Efecto de la concentración del aceite esencial de Luma chequen sobre la viabilidad de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. ESCUELA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. CI. Efecto de la concentración del aceite esencial de Luma. CI EN. chequen sobre la viabilidad de Escherichia coli,. CA. DE. Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus. TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE:. BL. IO. TE. BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO. BI. Autora: Asesora:. Br. León Matos, Ana Isabel Dra. Rodríguez Haro, Icela Marissa. Co-Asesor: Dr. Salazar Castillo, Marco Leoncio Trujillo – Perú 2019 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. AS. Al Dr. Lorenzo Eduardo Matos Deza,. IC. mi querido abuelo, padre y maestro;. G. por todo su cariño, tiempo y paciencia.. LO. Por todas las llamadas de atención y. O. los mimos del día a día. Este pequeño y. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. primer gran paso va para ti. Gracias…. TE. A mi hermana Sol de María.. IO. Recuerda que: “Cuando la vida te. BL. pone un obstáculo, tienes tres. BI. alternativas… rodearlo, treparlo o destruirlo”. Sin importar qué elijas, no te detengas. Te amo.. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTOS. AS. A Dios, por darme la fortaleza para levantarme cada día y ser agradecida. IC. con todo lo que tenga preparado para mí. - De tu mano voy por cualquier camino.. G. A mi asesora, la Dra. Icela Marissa Rodríguez Haro, por compartir conmigo. BI. O. un gran ejemplo y guía a nivel personal y profesional.. LO. su experiencia laboral, por sus consejos y su confianza; pero especialmente, por ser. AS. A mi co-asesor, el Dr. Marco Leoncio Salazar Castillo, por sus aportes en la. CI. presente investigación y su permanente apoyo moral durante el proceso.. CI EN. A mi abuela, Juanita Izquierdo Céliz y a mi madre, Luz Angélica Matos Izquierdo, por compartir conmigo todas las amarguras y alegrías durante este largo. DE. proceso.. A mi padre, Héctor León Yoshido, por todo su apoyo, comprensión y. TE. CA. paciencia durante todo mi proceso académico.. A todas aquellas personas que me brindaron una mano amiga durante el. IO. desarrollo de este trabajo: Lilibeth Ramírez, Oscar Hilario, Brenda Vega, Carlos. BI. BL. Vigo, Sra. Teresa Peralta… Gracias por su tiempo y sus sonrisas.. Por último, quiero hacer un agradecimiento especial a Jonathan Rubina; por. plantearme el reto de rehacer mi camino, empezando por terminar este proyecto. Gracias por empujarme ante cada duda y entenderme sin preguntar; pero, sobre todo, gracias por creer en mí.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. JURADO DICTAMINADOR. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ÍNDICE. Pág.. AS. DEDICATORIA…………………………………………………………………..ii. IC. AGRADECIMIENTOS ......................................................................................... iii. LO. G. JURADO DICTAMINADOR ................................................................................ iv. O. ÍNDICE ................................................................................................................... v. BI. PRESENTACIÓN .................................................................................................. vi. AS. DEL ASESOR....................................................................................................... vii. CI. RESUMEN........................................................................................................... viii. CI EN. ABSTRACT ........................................................................................................... ix INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1. DE. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................. 16. CA. RESULTADOS ..................................................................................................... 22. TE. DISCUSIÓN ......................................................................................................... 24. IO. CONCLUSIONES ................................................................................................ 28. BL. RECOMENDACIONES ....................................................................................... 29. BI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 30 ANEXOS .............................................................................................................. 37. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. AS. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO:. IC. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de. G. Grados y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, presento a vuestra. LO. consideración y claro discernimiento la tesis titulada: “Efecto de la concentración. O. del aceite esencial de Luma chequen sobre la viabilidad de Escherichia coli,. Trujillo, diciembre del 2019. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. el Título Profesional de Biólogo Microbiólogo.. BI. Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus”; con el propósito de obtener. BI. Br. Ana Isabel León Matos. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEL ASESOR. AS. Quien suscribe, Dra. ICELA MARISSA RODRÍGUEZ HARO, asesora de. IC. la presente tesis, CERTIFICA:. G. Que la investigación ha sido desarrollada en conformidad con su correspondiente. O. LO. proyecto y con las observaciones pertinentes.. BI. Que el informe ha sido redactado bajo nuestro asesoramiento, acogiendo las. AS. observaciones y sugerencias alcanzadas, por lo que autorizamos a la señorita Br. ANA ISABEL LEÓN MATOS para continuar con los procedimientos según sus. TE. CA. DE. CI EN. CI. fines.. IO. Dra. Icela Marissa Rodríguez Haro. BI. BL. ASESORA. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. AS. El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto de la concentración del aceite esencial de las hojas de Luma chequen (Feuillée ex Molina) A. Gray. G. IC. “arrayán”, sobre la viabilidad de Escherichia coli (ECRC), Pseudomonas. LO. aeruginosa (PARC) y Staphylococcus aureus (SARM). Para ello, la obtención del. O. aceite esencial se realizó mediante el método de destilación por arrastre de vapor. BI. de agua. Se determinó la composición del aceite esencial por cromatografía de gases. AS. acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), identificándose D-Limoneno (43,18%) y Eucaliptol (14,30%), entre otros compuestos. Para la evaluación del. CI. efecto de la concentración del aceite esencial de L. chequen sobre la viabilidad de. CI EN. ECRC, PARC y SARM; primero se realizó una prueba de susceptibilidad antimicrobiana, mediante el método de difusión de Kirby-Bauer modificado en. DE. pocillo, posteriormente se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB). En la prueba de susceptibilidad. CA. antimicrobiana se obtuvieron zonas de inhibición solo para ECRC (16,9 mm) y. TE. SARM (20,4 mm); PARC no presentó zonas de inhibición. Con respecto a la CMI,. IO. se encontraron valores de 250 µL/mL para ECRC y de 125 µL/mL para SARM. La. BL. CMB fue de 500 µL/mL en ambos casos. En base a la relación CMB/CMI, se. BI. concluye que el aceite esencial de L. chequen tiene efecto bactericida sobre ECRC. y bacteriostático sobre SARM.. Palabras clave: Luma chequen, aceite esencial, viabilidad, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT. AS. The objective of this study was to determinate the effect of the concentration of essential oil of fresh leaves of Luma chequen (Feuillée ex Molina) A. Gray. G. IC. “arrayán”, on the viability of Escherichia coli (CREC), Pseudomonas aeruginosa. LO. (CRPA) and Staphylococcus aureus (MRSA). For this, the essential oil was. O. obtained by steam distillation method. The composition of the essential oil was. BI. determinated by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC - MS),. AS. identifying D-Limonene (43.18%) and Eucalyptol (14.30%), among other compounds. For the evaluation of the effect of the concentration of the essential oil. CI. of L. chequen on the viability of CREC, CRPA and MRSA; firts, an antimicrobial. CI EN. susceptibility test was performed, using the Kirby-Bauer method, modified in well. Subsequently, the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the Minimum. DE. Bactericidal Concentration (CMB) were determinated. In the antimicrobial susceptibility test, inhibition zones were found only for CREC (16.9 mm) and. CA. MRSA (20.4 mm); PARC did not present zones of inhibition. MIC values of 250. TE. µL/mL for CREC and 125 µL/mL for MRSA were found. The CMB was 500. IO. µL/mL in both cases. Based on the CMB/CMI relation, it is concluded that the. BL. essential oil of L. chequen has a bactericidal effect on CREC and a bacteriostatic. BI. effect on MRSA.. Key words: Luma chequen, essential oil, viability, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN. AS. El descubrimiento de los antibióticos ha sido considerado durante mucho. IC. tiempo como uno de los logros médicos más importantes del siglo XX. Sin. G. embargo, debido al uso indiscriminado e irracional de estos fármacos por el hombre,. LO. la aparición y propagación de los gérmenes resistentes a los antimicrobianos está. O. poniendo en peligro la efectividad de estos tratamientos; constituyendo una de las. AS. (World Health Organization [WHO], 2017a).. BI. mayores amenazas para la salud mundial, la seguridad alimentaria y el desarrollo. CI. En la actualidad, la mayoría de los fármacos que se están desarrollando son. CI EN. modificaciones de clases de antibióticos ya existentes que ofrecen soluciones solamente a corto plazo (WHO, 2017a), ya que las empresas farmacéuticas están. DE. dejando de invertir en investigaciones de nuevas moléculas de antibióticos por no considerarlas rentables; lo cual reduce las posibilidades de tratamiento eficaz de. CA. enfermedades, haciendo casi obligatoria la utilización de medicamentos costosos;. TE. además de prolongar el tiempo de hospitalización de los pacientes, aumentando el. IO. riesgo de mortalidad (Serra, 2017).. BL. En contraste, el interés científico sobre la riqueza y variabilidad química de. BI. las plantas ha ido aumentando en las últimas dos décadas, impulsando una revalorización de su empleo en muchas partes del mundo y representando una forma complementaria y económica de curar, armonizando la medicina tradicional con las terapias oficiales de cada país (Avello y Cisternas, 2010).. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La utilización de plantas o partes de ellas con fines terapéuticos, fitoterapia, es una práctica que data desde tiempos inmemoriales. En el Perú, como en otros países, se ha venido empleando en forma empírica, transmitiéndose el conocimiento. AS. de generación en generación. Hoy en día, poseen una base científica, por lo que va. IC. tomando mayor importancia la búsqueda de nuevas fuentes vegetales con actividad. G. citotóxica, antiinflamatoria, antitumoral, analgésica, antibacteriana, antifúngica,. LO. entre otras (Pimentel et al, 2015; Salaverry y Cabrera, 2014; Torres-Guevara y. BI. O. Ganoza-Yupanqui, 2017; Wen et al., 2011).. AS. Según el Instituto Nacional de Estadística e Informática (INEI, 2018), el Perú cuenta con más de 19 mil especies vegetales entre angiospermas y. CI EN. CI. gimnospermas; de las cuales, más de 7 mil son endémicas. Luma chequen (L. chequen), comúnmente denominada “arrayán”, es una especie endémica del Perú que se cultiva tradicionalmente en el ande central y en. DE. el sur del país debido a las múltiples propiedades medicinales que se le atribuye.. CA. L. chequen pertenece a la familia Myrtaceae. Es una planta arborescente de. TE. 5 a 6 m de altura y aproximadamente 5 m de diámetro. Es coposa, con follaje denso. IO. y siempre verde. Presenta tallo erguido, leñoso y ramificado desde la base. Sus hojas. BL. tienen un olor agradable al ser estrujadas, son lisas, opuestas, y decusadas. Las. BI. láminas son elípticas de 0,5 a 2,5 cm de longitud y 0,3 a 1,5 cm de ancho, con el ápice agudo, el borde entero y la base obtusa. Los peciolos son muy cortos, de 1 a 2 mm de longitud. Las flores son blancas, solitarias, axilares, hermafroditas, actinomorfas y tetrámeras, presenta numerosos estambres libres de 7 mm de longitud y pistilo muy pequeño. Los frutos son globosos, rojizos y con escasas. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. semillas y endosperma (Carhuapoma, 2006; Reynel y Marcelo, 2009). Crece desde los 2 500 a los 4 000 m.s.n.m., viéndose favorecida en lugares de alta humedad a orillas de los ríos y de los suelos profundos y arenosos, como los andes del centro. AS. Sudamericano (Carhuapoma, 2006; Cronquist, 1981).. G. IC. La información etnofarmacológica de esta planta refiere diversos usos en la. LO. medicina popular. La ingesta de la infusión o decocción de las partes aéreas se. O. utiliza como tratamiento para la tos, indigestión, infecciones gastrointestinales y. BI. post parto, como antiinflamatorio, antiséptico, astringente y expectorante, así como. AS. para afecciones pulmonares y bronquiales (Gonçalves et al., 2006; Mantilla y. CI. Olazábal, 2001).. CI EN. En algunos pueblos del departamento de Ayacucho, Apurímac y Cuzco, las hojas y ramas jóvenes del arrayán son usadas como bálsamo o “agua de arrayán”, para evitar la putrefacción de tejidos post mortem, conservándolos por muchos años. DE. (Carhuapoma, 2006; Mantilla et al, 2001). Además, el follaje se emplea como. CA. aromatizante y saborizante en la cocina y como condimento en la preparación de embutidos (Reynel et al, 2009). Por otro lado, la madera de esta especie es dura y. TE. durable, aunque no alcanza diámetros grandes, se le utiliza para la elaboración de. A muchas hierbas y especias les han sido caracterizados sus constituyentes. BI. BL. IO. utensilios y herramientas agrícolas (Cronquist, 1981).. bioactivos, los cuales confieren protección contra diversas enfermedades e imparten aroma, color y/o sabor a las plantas. Sin embargo, se debe tener presente que sus. características químicas específicas varían en función de la zona de cultivo, condiciones ambientales y/o método de extracción (Sayed, 2017).. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Dentro de los compuestos bioactivos presentes en una planta, se encuentran los aceites esenciales (AE); los cuales son una compleja mezcla de compuestos volátiles que dan el aroma característico a la planta de la cual derivan. Los AE se. AS. pueden clasificar en cuatro grupos principales (Sayed, 2017): a) Terpenos,. IC. relacionado con el isopreno, b) Compuestos de cadena lineal, no contienen ninguna. G. cadena lateral (alcoholes, aldehídos, cetonas, ácidos, éteres y ésteres), c). LO. Fenilpropanoides (derivados del benceno) y d) Grupo misceláneo, con estructuras. O. no incluidas en los primeros tres grupos (azufre o compuestos que contienen. AS. BI. nitrógeno).. Hoy en día, gracias a diversos métodos como la destilación por arrastre de. CI. vapor, reflujo, maceración, etc. se pueden extraer los aceites esenciales; muchos de. CI EN. los cuales presentan compuestos con efectos farmacológicos, mostrando diversas propiedades como antiinflamatorios, antioxidantes, y anticancerígenos. Otras. DE. actividades biológicas se reportan como biocidas en contra de una amplia gama de microorganismos como bacterias, hongos, virus, protozoarios insectos y plantas. CA. (García et al, 2010).. TE. Carhuapoma, Bonilla, Suarez, Vila y López (2005); Gonçalves et al. (2006). IO. analizaron los componentes del aceite esencial de L. chequen y encontraron α-. BL. pineno (57,3% y 57,1%) y 1,8-cineol o eucaliptol (7,5% y 12,1%), respectivamente. BI. como principales componentes; sustentando el uso popular del aceite como expectorante, antiinflamatorio y conservante.. En el 2017, se publicó la primera Lista de Patógenos Prioritarios (PPL) resistentes a los antibióticos, en la que se incluyen las 12 familias de bacterias más. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. peligrosas para la salud humana. Dicha lista fue elaborada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) con el objetivo de garantizar que las investigaciones respondan a las necesidades actuales de salud pública. Es por ello que, en base a la. AS. urgencia en que se necesitan los nuevos antibióticos, los patógenos se dividen en. G. IC. tres categorías: Prioridad 1 - Crítica, Prioridad 2 - Alta y Prioridad 3 - Media.. LO. Dentro de los patógenos de prioridad crítica, se incluyen las bacterias. O. multirresistentes que son especialmente peligrosas en hospitales y entre los. BI. pacientes que necesitan ser atendidos con dispositivos como ventiladores y. AS. catéteres intravenosos, ya que pueden provocar infecciones sanguíneas y neumonías. Entre tales bacterias se encuentran Acinetobacter baumannii Pseudomonas. aeruginosa. resistentes. a. CI. y. los. carbapenems,. y. varias. CI EN. enterobacteriaceas como Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., Providencia spp. y Morganella spp; todas. DE. resistentes a los carbapenems y las cefalosporinas de tercera generación. Por otro lado, los patógenos que integran la segunda y tercera categorías de la lista, prioridad. CA. alta y media, contienen bacterias que presentan una farmacorresistencia creciente y. TE. provocan intoxicaciones alimentarias, gonorrea o infecciones respiratorias. Tal es. IO. el caso de Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Helicobacter pylori, Salmonella. spp.,. Neiserria. gonorrhoeae,. Streptococcus. BL. Campylobacter,. BI. pseumoniae, Haemophilus influenzae y Shigella spp. (WHO, 2017b).. El grupo de las Escherichia coli (E. coli) es bastante diverso. Esta bacteria. se encuentra comúnmente como comensal que habita el tracto gastrointestinal de mamíferos y se utiliza como bacteria indicadora de la contaminación fecal. Sin. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. embargo, se conocen cepas causantes de enfermedades infecciosas que afectan casi a cualquier tejido y sistema orgánico humano (Winn et al., 2008).. AS. Las cepas que son patógenas se clasifican en dos grupos, según el sitio de infección. Las E. coli que infectan y causan enfermedades en el tracto. G. IC. gastrointestinal son E. coli patógenas intestinales (ECPI), incluyen: E. coli. LO. enterotoxigénica (ECET), E. coli enteroagregativa (ECEA), E. coli enteropatógena. O. (ECEP), E. coli enteroinvasiva (ECEI), E. coli difusamente adherente (ECDA) y E.. BI. coli verocitotoxigénica (ECVT). Las E. coli causantes de enfermedades en sistemas. AS. distintos al tracto gastrointestinal se llaman E. coli patógena extra-intestinal (ECEXP), incluyen: E. coli uropatógena (ECUP), E. coli asociada a meningitis. CI EN. CI. neonatal (ECMN) y E. coli causante de sepsis (ECSEP) (Athumani, 2017).. E. coli es una bacteria Gram negativa, anaeróbica facultativa, no esporulada y con forma de bastón o pequeño bacilo. Se diferencia de otras coliformes por. DE. fermentar la lactosa y se puede confirmar su aislamiento mediante un set de pruebas. CA. bioquímicas llamado IMViC. (Athumani, 2017).. TE. IMViC es una abreviación para las pruebas de Indol, Rojo de Metilo, Voges-. IO. Proskauer y Citrato. E. coli se caracteriza por producir indol a partir de triptófano,. BL. fermentar la glucosa con producción de gas, no producir acetoína y no utilizar el. BI. citrato como fuente de carbono (Athumani, 2017; Winn et al., 2008).. Otra bacteria de importancia clínica es Pseudomonas aeruginosa (P.. aeruginosa) es un microorganismo aerobio, altamente versátil, capaz de tolerar condiciones bajas de oxígeno. Se encuentra presente en agua, suelo y plantas; no. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. obstante, puede sobrevivir con bajos niveles de nutrientes y crecer en rangos de temperatura de 4 a 42°C. Estas características le permiten adherirse, sobrevivir en equipos médicos y en otras superficies hospitalarias. Por ello, es frecuentemente. AS. aislada de muestras clínicas, especialmente de pacientes con quemaduras, fibrosis. IC. quística, trasplantes de órganos y/o pacientes conectados permanentemente a sondas. LO. G. o catéteres (Ochoa et al., 2013; Winn et al., 2008).. O. P. aeruginosa puede causar infecciones en vías urinarias, respiratorias y. BI. heridas cutáneas rezumantes, siendo difícil de erradicar debido a su elevada. CI. antibióticos (Ochoa et al., 2013).. AS. resistencia intrínseca, además de su capacidad para adquirir resistencia a diversos. CI EN. P. aeruginosa es una bacteria no fermentadora, Gram negativa, con forma de bacilo curvo o recto. En medio de cultivo, se caracteriza por el crecimiento de colonias grandes mucoides o secas, con producción de pigmento y olor a fruta.. CA. al., 2008).. DE. Además, las colonias son oxidasa positivas (dentro de los 10 segundos) (Winn et. TE. Todas las especies del grupo fluorescente del género Pseudomonas se. IO. caracterizan por la producción de pioverdina (pigmento hidrosoluble amarillo-. BL. verdoso), el cual aumenta sobre todo en los medios con alta concentración de. BI. fosfato. Sin embargo, solo P. aeruginosa produce piocianina (pigmento. hidrosoluble azul, que imparten un color verdoso al medio de cultivo) (Winn et al., 2008).. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Por otro lado, Staphylococcus aureus (S. aureus) es un microorganismo que puede ser encontrado en la microbiota natural de humanos y animales, mayormente colonizando piel y nasofaringe. Sin embargo, en condiciones apropiadas puede. AS. causar diversos procesos infecciosos que van desde infecciones cutáneas. IC. relativamente benignas hasta enfermedades sistémicas potencialmente mortales;. G. produciendo foliculitis, simple e impétigo, forúnculos, carbunco, neumonía. LO. estafilocócica, bacteriemia, meningitis, shock tóxico e intoxicaciones alimentarias. estafilococos. son. cocos. Gram. positivos,. que. se. agrupan. AS. Los. BI. O. (Winn et al., 2008).. predominantemente en racimos. Son bacterias no móviles, no esporuladas, catalasa. CI. positivas. Dentro de las especies de Staphylococcus aureus, la subespecie aureus. CI EN. es la más importante (Zendejas-Manzo, Avalos-Flores, y Soto-Padilla, 2014).. S. aureus subespecie aureus crece formando colonias grandes, lisas, enteras,. DE. de consistencia cremosa y pigmentación amarillo o amarillo-naranja (de ahí el. CA. nombre de “aureus” que significa “color oro”). Se diferencia de otros estafilococos por ser coagulasa positivo, además de producir enzimas DNasa y una nucleasa. TE. termoestable que tienen actividad endo y exonucleolíticas. Asimismo, se caracteriza. IO. por fermentar el manitol y presentar tolerancia a concentraciones de hasta 7,5%. BL. NaCl en agar manitol salado. En agar Baird-Parker, S. aureus crece reduciendo el. BI. telurito a teluro y produce halos de lipólisis y proteólisis alrededor de las colonias. (Winn et al., 2008; Zendejas-Manzo et al., 2014). Actualmente, uno de los antibióticos β-lactámicos más efectivos para el. tratamiento clínico de infecciones causadas por enterobacteriaceas y P. aeruginosa. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. son los carbapenems (imipenem, meropenem y ertapenem). Al igual que otros antibióticos β-lactámicos, su mecanismo de acción consiste en inhibir la síntesis de la pared bacteriana. Sin embargo, las Enterobacteriaceae resistentes a carbapenems. AS. (ERC) están surgiendo a medida que los carbapenems van siendo ampliamente. IC. utilizados en la práctica clínica. Por su parte, P. aeruginosa puede desarrollar. G. fácilmente resistencias adquiridas y presenta resistencia intrínseca a la mayoría de. LO. las penicilinas, cefalosporinas de primera, segunda y tercera generación (excepto. O. ceftazidima), tetraciclinas, cotrimoxazol y rifampicina (Mosquito, Ruiz, Bauer y. AS. BI. Ochoa, 2011; Ochoa et al., 2013).. Los mecanismos de resistencia antibiótica más estudiados en bacterias. CI. Gram negativas incluyen: alteración o pérdida de porinas, bombas de expulsión. CI EN. activa y producción de enzimas β-lactamasa (Moreno, 2013).. Las porinas son estructuras proteícas que forman un canal a través de la. DE. membrana externa de las bacterias Gram negativas. Una de sus principales. CA. funciones es facilitar el transporte de pequeñas moléculas hidrófílicas tales como mono y disacáridos, nucleósidos y aminoácidos desde el medio externo al espacio. TE. periplásmico. De esta manera, si se produce una pérdida o alteración de la porina. IO. (OprD en caso de P. aeruginosa), la cantidad de carbapenémico que llega al espacio. BL. periplásmico disminuye considerablemente y por lo tanto se generan cepas con. BI. fenotipos de resistencia (Moreno, 2013; Tafur, Torres y Villegas, 2008).. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las bombas de expulsión o bombas de salida, se encuentran en la membrana externa de la célula y expulsan hacia el exterior de la bacteria gran cantidad de moléculas, entre ellas, metabolitos, detergentes, solventes orgánicos y antibióticos.. AS. Para ello, utilizan la hidrólisis de ATP o un mecanismo de contra-transporte iónico. IC. como sustrato energético. El principal papel de este mecanismo es mantener bajas. G. las concentraciones de sustancias tóxicas dentro de la célula (Tafur et al, 2008).. LO. Estos transportadores se pueden clasificar en seis familias: La familia ABC (ATP. O. binding cassette), MF (major facilitator), MATE (multidrug and toxic efflux), RND. BI. (resistance nodulation division), SMR (small multidrug resistance) y DMT. AS. (drug/metabolite transporter superfamily) (Tafur et al, 2008). En P. aeruginosa, el. CI. sistema de salida RND más frecuentemente encontrado es MexAB-OprM (Moreno,. CI EN. 2013).. Dentro de las enzimas que producen E. coli y P. aerugina como mecanismos. DE. de resistencia a los antibióticos, se encuentran las β-lactamasas; las cuales generalmente tienen función hidrolítica. Las β-lactamasas que hidrolizan a los. CA. carbapenems se llaman genéricamente carbapenemasas. Dichas enzimas se agrupan. TE. en las diferentes clases moleculares de Ambler que se corresponden con diferentes. IO. grupos funcionales de la clasificación de Bush y Jacoby (2010). En la siguiente. BL. imagen se muestran las enzimas más relevantes y los microorganismos en los que. BI. se encuentran habitualmente.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 1.- Clasificación general de las carbapenemasas. Extraído de: Calvo,. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Cantón, Fernández, Mirelis, y Navarro (2011).. Las primeras carbapenemasas de origen plasmídico se describieron en Japón. DE. en el año 1991 en P. aeruginosa y con posterioridad en diversas especies de. CA. enterobacterias (Calvo et al, 2011). TE. Dentro de las carbapenemadas más importantes se encuentran las metalo-βlactamasas, las cuales pertenecen a la clase B (grupo 3). Pueden ser cromosómicas. IO. y adquiridas. Las cromosómicas son las responsables de la resistencia intrínseca a. BL. los carbapenems y las adquiridas pertenecen a los grupos IMP (más de 23), VIM. BI. (más de 15), GIM, SPM y SIM. Se han detectado en P. aeruginosa, Acinetobacter. spp., S. marcescens, K. pneumoniae, Enterobacter cloacae, Citrobacter spp., E. coli, Morganella morganii, Proteus vulgaris y otras enterobacterias. Los genes que las codifican pueden estar localizados en cassettes dentro de integrones,. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. trasposones, plásmidos, etc. y ser o no transferibles. Las VIM e IMI se han detectado en todo el mundo y actualmente se observa un desplazamiento desde P. aeruginosa hacia varias enterobacterias. En general, hidrolizan también a otros β-. AS. lactámicos excepto a aztreonam y son inhibidas por el EDTA. (Fresnadillo, García. G. IC. M.I., García E. y García J.E., 2010).. LO. Las carbapenemasas de la clase D (grupo 2df), corresponden a enzimas tipo OXA que no son inhibidas por el EDTA; y la inhibición por el ácido clavulánico es. BI. O. variable. De las más de 100 β-lactamasas tipo OXA, 37 se consideran. AS. carbapenemasas. Puntualmente, se han detectado en enterobacterias (OXA-48/K. pneumoniae, OXA-23/Proteus mirabilis). En P. aeruginosa se han detectado. CI. enzimas cromosómicas OXA-50-like (denominadas poxB) sin trascendencia. CI EN. clínica, pues no determinan concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) elevadas de imipenem (Fresnadillo et al, 2010).. DE. Las carbapenemasas de la clase A (grupo 2f), son inhibidas por el ácido. CA. clavulánico y no por el EDTA. Se han descrito en P. aeruginosa, S. marcescens, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, K. pneumoniae, Klebsiella oxytoca,. TE. P. mirabilis y otras enterobacterias, tanto codificadas en plásmidos (KPC-1 a KPC-. IO. 5, GES-1 a GES-6, IMI-2) como en el cromosoma (NMC-A, IMI-1, SME-1 a SME-. BL. 3). Confieren resistencia a todos los β-lactámicos, incluidos monobactams, excepto. BI. las GES que no hidrolizan aztreonam. Las de tipo SME hidrolizan débilmente a las cefalosporinas de amplio espectro (Calvo et al., 2011; Fresnadillo et al, 2010).. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Con respecto a la resistencia antibiótica de bacterias Gram positivas, se conoce que en 1959 surgió la primera penicilina sintética resistente a la penicilinasa producida por S. aureus, la meticilina. Un año después, se describió en Inglaterra el. AS. primer S. aureus resistente a dicho antimicrobiano, mediado por un mecanismo. IC. independiente de la hidrólisis enzimática y que confería resistencia a todos los β-. LO. G. lactámicos (Winn et al., 2008).. O. Es necesario recordar que la proteína blanco de acción de los β-lactámicos. BI. se conoce universalmente como PBP (del inglés penicillin-blinding protein). Las. AS. PBPs corresponden a enzimas, principalmente con función transpeptidasa. Todas las cepas de S. aureus poseen cuatro tipos de PBPs: PBP1, PBP2, PBP3 y PBP4. El. CI. mecanismo que determina la resistencia a la meticilina es la adquisición de una. CI EN. nueva PBP, denominada PBP2a; la cual, a diferencia de las PBP normales, tiene baja afinidad por los β-lactámicos (incluidas las cefalosporinas). Una vez que las. DE. PBP presentes normalmente en la bacteria han sido inactivadas por un antibiótico β-lactámico, la PBP2a continúa actuando y permite la síntesis de una estructura. CA. peptidoglucano (PG) estable, lo que facilita que la bacteria pueda proliferar y. TE. dividirse. Todo esto ocurre debido a que la configuración del sitio activo de esta. IO. nueva transpeptidasa es menos accesible al antimicrobiano por tener la hendidura. BL. más estrecha; además de contar con un sitio de regulación alostérica al que puede. BI. unirse un PG formación (Aguayo-Reyes et al, 2018).. La PBP2a es codificada por el gen mecA, el cual se encuentra inserto en una. isla genómica denominada SCCmec, del inglés Staphylococcal Cassette Chromosome mec, un elemento genético móvil (Winn et al., 2008).. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Diversas investigaciones indican que tanto el extracto como el aceite esencial de las hojas de las Myrtaceae presentan actividad antibacteriana y. AS. antifúngica.. Lizcano y Vergara (2008) reportaron que el aceite esencial obtenido de las Myrchiantes. rhopaloides. “arrayán. negro”. presenta. actividad. IC. de. G. hojas. LO. antimicrobiana frente a B. subtillis, E. coli, S. aureus, C. albicans y Alternaria sp.. O. Estos resultados confirman que el aceite esencial de M. rhopaloides posee actividad. BI. antibacteriana y antifúngica.. AS. Chavez et al. (2016) demostraron la actividad antimicrobiana del extracto. CI. de hojas de Myrcianthes hallii “arrayán de Quito” frente a bacterias resistentes a. CI EN. antibióticos (S. aureus, P. aeruginosa, S. pyogenes y Enterococcus spp.). Los datos reportados en esta investigación revelan que M. hallii es una fuente potencial de polifenoles, los cuales poseen actividad antibacteriana; demostrando el gran. DE. potencial de esta especie, no solo para aplicaciones farmacéuticas, sino también. CA. para aplicaciones biomédicas, alimentarias y cosméticas.. TE. Fernandez, L.A. (2019) y Flores J. (2014) demostraron la actividad. IO. antibacteriana del aceite esencial de L. chequen “arrayán” frente a Streptococcus. BL. mutans. Adicionalmente, Fernandez, L.A. (2019) reportó que L. chequen inhibe el. BI. crecimiento de E. coli y S. aureus; como lo han reportado otras especies vegetales de la familia Myrtaceae.. Gonçalves et al. (2006) determinaron la composición del aceite esencial de L. chequen, encontrando α-pineno (57.1%), 1,8-cineol o eucaliptol (12.1%) y. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. linalool (5,5%) como componentes principales. Asimismo, realizaron pruebas de susceptibilidad tanto del aceite como de cada compuesto principal encontrado, frente a diversas bacterias y hongos. De esta manera, asociaron la actividad. AS. antimicrobiana del aceite con la presencia de dichos compuestos.. G. IC. En nuestro país, existen muchas comunidades que presentan dificultades. LO. para acceder fácilmente a los servicios de salud. Sin embargo, tienen a su alrededor. O. variedad de especies vegetales que podrían ser utilizadas medicinalmente, debido a. BI. que poseen principios activos u otros compuestos fitoquímicos con propiedades. AS. antimicrobianas.. CI. Por todo lo mencionado anteriormente y a fin de proporcionar una. CI EN. alternativa natural, económica y de fácil acceso frente a la creciente problemática de bacterias multidrogorresistentes; en el presente trabajo se evaluó el efecto de la concentración del aceite esencial de L. chequen sobre la viabilidad de cultivos. DE. resistentes de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus,. CA. in vitro. Así mismo, se determinaron los componentes mayoritarios del aceite esencial de L. chequen y la Concentración Mínima Inhibitoria y Bactericida para. BI. BL. IO. TE. cada bacteria.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODOS. AS. 1. Material de estudio. G. IC. 1.1 Muestras vegetales. LO. Se empleó aceite esencial de L. chequen, el cual fue obtenido a. O. partir de hojas recolectadas en la Quebrada de Gembón, que se encuentra. BI. ubicada a 2 821 m.s.n.m. en el Anexo de Pueblo Nuevo, perteneciente al. (Anexo 1). CI EN. 1.2 Cultivos bacterianos. CI. AS. Distrito de Pataz, Provincia de Pataz, Departamento de La Libertad – Perú.. Se emplearon cultivos de Escherichia coli resistente a los. DE. carbapenems (ECRC), Pseudomonas aeruginosa resistente a los. CA. carbapenems (PARC) y Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), todos provistos por el Laboratorio de Bacteriología del. TE. Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias. BI. BL. IO. Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo. Dichos cultivos fueron identificados morfológicamente y mediante pruebas bioquímicas (Garrity,. Boone y Castenholz, 2012; MacFaddin, 2003). Además, se tomó en consideración la resistencia antibiótica de las bacterias utilizadas, teniendo como referencia las tablas del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI, 2016). (Anexos 2 – 20). 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2. Procedimiento. AS. 2.1 Recolección, identificación y transporte de las muestras vegetales. Las muestras vegetales fueron recolectadas en bolsas de papel de. G. IC. primer uso. Un espécimen se separó para ser identificado por especialistas. LO. del herbolario de la Universidad Nacional de Trujillo (HUT); mientras que. O. muestras de 0,5 - 1 kg fueron transportadas al Laboratorio de Bacteriología. BI. del Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Ciencias. AS. Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, para ser procesadas. CI. previa selección y limpieza. (Anexo 21). A. Gray. CI EN. 2.2 Obtención del aceite esencial de Luma chequen (Feuillée ex Molina). DE. La obtención del aceite esencial se realizó en el Laboratorio de Farmacognosia, del Departamento de Farmacotécnia, de la Facultad de. CA. Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo; mediante. TE. un equipo de destilación por arrastre de vapor de agua, para lo cual se. IO. emplearon aproximadamente 5 kg de hojas frescas de L. chequen. El. BI. BL. equipo de extracción cuenta con un sistema de reflujo para condensar el AE (Carrasco, 2009). Una vez terminó el destilado, se obtuvo una mezcla de hidrolatos y AE. La separación de la capa acuosa y el AE se realizó por diferencia de densidades, utilizando una pera de decantación. Se deshidrató con sulfato de sodio anhidro y finalmente se decantó para recuperar el AE puro, con un rendimiento de 6 mL/kg; el cual se almacenó. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. en frascos de vidrio color caramelo y se conservó en refrigeración a 4ºC hasta su posterior uso (Flores, 2014).. AS. 2.3 Análisis del aceite esencial de Luma chequen (Feuillée ex Molina) A. Gray por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de. G. IC. masas (GC-MS). LO. Para el análisis cromatográfico del aceite esencial de L. chequen,. O. se siguió el protocolo por Ruiz, Díaz y Rojas (2015) modificado. Se utilizó. BI. 20 µL del aceite esencial en 980 µL de diclorometano, que fueron luego. AS. inyectados en el cromatógrafo de gases acoplado a un detector selectivo. CI. de masas. La separación de los compuestos en la mezcla fue llevada a cabo. CI EN. mediante una columna capilar apolar TG-5MS (30 m x 250 µm x 0,25 µm) (Thermo Scientific de 5% fenilpolimetilsiloxano).. DE. La temperatura del inyector se mantuvo a 250 °C y la inyección se realizó en modo Split (50:1). El programa de temperaturas del horno fue. CA. como sigue: temperatura inicial de 50 °C, mantenida por 5 minutos;. TE. posteriormente se incrementó a 10 °C/min hasta 100 °C, 3 °C/min hasta. IO. 150 °C, 7 °C/min hasta 200 °C, 1 °C/min hasta 210 °C, manteniendo la. BI. BL. temperatura final por 1 min. El tiempo de corrida fue de 44,96 minutos, utilizando helio como gas de arrastre a un flujo constante de 1 mL/min.. Los constituyentes de los aceites esenciales fueron identificados utilizando el software Chromeleon 7, por comparación de los espectros de. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. masas de cada pico con los de la librería de espectros de masas de la base de datos del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST, 15).. AS. 2.4 Evaluación del efecto de la concentración del aceite esencial de Luma chequen sobre la viabilidad de Escherichia coli, Pseudomonas. G. Prueba de susceptibilidad antimicrobiana. LO. 2.4.1. IC. aeruginosa y Staphylococcus aureus. O. Se empleó la técnica de susceptibilidad antibiótica del CLSI. BI. (CLSI, 2016), modificando el uso de pocillos en lugar de discos. En una. AS. placa con agar Mueller-Hinton (MH) se sembró por superficie el. CI. inóculo previamente preparado, usando el método de suspensión directa. CI EN. de colonias. Dicho inóculo fue estandarizado a una concentración equivalente al tubo Nº 0,5 del Nefelómetro de McFarland (1,5 x 108 ufc/mL). Luego de que el medio absorbiese el exceso de humedad, se. DE. perforó el agar con un sacabocado de 6 mm de diámetro, realizándose. CA. 4 pocillos por placa. Posteriormente se agregaron 50 µL del AE de L. chequen en tres pocillos y SSF estéril en el cuarto, como control.. realizó la lectura de los halos de inhibición midiendo su diámetro en milímetros. El ensayo se realizó por triplicado para cada bacteria en estudio, a fin de poder promediar los datos obtenidos.. BI. BL. IO. TE. Finalmente, tras incubar las placas a 37ºC + 1ºC durante 24 hrs, se. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.4.2. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI). AS. Se empleó la técnica de macrodilución en caldo MH con Tween 80 al 0,1%, según recomendaciones del CLSI (CLSI, 2012). Para cada. LO. caldo (G) y un control de calidad del medio (C).. G. IC. microorganismo ensayado se preparó un control de crecimiento en. O. El inóculo fue previamente estandarizado a una concentración. BI. equivalente al tubo Nº 0,5 del Nefelómetro de McFarland, luego se. AS. diluyó al centésimo en caldo MH, a fin de obtener una concentración. CI. de aproximadamente 5 x 105 ufc/mL al inocular cada tubo.. CI EN. Se prepararon diluciones del AE, en caldo MH. Obteniéndose AE al 50% (500 µL/mL), 25% (250 µL/mL), 12,5% (125 µL/mL),. DE. 6,25% (62,5 µL/mL) y 3,12% (31,25 µL/mL). El volumen final en cada. CA. tubo fue de 1 ml.. Los tubos se incubaron por 24 horas a 37°C + 1°C. Luego se. concentración del AE en la cual no se presentó crecimiento visible. El ensayo se realizó por triplicado para cada bacteria en estudio, a fin de poder promediar los datos obtenidos.. BI. BL. IO. TE. observó la turbidez y se determinó la CMI como la mínima. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.4.3. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB). AS. Se sembró por estría, en agar MH, una alícuota de cada set de tubos empleados en el paso anterior. La CMB se determinó como la. G. IC. mínima concentración de AE capaz de inhibir el crecimiento bacteriano. LO. al 99%. Las placas fueron incubadas a 37ºC + 1ºC. (Ingraham, J y. O. Ingraham, C, 1998). Luego de 24 horas se realizó la lectura verificando. Evaluación de la capacidad bactericida y bacteriostática. CI. 2.4.4. AS. y S. aureus, respectivamente.. BI. el crecimiento de colonias con la morfología de E. coli, P. aeruginosa. CI EN. Se realizó teniendo en cuenta la relación CMB/CMI. De manera que si la relación CMB/CMI ≤ 2, el efecto se consideró como. DE. bactericida y si la relación CMB/CMI > 2, el efecto se consideró como. BI. BL. IO. TE. CA. bacteriostático (Ingraham et al., 1998).. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS. AS. Mediante el método de destilación por arrastre de vapor de agua, se obtuvo. IC. el aceite esencial de Luma chequen; y mediante cromatografía de gases acoplado a. G. espectrometría de masas (GC-MS) se determinaron sus componentes mayoritarios.. LO. (Anexo 22 y 23). O. Mediante la prueba de difusión en pocillo, empleada para evaluar la. BI. actividad del aceite esencial de L. chequen sobre la viabilidad de ECRC, PARC y. AS. SARM, in vitro; se obtuvo que ECRC y SARM mostraron zonas de inhibición con. CI. un diámetro de 16,9 mm (Tabla 2; Anexo 24) y 20,4 mm (Tabla 2; Anexo 26);. CI EN. respectivamente. También se reporta que PARC no muestra zona de inhibición alguna (Tabla 2; Anexo 25).. DE. Finalmente, la CMI y la CMB (Tabla 3; Anexos 28 y 29) del aceite esencial de L. chenquen sobre ECRC fueron de 250 µL/mL y 500 µL/mL respectivamente;. CA. mostrando que el cociente CMB/CMI = 2. Por otro lado, la CMI para SARM fue. TE. de 125 µL/mL y su CMB, de 500 µL/mL (Tabla 3; Anexos 32 y 33), siendo el. BI. BL. IO. cálculo del cociente entre CMB/CMI = 4.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 2.- Diámetro promedio de las zonas de inhibición del aceite esencial (AE) de L. chequen sobre ECRC, PARC y SARM.. AE de L. chequen. Diámetro zona de. AS. Bacteria. inhibición (mm)* 100%. 16,9. PARC. 100%. 0,0. SARM. 100%. G. IC. ECRC. O. LO. 20,4. AS. BI. *Ver Anexo 27 para los datos obtenidos en cada repetición.. CI. Tabla 3.- Concentración mínima inhibitoria (CMI), concentración mínima. CI EN. bactericida (CMB) y efecto antibacteriano del aceite esencial de. ECRC. CMB. CMB/CMI. (µL/mL). (µL/mL). 250. 500. 2. Bactericida. -. -. -. Sin efecto. IO. antibacteriano 125. 500. 4. Bacteriostático. BI. BL. SARM. Efecto antibacteriano. TE. PARC. CMI. CA. Bacteria. DE. L. chequen sobre ECRC, PARC y SARM.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSIÓN. AS. Los ensayos del presente estudio se realizaron empleando el aceite esencial. IC. de las hojas de Luma chequen “arrayán”, el cual se obtuvo mediante destilación por. G. arrastre de vapor de agua. A partir de este método, la materia prima únicamente. LO. entra en contacto con vapor de agua, sin necesidad de agregar solventes químicos,. O. lo que asegura un aceite esencial de alta calidad y pureza, determinándose así la. BI. eficacia del método. Además de ser un método sencillo y de bajo costo que nos. AS. permite obtener un aproximado de 6 mL de aceite esencial por cada kg de hojas de. CI. L chequen empleadas. (Carrasco, 2009; Peredo-Luna, Palou-García y López-Malo,. CI EN. G., 2009).. Carhuapoma, et al (2005) y Gonçalves et al. (2006) analizaron los. DE. componentes del aceite esencial de L. chequen y encontraron α-pineno (57,3% y 57,1%) y 1,8-cineol o eucaliptol (7,5% y 12,1%), respectivamente como. CA. componentes mayoritarios; sustentando el uso popular del aceite como. TE. expectorante, antiinflamatorio, conservante, antibiótico y antifúngico. Teniendo. IO. como referencia que las características químicas específicas de los aceites. BL. esenciales varían en función de la zona de cultivo, condiciones ambientales y/o. BI. método de extracción (Sayed, 2017), se encontró que los componentes mayoritarios encontrados en el aceite empleado en el presente estudio fueron: D-limoneno. (43,18%) y eucaliptol (14,30%). Datos similares se obtuvieron en la investigación de Ruiz et al. (2015), quienes reportan D-limoneno (49,71%), eucaliptol (13,79%) y α-pineno (7,32%).. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A pesar que L. chequen es una especie vegetal poco conocida científicamente, ya se han llevado a cabo algunos estudios que demuestran su actividad antimicrobiana sobre ciertas bacterias y hongos. Gonçalves et al. (2006). AS. investigaron el efecto del aceite comercial de L. chequen y de sus compuestos. IC. mayoritarios (α-pineno, 1,8-cineol y linalool), sobre tres bacterias Gram positivas,. G. dos Gram negativas, dos levaduras y tres hongos; concluyendo que se puede asociar. LO. la presencia de estos compuestos con la actividad antimicrobiana del aceite.. O. Fernández (2019) reporta que concentraciones de 100% y 80% de dicho aceite, son. BI. capaces de inhibir el crecimiento de E. coli y S. aureus. En los resultados expuestos. AS. en la Tabla 2 del presente informe, se muestra que el aceite esencial de L. chequen. CI. presenta actividad antibacteriana sobre ECRC y SARM, mostrando halos de. CI EN. inhibición de 16,9 mm y 20,4 mm respectivamente. Adicionalmente, en la Tabla 3 se indica que la CMI y CMB encontradas para ECRC fueron de 250 µL/mL y 500 µL/mL, respectivamente; mientras que para SARM, la CMI fue de 125 µL/mL y su. DE. CMB de 500 µL/mL.. CA. En la Tabla 3 se muestra la relación encontrada entre la CMB/CMI de las. TE. bacterias en estudio, mostrando un efecto bactericida sobre ECRC. No obstante, a. IO. pesar de que el halo de inhibición para SARM tuvo mayor diámetro, el cociente. BL. entre CMB/CMI, muestra que L. chequen solo tiene efecto bacteriostático sobre. BI. SARM.. Chavez et al. (2016) emplearon extracto metanólico de hojas de. Myrcianthes hallii, planta perteneciente a la familia Myrtaceae al igual que L. chequen, sobre cultivos resistentes a antibióticos. Reportando que M. hallii tiene. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. actividad antibacteriana sobre S. aureus resistente a la meticilina, Enterococcus spp resistente a la vancomicina y S. pyogenes. grupo A (resistente a la penicilina) debido a la presencia de los muchos polifenoles con actividad antibacteriana encontrados. AS. en el extracto. Así mismo, aunque aún no se han encontrado investigaciones que. IC. describan el mecanismo de acción de los terpenos (compuestos mayoritarios. G. presentes en el aceite de L. chequen), se considera que poseen actividad. LO. antibacteriana (Gonçalves et al, 2006). Las diferentes actividades antibacterianas. O. mostradas por el aceite esencial de L. chequen, puede explicarse por la variación en. BI. la concentración porcentual de sus componentes mayoritarios, el efecto sinérgico. AS. de los diferentes componentes en el aceite y/o por la presencia de otros componentes. CI. que pueden ser activos incluso en pequeñas cantidades (Chavez et al, 2016).. CI EN. Chavez et al. (2016); Flores (2014) y Gonçalves et al (2006), coinciden en que el aceite esencial de L. chequen tiene mayor efecto sobre bacterias Gram. DE. positivas debido a la composición de su pared celular. Sin embargo, se debe recordar que, al trabajar con bacterias resistentes, es probable que alguno de sus. CA. mecanismos de resistencia empleados para contrarrestar los antibióticos, influyan. TE. en la escasa o nula actividad del aceite, especialmente en el caso de PARC (Aguayo-. BL. IO. Reyes et al, 2018; Moreno, 2013).. Los resultados en la Tabla 3 muestran que el aceite esencial de L. chequen. BI. no presenta actividad sobre la viabilidad de PARC. No obstante, cabe resaltar que, aunque el crecimiento de la bacteria no es afectado, su producción de pigmento sí, tal como se observa en el Anexo 30. PARC presenta una elevada resistencia. intrínseca y alta capacidad para adquirir resistencia a diversos antibióticos; esta. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. última característica se encuentra asociada a la formación de biopelícula (Ochoa et al, 2013), la cual es posiblemente responsable de la resistencia de la bacteria ante. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. el aceite esencial de L. chequen.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIONES. AS. Se obtuvo el aceite esencial de L. chequen mediante el método de destilación. IC. por arrastre de vapor de agua.; determinándose al D-limoneno (43,18%) y al. LO. O. gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS).. G. eucaliptol (14,30%) como sus componen mayoritarios, mediante cromatografía de. BI. Se determinó la CMI y la CMB del aceite esencial de L. chequen sobre. AS. ECRC y SARM, encontrándose valores de CMI igual a 250 µL/mL y CMB de 500 µL/mL para ECRC y una CMI de 150 µL/mL, con una CMB de 500 µL/mL para. CI EN. CI. SARM.. Se observó que aceite esencial de L. chequen no tiene ninguna actividad. DE. sobre la viabilidad de PARC.. Se demostró que el aceite esencial de L. chequen, tiene actividad. CA. antibacteriana sobre ECRC y SARM, mostrando un efecto bactericida y. BI. BL. IO. TE. bacteriostático, respectivamente.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RECOMENDACIONES. AS. Se sugiere realizar investigaciones en diversos aceites que puedan tener. IC. efecto sobre Pseudomonas aeruginosa, especialmente que actúen sobre la. G. formación de su biopelícula. A fin de encontrar un compuesto que pueda combatir. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. cultivos resistentes.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. AS. Aguayo-Reyes et al. (2018). Bases moleculares de la resistencia a meticilina en. IC. Staphylococcus aureus. Rev Chilena Infectol, 35 (1), 7-14. and. Biotechnological. Applications:. Isolation. LO. Pathogenesis. G. Athumani, M. (2017). Escherichia coli - Recent Advances on Physiology, and. BI. AS. Environment. Doi: 10.5772/67390. O. Characterization of Escherichia coli from Animals, Humans, and. Avello, M. y Cisternas, I. (2010). Fitoterapia, sus orígenes, características y. CI EN. CI. situación en Chile. Rev méd. Chile, 138 (10), 1288 - 1293. Bush K y Jacoby GA (2010). Updated functional classification of beta-lactamases.. DE. Antimicrob Agents Chemother, 54 (3): 969-976. Calvo, J., Cantón, R., Fernández, F., Mirelis, B. y Navarro, F. (2011). Detección. CA. fenotípica de mecanismos de resistencia en gramnegativos. España:. TE. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. IO. (SEIMC). BI. BL. Carhuapoma, M. (2006). Estudio de la composición química y actividad antioxidante del aceite esencial de Luma chequen (Molina) A. Gray “arrayán”. (Tesis de maestría). Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Carhuapoma, M., Bonilla, P., Suarez, S., Vila, R. y López, S. (2005). Estudio de la composición química y actividad antioxidante del aceite esencial de luma. AS. chequen (Molina) A. Gray “arrayán”. Ciencia e Investigación, 8 (2), 73 - 79 Carrasco, F. (2009). “Evaluación del efecto de aceites esenciales como inhibidores. G. IC. del enranciamiento en aceites comestibles” (tesis de pregrado). Universidad. LO. del Azuay, Cuenca, Ecuador. O. Chavez et al. (2016). Chemical Characterization and in Vitro Antibacterial Activity. BI. of Myrcianthes hallii (O. Berg) McVaugh (Myrtaceae), a Traditional Plant. AS. Growing in Ecuador. doi: 10.3390/ma9060454. CI. Clinical and Laboratory Standards Institute. (2012). Methods for Dilutions. CI EN. Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically. Pennsylvania, USA: CLSI. DE. Clinical and Laboratory Standards Institute. (2016). Performance Standards for. CA. Antimicrobial Susceptibility Testing. Pennsylvania, USA: CLSI.. TE. Cronquist, A. (1981). An integrated system of classification of flowering plants.. IO. New York, USA: Columbia University Press. BI. BL. Fernandez, L.A. (2019). Principios activos del aceite esencial de Luma chequen (Molina) A. Gray “arrayan” y evaluación de su actividad antibacteriana. (Tesis doctoral). Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa. Arequipa, Perú. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Flores, J. (2014). Determinación de la actividad antibacteriana “in vitro” del acetite esencial de Luma chequen (Molina) A. Gray “arrayán” frente a Streptococcus mutans (Tesis pregrado). Universidad Nacional Mayor de. AS. San Marcos, Lima, Perú. G. IC. Fresnadillo. M.J., García, M.I., García E. y García J.E., (2010). Los carbapenems. LO. disponibles: propiedades y diferencias. Enferm Infecc Microbiol Clin, 28. O. (2): 53-64. BI. García, C., Martínez, A., Ortega, J. y Castro, F. (2010). Componentes químicos y. AS. su relación con las actividades biológicas de algunos extractos vegetales.. CI. Química Viva, 9 (2), 86-96. CI EN. Garrity, G.M. (Ed.), Boone, D.R. (Ed.) & Castenholz, R.W. (Ed.). (2012). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. New York, USA: Springer. DE. Gonçalves, M., Cavaleiro, C., Proença, A. & Salgueiro, L. (2006). Chemical. CA. Composition and Antimicrobial Activity of the Commercially Available Oil. TE. of Luma chequen (Molina) A. Gray. J. Essent. Oil Res, 18(1): 108-110. IO. Ingraham, J.L. y Ingraham, C.A. (1998). Introducción a la microbiología.. BL. Barcelona, España: Reverté.. BI. Instituto Nacional de Estadística e Informática. (2018). Perú: Anuario de Estadísticas. Ambientales. 2018.. Recuperado. de:. https://sinia.minam.gob.pe/documentos/anuario-estadisticas-ambientales2018. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Lizcano A. J. y Vergara J. L. (2008). Evaluación de la Actividad Antimicrobiana de los Extractos Etanólicos y/o Aceites Esenciales de las Especies Vegetales Valeriana Pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y. AS. Passiflora manicata Frente a Microorganismos Patógenos y Fitopatógenos.. G. IC. (Tesis de grado). Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia. LO. MacFaddin, J.F. (2004). Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias. O. de Importancia Clínica. Madrid, España: Panamericana. BI. Mantilla, J. y Olazábal, O. (2001). Pachamama Hampi Qhoranchiskuna: Las. AS. plantas medicinales de nuestra madre tierra. Cusco, Perú: Instituto de. CI. Ecología y Plantas Medicinales (IEPLAM). CI EN. Moreno, K. M. (2013). Carbapenémicos: tipos y mecanismos de resistencia bacterianos. Revista médica deCosta Rica y Centroamérica, 70 (608): 599 -. DE. 605. CA. Mosquito, S., Ruiz, J., Bauer, J.L. y Ochoa1 T.J. (2011). Mecanismos moleculares de resistencia antibiótica en Escherichia coli asociadas a diarrea. Rev Peru. IO. TE. Med Exp Salud Publica, 28 (4): 648-656. BI. BL. Ochoa et al. (2013). Características patogénicas de cepas de Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenémicos, asociadas con la formación de biopelículas. Bol Med Hosp Infant Mex, 70 (2), 138-150. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..