.p c

i6n.

i‘

h)

.-

Se c o l o c a l a t a s a de ~ g i t a c i d n deseade, ( 500-

rpm

1.

En e s t e punto s e hace

10

P d v e r t e n c i r de nue e 1

a g i t a d o r n o debe o p e r a r a menos nue h:,y:a i i o u i d o en e l -

f e r m e n t a d o r y nue l e s v 6 l v u l a s de c o r r i e n t e de conden

.-

sad0 y de agur condensada e s t é n a b i e r t a s .

Se i n i c i a l a e s t e r i l i z a c i ó n .

a)

.-

Cumdo

Ir temperatura d e l r e c i p i e n t e e s t 6

--

a r r i b a de 50 s e c m b i a e l r e g i a t r u d o r de temperatura

n l rnrico de 0-150 C .

O

O

13).- Cuando l a temperatura d e l r e c i p i e n t e a l c r n z a l o s 100’ C s e r b r e l a v á l v u l a de l a l i n e a de vapor es- t e r i l i z a d o r . L a s v h l v u l a s que condiicen directrmente-

d e n t r o d e l f e r m e n t i d o r ( e j : v f l v u l a de i n o c u i a c i 6 n ,

-

de a d i c i ó n . . . ) pueden P b r i r s e a l o s 100 C O y c e r r p r s e

P l o s 131O

c.

o )

.-

Lu.:

1fneP.s de i r i o c u l ~ c i 6 n s e e s t e r i l i z m

-

i n d i v i f l u - l m e n t e en e l momento de u t i l i z a r s e abriendo

-

p u r a & d o una l l a v e r o j a t r a n s v e r s a l nue acompaña FI _{l a}

l i n e a y p o r medio de

l a

c u a l s e p r o p o r c i o n a unR co

---

r r i e n t e de vapor. I n i c i a l m e n t e cada una de l a s l f n e s s - puede e s t e r i l i z . P r s e j u n t o con e l fermentador.

d )

.-

se d c j a e n f r i a r h a s t a l a t e n p t r a t u r a de ope-

28

4.2.2.-

Tonin de m u e s t r a s parfi v c r i f i c e r I n e s t e r i l i e ~ c i ó n .

~ : ~ n m p l . e t n d ~ I n o p e r e c i h de e s t e r i i i z n c i ó n

!:e

tomnn-

inucvtrns d e l medio e s t é r i l p n r n v e r i f l c n r

nu8

1íi opern

-

c i 5 n

hngn s i d o c o r r e c t p . I’erP o b t e n e r I n s muestras

s e -

procrrie de Ir s i f l t i e n t e mmern.

v )

.-

E i muestre0

se

r e a i i 7 , ~ F o r una l i n e a vue

se

--

e a m r n t r r en 1 n b ? s e d e l ferrnent?dor.

b)

.-

Le l i n e n de t o m de

muestrps

s e e s t e r i l i z p de-

infiner9 n e m e j m t e R como s e hnce p F r n

ips

l i n e a s de

irio

-

r i ~ l ? c i h , v e r i n c i s o

c.-

5f.l punto 4.3.1.

c).-

Con

1-

1.fnea yp en c o n d i c i o n e s e s t é r i l e s s e

--

Pbre 1- v x l v i i l -

o

l l a v e de s g l i d ; . . Cabe mencionnr oue-

~ P E I condicione^ e s t é r i l e s e x t e r n n o tnrnbidn deben cuidar-

s e p p r n l o c i i ~ l . s e colocnn

los

I l m o s de dos mecheros B-

rmbos l n d o s de

1~

l i n e ? de rnlie8tre0, n d e d s de nue é s t e -

s e r e n l i z n P p u e r t a c e r r a d ? .

Los prinieros m i l . i l i t r o s de medio

_se

deshechen y en- t ó n c e s s e r e c o g e une muestra s u f i c i e n t e , en

u n

r e c i p i e n - t e p r e v i m e n t e e s t e r i l i z n d o r u c trmbién s e obre y

ne

---

c i e r r n j u n t o n 1 9 s l l a m e s de l o g mechtros.

d )

.-

LP nuestr;. c o l e c t n d n s e siembre en c o n d i c i o

--

n e s e s t d r i i e r r

cn

t u h o s vue c o n t i e n e n l o s c i w i e n t e r ; me--

dios: : t i o p l i c o l r t o

flelosa snngre

Xi1 9

1 3 A .

y--

-c

* I

r

f c

-'

L.

t

- L

-

- 1

- -

c

L

-- t

L

29

O

Los t u b o s s e incubrn a

35

C durnnte

48

h r s .

e)

.-

Se observa nue no hPyn c r e c i m i e n t o en l o s CIA?-

t r o medios, ?i cucede l o c o n t r a r i o , 1:: e s t e r i l i a ? c i ó n no fue c o r r e c t ? .

L r

prueb;. s e puede hncer p o r ciuplicndo

o

t r i p l i c r d o , dependiendo de l o s recurso!: con n u e s e cuente.

A.?.3.- I n o e u l ? c i ó n con l a cep? de C.drphtheriae CN-7000.

P r r n e s t n etapa s e emplee e 1 iriócuio f i n a l con t r a n g

f e r e n c i r _{r l} fermentador m e s e p r e p r r ó después de propa-

g r r

1-

cepp, v e r punto 3.7.5 y fiwra

1.

Perra i n o c u l ? r r l f e r m e n t r d o r s e procede de l a s i --

g u i e n t e m m e r a .

r )

.-

L r i n o c u i r c i ó n s e r e a l i z r p o r c u ? l r u i e r a de

--

l r s lineras de n d i c i b n que se encuentran en l a p r r t e su-- p e r i o r d e l f e r m e n t r d o r .

b).- Se e s t e r i l i z a I r l i n e r como se d e s c r i b e en e l -

i n c i r - o c d e l punto 4.7.1.

c )

.-

Se d e s p r e s u r i z a el. sisteinp.

d ) i - Con l a l i n e a de i n o c u l a c i ó n ya e s t e r i l i z 8 d P y e l sistema d e s p r e s u r i z p d o , se Phre

1~

v 5 l v u l a o l l a v e de