Validación comparada de la prueba rápida SD bioline dengue duo con el método Gold Stándar (pcr tiempo real), para el diagnóstico de dengue en fase febril en muestras procedentes de la Región La Libertad 2017

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. AS. BI O. LO. G. IC AS. Programa de Segunda Especialidad. Validación comparada de la prueba rápida SD bioline dengue duo con el método Gold. EN CI. Stándar (pcr-tiempo real), para el diagnóstico de dengue en fase febril en muestras. DE. CI. procedentes de la Región La Libertad 2017. TESIS. Autor. Blgo. Rodriguez Guzman, Alexis Martín.. BL. IO. TE. CA. PARA OPTAR EL TÍTULO DE SEGUNDA ESPECIALIDAD PROFESIONAL EN EPIDEMIOLOGIA. Msc. Iwanaga Reh, Nelson Gustavo.. BI. Asesor. TRUJILLO – PERÚ 2019 i. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DR. ORLANDO MOISES GONZALES NIEVES. BI O. LO. G. RECTOR. IC AS. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. AS. DR. RUBEN CESAR VERA VELIZ. CI. EN CI. VICERRECTOR ACADEMICO. DR. WEYDER PORTOCARRERO CARDENAS. DR. ESTEBAN ALEJANDRO ILICH ZERPA SECRETARIO GENERAL. BI. BL. IO. TE. CA. DE. VICERRECTOR DE INVESTIGACION. ii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS. EN CI. AS. DECANO. BI O. DR. FREDDY ROGGER MEJIA COICO. LO. G. IC AS. SEGUNDA ESPECIALIDAD. CI. DR. WILIAN ELMER ZELADA ESTRAVER. DR. CESAR AUGUSTO JARA CAMPOS DIRECTOR DEL PROGRAMA SEGUNDA ESPECIALIDAD. BI. BL. IO. TE. CA. DE. SECRETARIO GENERAL. iii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) AS. DEDICATORIA. BI O. LO. G. IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Dedico este trabajo principalmente a Dios, por haberme dado la vida y permitirme el haber. EN CI. llegado hasta este momento tan importante de mi formación profesional. A mis padres, por ser el pilar más importante y por demostrarme siempre su cariño y apoyo incondicional. A mi Esposa MARIA ISABEL, por ser mi cómplice mi confidente, mi amiga, por ayudarme a crecer, por amarme,. CI. Porque mi corazón te pertenece. A mis hijos GERARDO y KIARA, que son el motor más fiel y confiable y no habrá nada más en el mundo que me produzca motivación, la pasión y la energía. BI. BL. IO. TE. CA. DE. para trabajar por mis metas, los amo.. iv. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) BI O. LO. G. IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. EN CI. AS. AGRADECIMEINTO. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI. A Mg. Blgo. NELSON GUSTAVO IWANAGA REH, Asesor del Trabajo, por compartir sus conocimientos, que con paciencia y rectitud docente ha guiado nuestros pasos.. v. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. BI O. LO. G. MIEMBROS DEL JUARADO. Dr. CESAR AUGUSTO JARA CAMPOS. DE. CI. EN CI. PRESIDENTE. SECRETARIO. BI. BL. IO. TE. CA. Dr. Luis ANGELO LUJAN BULNES. Msc. NELSON GUSTAVO IWANAGA REH VOCAL vi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI. EN CI. AS. BI O. LO. G. IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. vii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. PRESENTACION SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO. G. En cumplimiento con las disposiciones reglamentarias de la escuela de la segunda especialidad de. LO. la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración y claro discernimiento el informe de tesis titulado: "Validación comparada de la Prueba rápida SD Bioline. BI O. Dengue Duo con el método Gold Stándar (PCR-Tiempo Real), para el diagnóstico de. AS. Dengue en fase febril en muestras procedentes de la Región La Libertad 2017". De este modo estaría cumpliendo con uno de los requisitos para optar el titulo de. CA. DE. CI. EN CI. Especialidad en Epidemiologia.. BI. BL. IO. TE. Blgo. ALEXIS MARTIN RODRÍGUEZ GUZMÁN. viii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. DEL ASESOR. El que suscribe profesor asesor de la presente tesis titulado: "Validación comparada de. G. la Prueba rápida SD Bioline Dengue Duo con el método Gold Stándar (PCR-Tiempo Real),. LO. para el diagnóstico de Dengue en fase febril en muestras procedentes de la Región La. BI O. Libertad 2017".. AS. Declaro que esta investigación ha sido ejecutada de conformidad con su correspondiente. EN CI. proyecto y con las debidas orientaciones brindadas a los tesistas.. CI. Respecto al informe, este ha sido revisado y acoge las observaciones y sugerencias. DE. pertinentes, por lo que autorizo al Biólogo Alexis Martin Rodríguez Guzmán, continuar con. BI. BL. IO. TE. CA. los procedimientos según sus fines.. Msc. NELSON GUSTAVO IWANAGA REH. asesor ix. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INDICE AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ............................................................ ii. IC AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS ...............................................................iii SEGUNDA ESPECIALIDAD.....................................................................................................................iii DEDICATORIA ......................................................................................................................................iv. G. AGRADECIMEINTO .............................................................................................................................. v. LO. MIEMBROS DEL JUARADO...................................................................................................................vi APROBACIÓN………………………………………………………………………………………………………………………………..vii. BI O. PRESENTACION.................................................................................................................................. viii DEL ASESOR....................................................................................................................................ix INDICE...................................................................................................................................................x. AS. RESUMEN..........................................................................................................................................xi. EN CI. ABSTRAC ......................................................................................................................................... xii INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 1. 1. ANTECEDENTES .............................................................................................................. 5. 1.2. MARCO TEORICO ............................................................................................................ 9. 1.3. OBJETIVO ........................................................................................................................ 10. CI. 1.1. OBJETIVO GENERAL: ........................................................................................... 10. 1.3.2.. OBJETIVO ESPECIFICO ........................................................................................ 10. DE. 1.3.1.. MATERIALES Y METODOS ................................................................................................. 11. II. OBJETO DE ESTUDIO: .................................................................................................. 11. 2.2. METODOS Y TECNICAS: .............................................................................................. 11. 2.3. ANALISIS ESTADISTICO: ............................................................................................. 14. TE. DISCUSION ........................................................................................................................ 18. CONCLUSION ........................................................................................................................ 21. BL. IV. RESULTADOS ..................................................................................................................... 15. IO. III. CA. 2.1. V. BI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS .............................................................................................. 22 ANEXOS .......................................................................................................................................... 25. x. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. IC AS. La necesidad de reducir el tiempo de diagnóstico, el fácil manejo de su proceso, el uso de equipos no sofisticados y la confiabilidad de esta son algunos de los requisitos para que una. G. prueba sea usada para el diagnostico. El presente estudio tiene por objetivo comparar la. LO. validación de los resultados obtenidos de pruebas rápidas SD Bioline Dengue Duo con el. BI O. método Gold Stándar (PCR-Tiempo Real), para el diagnóstico de Dengue en fase febril en muestras procedentes de la Región La Libertad 2017.Es necesario contar en los. AS. establecimientos de primer nivel de atención, con un método de diagnostico que brinde confiabilidad en los resultados y permita tomar decisiones de manera oportuna de control. EN CI. vectorial y clínico. Para medir el nivel de confiabilidad se usaron 187 muestras en fase febril (1 a 5 días de inicio de enfermedad), a las cuales se les procesó PCR tiempo real, y. CI. prueba rápida SD Bioline Dengue Duo obteniéndose el siguiente resultado: 44% positivo. positivo. (76. DE. (82 muestras) y 56% negativos (105 muestras) para diagnóstico molecular; y 40.6% muestras). y. 59.4%. negativas. (111. muestras). para. diagnostico. CA. inmunocromatografico.La sensibilidad de las pruebas rápidas es de 85.4%(VPP: 92.1%),. TE. demostrando que del total de resultados positivos en la prueba rápida, la probabilidad que sea verdaderamente positivo es 92.1%, la especificidad es de 94.3%(VPN: 89.2%). IO. demuestra que del total de resultados negativos en la prueba rápida, la probabilidad de ser. BL. verdaderamente negativo es 89.2% y los resultados de Chi-Cuadrado igual X2cal = 121.087,. BI. muestra una relación significativa entre los resultados obtenidos por prueba rápida y los obtenidos por el método Gold estándar PCR- Tiempo Real. Palabras clave: dengue, proteína NS1, febril, prueba rápida, PCR-Tiempo Real. xi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRAC. IC AS. The need to reduce the time of diagnosis, the easy handling of its process, the use of sophisticated equipment and the reliability of this subject. The objective of this study is to compare the validation of the results of the SD Bioline Dengue Duo rapid tests with the. LO. G. Gold Standard method (Real-Time PCR), for the diagnosis of dengue in the February phase in the responses of the La Libertad Region 2017.It is necessary to have the level of care. BI O. data, with a diagnostic method that provides reliability in the results and allows to take decisions in a timely manner of vector and clinical control.To measure the level of. AS. reliability, use 187 samples in the February phase (1 to 5 days after the onset of the. EN CI. disease), to which they were subjected to real-time PCR, and SD Bioline Dengue Duo rapid test, obtaining the following result: 44% positive (82 samples) and 56% negative (105. CI. samples) for molecular diagnosis; and 40.6% positive (76 samples) and 59.4% negative (111 samples) for immunochromatographic diagnosis.The sensitivity of the rapid tests is. DE. 85.4% (PPV: 92.1%), showing that the total of positive results in the rapid test, the. CA. probability of being truly positive is 92.1%, the specificity of 94.3% (NPV: 89.2%) shows that the total of negative results in the rapid test, the probability of being negative is 89.2%. TE. and the results of Chi-Square equal X2cal = 121.087, a relation between the results by the. BI. BL. IO. rapid test and the results by the Standard Gold Method PCR- Real Time.. Keywords: dengue, NS1 protein, febrile, rapid test, Real Time PCR.. xii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN. 1. El dengue es en la actualidad una de las enfermedades virales más importante transmitida por mosquitos que afecta a los seres humanos, es un problema creciente para la salud. IC AS. pública en las áreas tropicales del mundo. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2016), se estima entre 50-100 millones las nuevas infecciones que se producen. G. anualmente en más de 100 países endémicos.(1). LO. El dengue es una enfermedad viral, de carácter endémico-epidémico, transmitida por mosquitos del género Aedes, principalmente por Aedes aegypti, que constituye hoy la. BI O. arbovirosis más importante a nivel mundial en términos de morbilidad, mortalidad y afectación económica.(2). AS. Los primeros reportes de brotes de un síndrome febril compatible con dengue clásico en el país fueron descritos en 1700, 1818, 1850 y 1876, aunque no se tuvo confirmación en. EN CI. laboratorio. La reemergencia del dengue en el Perú en el siglo XX está ligado a la reintroducción del Aedes aegypti en 1984 (luego de su eliminación en 1956). En 1990 ocurrió una explosiva epidemia de dengue clásico por DENV-1 en las principales ciudades. CI. de nuestra Amazonía y en la actualidad casi todas las áreas del país que reportan la presencia de Aedes aegypti presentan casos de dengue y la circulación de cuatro. DE. serotipos.(1). En el año 2001 se reportaron más de 5000 casos de dengue en la región La Libertad, siendo. CA. la segunda región con mayor número de casos de dengue, en los años siguientes el número. TE. de casos de dengue se vio disminuido, debido a que se tomaron medidas de control vectorial para evitar la propagación del virus. Pero en el año 2015, surgió un aumento de. IO. casos y se reportaron un total de 2055, en 2016 un total de 4628 casos con el debut de. BL. nuevos distritos endémicos y en 2017 hasta la semana epidemiológica 43 con un total de 6544 casos de dengue en nuestra región.. BI. Según La OMS el año 2016 se caracterizó por grandes brotes de dengue en todo el mundo. La Región de las Américas notificó más de 2 380 000 casos ese año, y solo en Brasil hubo. 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. poco menos de 1 500 000 casos, es decir, cerca de tres veces más que en 2014. En la región se notificaron asimismo 1032 muertes por dengue.(3). IC AS. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) se puede clasificar la enfermedad en dos grupos: dengue, aquel que se presenta con síntomas parecidos a los de una gripe común y el dengue grave, que es una complicación del primero manifestándose además extravasación del plasma, acumulación de líquidos, dificultad respiratoria, hemorragias. LO. G. graves o falla orgánica.(3). El virus del dengue lo constituyen cuatro serotipos virales serológicamente diferenciables. BI O. (Dengue 1, 2, 3, y 4) que comparten analogías estructurales y patogénicas, por lo que cualquiera puede producir las formas graves de la enfermedad, aunque los serotipos 2 y 3. AS. han estado asociados a la mayor cantidad de casos graves y fallecidos.(2) Una vez que el individuo es picado por un mosquito infectado con cualquiera de los 4. EN CI. serotipos, se produce un período de incubación intrínseca alrededor del 7mo.-10mo. día de duración, durante el cual ocurre la replicación viral, que es máxima el 2do.-3er.día antes del. CI. comienzo de los síntomas y desaparece hacia el 5to.-6to. día de la enfermedad.(4) Para la detección del agente se recomienda la toma de muestras de sangre durante el. DE. período febril y sobre todo antes del 5to. día de comienzo de la enfermedad. El suero o plasma debe ser procesado casi inmediatamente o en su defecto almacenado a - 70 °C. En. CA. los fallecidos, deben obtenerse muestras de tejidos (hígado, bazo, nódulos linfáticos, sangre del ventrículo) lo antes posible, las que deben ser enviadas al laboratorio en condiciones de. TE. esterilidad, donde serán homogeneizadas y almacenadas a -70 °C hasta su posterior procesamiento. Las muestras de tejidos fijadas en formalina y embebidas en parafina. IO. pueden ser utilizadas para la detección de antígenos, con la utilización de métodos inmuno-. BL. histoquímicos o la detección del genoma viral mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR-Tiempo Real). Las muestras que se envíen para aislamiento o detección. BI. del genoma viral deben ser transportadas a 4 °C.(5) Para el diagnóstico serológico se recomienda la toma de una muestra de suero después del 5to. día de comienzo de los síntomas, para la determinación de anticuerpos IgM. El estudio 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. de muestras pareadas de sueros (tomadas en los primeros 7 días de comienzo de los síntomas y 14 a 21 d después) permite determinar el incremento en el título o la. IC AS. seroconversión de anticuerpos IgG.(5) Durante una infección secundaria de dengue, los títulos de anticuerpos se elevan rápidamente y reaccionan ampliamente contra el virus. La IgG es la que predomina, detectándose niveles altos aun en la fase febril, y persiste por largos periodos, mientras que. G. los títulos de IgM son significativamente inferiores en la infección secundaria que en la. LO. primaria.(4). BI O. El diagnostico se puede realizar en la fase febril que dura de cero a cinco días, esto se hace mediante técnicas que permiten el aislamiento y tipificación del virus, detección del ácido. AS. nucleico o de antígenos como la proteína no estructural NS1. Por otro lado, la serología es la más útil para el diagnóstico en la fase crítica y fase de recuperación (después del 5to.. EN CI. día), esto depende del sistema inmunitario y si se trata de una primo-infección o de una reinfección.(4) El diagnóstico integral del Dengue se hace sobre la base del cuadro clínico, factores epidemiológicos y por diversos métodos de laboratorio, basados fundamentalmente. CI. en el aislamiento viral y en técnicas serológicas; cada uno de ellos con distintos grados de. DE. sensibilidad, especificidad y complejidad.. Los métodos de diagnósticos modernos deben validarse y ser sensibles, específicos, rápidos, fáciles de utilizar, rentables y además estar automatizados para facilitar la. CA. evaluación de grandes cantidades de muestras.(6). TE. Las tecnologías basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR-Tiempo Real) han revolucionado los diagnósticos de las enfermedades infecciosas. Es precisamente en este. IO. aspecto, que el reciente desarrollo de la “reacción en cadena de la polimerasa (PCR)” ha. BL. venido a enriquecer la práctica diagnóstica molecular de las enfermedades infecciosas en los laboratorios de todo el mundo: una vez recolectada y preparada la muestra, ocurre en su. BI. seno la rápida multiplicación (amplificación) del DNA perteneciente al agente causal, y los millones de copias obtenidas incrementan notablemente la sensibilidad de cualquier técnica que se elija -a continuación- para lograr la detección correspondiente.(7) 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La inmunocromatografía es una de las técnicas de inmunodiagnóstico más modernas cuyas principales ventajas son la sencillez y rapidez de la prueba. Actualmente se utiliza como prueba rápida de tamizaje para la detección de antígenos o anticuerpos presentes en el suero. IC AS. del paciente.(8). La inmunocromatografía constituye un método cómodo de detección de antígenos en unos minutos sin necesidad de aparatos especiales. La muestra se aplica a un extremo de un filtro. G. en el que se inmoviliza anticuerpo y se aplican microperlas (como, por ejemplo de oro. LO. coloidal) conjugadas a anticuerpo. El antígeno de la muestra forma un inmunocomplejo con. BI O. el anticuerpo marcado con el oro coloidal. Este complejo se desplaza junto con la muestra líquida, y establece contacto con el anticuerpo inmovilizado en la membrana, donde forma un inmunocomplejo con el anticuerpo inmovilizado generando un producto coloreado que. AS. puede visualizarse a simple vista.. EN CI. En general, las pruebas con gran sensibilidad y especificidad requieren experiencia, conocimientos técnicos y tecnologías más complejas, en tanto que las pruebas rápidas pueden sacrificar la sensibilidad y especificidad por la facilidad de su realización y la. CI. velocidad de su práctica.. DE. Desde el año 2016 se viene presentando brotes de Dengue en diferentes distritos de las provincias de la región de la Libertad y con la presencia de 1 o 2 serotipos. Esta situación se agrava dado que la mayoría de los establecimientos de primer nivel de atención no. CA. cuentan con los equipos y reactivos para realizar el diagnóstico rápido por limitaciones. TE. presupuestales. Es por ello y teniendo como referencias estos antecedentes, la presente investigación está orientada a medir el nivel de confianza de una prueba rápida SD Bioline. IO. Dengue Duo con muestras determinadas positivas por PCR-Tiempo Real, procedentes de la región la libertad – 2017, para validarla y tener un diagnóstico oportuno, confiable y de. BI. BL. bajo costo para tomar medidas de atención al paciente y medidas de control de brote.. 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 1.1. ANTECEDENTES. El dengue es un problema creciente para la salud pública en las áreas tropicales del mundo,. IC AS. es en la actualidad la enfermedad viral transmitida por mosquitos más importante que afecta a los seres humanos. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2016), se estima entre 50-100 millones las nuevas infecciones que se producen anualmente en más de. LO. G. 100 países endémicos (10).. El dengue es una enfermedad viral, de carácter endémico-epidémico, transmitida por. BI O. mosquitos del género Aedes, principalmente por Aedes aegypti, que constituye hoy la arbovirosis más importante a nivel mundial en términos de morbilidad, mortalidad y. AS. afectación económica (9).. EN CI. Los primeros reportes de brotes de un síndrome febril compatible con dengue clásico en el país fueron descritos en 1700, 1818, 1850 y 1876, aunque no se tuvo confirmación laboratorial. La reemergencia del dengue en el Perú en el siglo XX está ligado a la. CI. reintroducción del Aedes aegypti en 1984 (luego de su eliminación en 1956). En 1990 ocurrió una explosiva epidemia de dengue clásico por DENV-1 en las principales ciudades. DE. de nuestra Amazonía y, en la actualidad, casi todas las áreas del país con presencia de. CA. Aedes aegypti presentan casos de dengue y la circulación de cuatro serotipos de dengue (10).. En el año 2001 se reportaron más de 5000 casos de dengue en la región La Libertad, siendo. TE. la segunda región con mayor número de casos de dengue, en los años siguientes el número. IO. de casos de dengue se vio disminuido, debido a que se tomaron medidas de control vectorial para evitar la propagación del virus. Pero en el año 2015, surgió un aumento de. BL. casos de dengue y se reportaron un total de 2055, en 2016 un total de 4628 casos con el. BI. debut de nuevos distritos endémicos y en 2017 hasta la semana epidemiológica 43 con un total de 6544 casos de dengue en nuestra región.. 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Según La OMS el año 2016 se caracterizó por grandes brotes de dengue en todo el mundo. La Región de las Américas notificó más de 2 380 000 casos ese año, y solo en Brasil hubo poco menos de 1 500 000 casos, es decir, cerca de tres veces más que en 2014. En la región. IC AS. se notificaron asimismo 1032 muertes por dengue.. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) se puede clasificar la enfermedad en. G. dos grupos: dengue, aquel que se presenta con síntomas parecidos a los de una gripe común. LO. y el dengue grave, que es una complicación del primero manifestándose además extravasación del plasma, acumulación de líquidos, dificultad respiratoria, hemorragias. BI O. graves o falla orgánica(11).. AS. El virus del dengue lo constituye cuatro serotipos virales serológicamente diferenciables (Dengue 1, 2, 3, 4 y 5) que comparten analogías estructurales y patogénicas, por lo que. EN CI. cualquiera puede producir las formas graves de la enfermedad, aunque los serotipos 2 y 3 han estado asociados a la mayor cantidad de casos graves y fallecidos (9). Una vez que el individuo es picado por un mosquito infectado con cualquiera de los 4. CI. serotipos, se produce un período de incubación intrínseca alrededor de 7-10 días de. DE. duración, durante el cual ocurre la replicación viral, que es máxima 2-3 d antes del comienzo de los síntomas y desaparece hacia el 5to.-6to. día de la enfermedad(13). CA. Para la detección del agente se recomienda la toma de muestras de sangre durante el período febril y sobre todo antes del 5to. día de comienzo de la enfermedad. El suero o. TE. plasma debe ser procesado casi inmediatamente o en su defecto almacenado a - 70 °C. En. IO. los fallecidos, deben obtenerse muestras de tejidos (hígado, bazo, nódulos linfáticos, sangre del ventrículo) lo antes posible, las que deben ser enviadas al laboratorio en condiciones de. BL. esterilidad, donde serán homogeneizadas y procesadas o almacenadas a -70 °C hasta su. BI. posterior procesamiento. Las muestras de tejidos fijadas en formalina y embebidas en parafina pueden ser utilizadas para la detección de antígenos, con la utilización de métodos inmuno-histoquímicos o la detección del genoma viral mediante la reacción en cadena de la. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. polimerasa (PCR-Tiempo Real). Las muestras que se envíen para aislamiento o detección del genoma viral deben ser transportadas a 4 °C.(12).. IC AS. Para el diagnóstico serológico se recomienda la toma de una muestra de suero después del 5to día de comienzo de los síntomas, para la determinación de anticuerpos IgM. El estudio de muestras pareadas de sueros (tomadas en los primeros 7 días de comienzo de los. G. síntomas y 14 a 21 d después) permite determinar el incremento en el título o la. LO. seroconversión de anticuerpos IgG (12).. BI O. Durante una infección secundaria de dengue, los títulos de anticuerpos se elevan rápidamente y reaccionan ampliamente contra el virus. La IgG es la que predomina, detectándose niveles altos aun en la fase febril, y persiste por largos periodos, mientras que. AS. los títulos de IgM son significativamente inferiores en la infección secundaria que en la. EN CI. primaria (13). Es de gran importancia el diagnóstico eficiente y preciso del dengue para la atención clínica, es decir la detección temprana de casos graves, la confirmación de casos y el. CI. diagnóstico diferencial con otras enfermedades infecciosas.. DE. El diagnostico se puede realizar en la fase febril que dura de cero a cinco días, esto se hace mediante técnicas que permiten el aislamiento y tipificación del virus, detección del ácido. CA. nucleico o de antígenos como la proteína no estructural NS1. Por otro lado la serología es la más útil para el diagnóstico en la fase crítica y fase de recuperación (después del quinto. TE. día), esto depende del sistema inmunitario y si se trata de una primo-infección o de una. IO. reinfección (12). El diagnóstico integral del Dengue se hace sobre la base del cuadro clínico, factores. BL. epidemiológicos y por diversos métodos de laboratorio, basados fundamentalmente en el. BI. aislamiento viral y en técnicas serológicas; cada uno de ellos con distintos grados de sensibilidad, especificidad y complejidad.. 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los métodos de diagnósticos modernos deben validarse y ser sensibles, específicos, rápidos, fáciles de utilizar, rentables y además estar automatizados para facilitar la evaluación de grandes cantidades de muestras (14). IC AS. Las tecnologías basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR-Tiempo Real) han revolucionado los diagnósticos de las enfermedades infecciosas. Es precisamente en este aspecto, que el reciente desarrollo de la “reacción en cadena de la polimerasa (PCR)” ha. G. venido a enriquecer la práctica diagnóstica molecular de las enfermedades infecciosas en. LO. los laboratorios de todo el mundo: una vez recolectada y preparada la muestra, ocurre en su seno la rápida multiplicación (amplificación) del DNA perteneciente al agente causal, y los. BI O. millones de copias obtenidas incrementan notablemente la sensibilidad de cualquier técnica que se elija -a continuación- para lograr la detección correspondiente.(15). AS. La inmunocromatografía es una de las técnicas de inmunodiagnóstico más modernas cuyas principales ventajas son la sencillez y rapidez de la prueba. Actualmente se utiliza como. EN CI. prueba rápida de tamizaje para la detección de antígenos o anticuerpos presentes en el suero del paciente. (16). CI. La inmunocromatografía constituye un método cómodo de detección de antígenos en unos. DE. minutos sin necesidad de aparatos especiales. La muestra se aplica a un extremo de un filtro en el que se inmoviliza anticuerpo y se aplican microperlas (como por ejemplo, de oro coloidal) conjugadas a anticuerpo. El antígeno de la muestra forma un inmunocomplejo con. CA. el anticuerpo marcado con el oro coloidal. Este complejo se desplaza junto con la muestra. TE. líquida, y establece contacto con el anticuerpo inmovilizado en la membrana, donde forma un inmunocomplejo con el anticuerpo inmovilizado generando un producto coloreado que. BL. IO. puede visualizarse a simple vista.(14). En general, las pruebas con gran sensibilidad y especificidad requieren experiencia,. BI. conocimientos técnicos y tecnologías más complejas, en tanto que las pruebas rápidas pueden sacrificar la sensibilidad y especificidad por la facilidad de su realización y la velocidad de su práctica.. 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Teniendo como referencias estos antecedentes, la presente investigación está orientada a medir el nivel de confianza de una prueba rápida SD Bioline Dengue Duo con muestras. 1.2. IC AS. determinadas positivas por PCR-Tiempo Real, procedentes de la región la libertad – 2017. MARCO TEORICO. El diagnóstico médico es un proceso dinámico en el que se intenta tomar decisiones idóneas en presencia de incertidumbre. En este proceso intervienen distintos instrumentos que tratan de. G. reducir el grado de incertidumbre con el que se emiten los juicios diagnósticos. Desde el punto de. LO. vista funcional, considera prueba diagnóstica a cualquier procedimiento realizado para confirmar o. BI O. descartar un diagnostico o incrementar o disminuir su verosimilitud. La utilidad de una prueba diagnóstica depende, fundamentalmente, de su validez y de su fiabilidad, pero también de su rendimiento y de su costo. (17). AS. Un test de diagnóstico sirve para obtener información adicional del estado de salud del. EN CI. paciente. El tipo de información adquirida mediante la utilización de un test diagnostico no solo incluye a la presencia o ausencia de una enfermedad, sino que también a la etapificacion de una enfermedad conocida o bien a establecer la existencia de determinada. CI. condición, no necesariamente la enfermedad.(18). DE. La Validación de una prueba consiste en medir lo que realmente queremos medir. La validez se evalúa comparando los resultados de la prueba con los de un patrón de referencia. CA. o el método gold – estándar. La evaluación de esta prueba se realiza usando indicadores: sensibilidad, especificidad y valores predictivo positivo y negativo.. TE. La sensibilidad y la especificidad son características intrínsecas de la prueba diagnóstica, mientras que los valores predictivos dependen también de la prevalencia o probabilidad. BL. IO. preprueba de la enfermedad a estudiar.(17). La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica. BI. millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente. Para ello, la reacción aprovecha la actividad. de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células. En la reacción, si usamos como sustrato ADN genómico, entonces típicamente 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. hablamos de una PCR, pero si usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se le conoce como RT-PCR (Reverse TranscriptionPCR, por sus siglas en inglés). Esta conversión se logra mediante una reacción conocida. IC AS. como transcripción reversa y controlada por la enzima transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una molécula de ADNc. Este método fue copiado de los retro virus que usan una transcriptasa reversa para convertir su genoma de ARN en ADN duplicarse en. G. millones de partículas virales. El ADNc se utiliza cuando analizamos la expresión del. 1.3. BI O. LO. ARNm de algún gen de interés.(19). OBJETIVO 1.3.1. OBJETIVO GENERAL:. AS. Determinar el nivel de correlación del uso de la prueba rápida SD Bioline Dengue. EN CI. Duo con la prueba PCR-Tiempo Real, para el diagnóstico de Dengue en fase febril en muestras procedentes de la Región La Libertad -2017. 1.3.2. OBJETIVO ESPECIFICO. Sistematizar la base de datos, bajo los criterios de los resultados obtenidos. CI. -. DE. por PCR-Tiempo Real y Prueba Rápida SD Bioline Dengue Duo. -. Determinar el porcentaje de certeza y error de las pruebas Rápida SD Bioline. CA. Dengue Duo, en función de los resultados obtenidos por PCR. Aplicar método estadístico para validar el uso de pruebas rápidas.. BI. BL. IO. TE. -. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1. MATERIALES Y METODOS. IC AS. II. OBJETO DE ESTUDIO:. Validación comparada de la Prueba rápida SD Bioline Dengue Duo con el método Gold. G. Stándar (PCR-Tiempo Real), para el diagnóstico de Dengue en fase febril en muestras. METODOS Y TECNICAS:. BI O. 2.2. LO. procedentes de la Región La Libertad 2017".. Se emplearan los registros de resultados de 187 sueros de pacientes en fase febril, con Prueba Rápida SD Bioline Dengue Duo, confrontados con los resultados obtenidos por el. AS. método Gold estándar (PCR), correspondientes al año 2017; para determinar el nivel de. EN CI. correlación del uso de la prueba rápida con la prueba PCR-Tiempo Real. Prueba rápida SD Bioline Dengue Duo NS1. CI. La prueba rápida SD BIOLINE Dengue Duo es un ensayo in Vitro inmunocromatográfico de un paso diseñado para detectar tanto el antígeno NS1 del virus. DE. del dengue como los anticuerpos diferenciales IgG/IgM para el virus del dengue en plasma o suero humano. Esta prueba rápida SD BIOLINE Dengue Duo contiene dos dispositivos. CA. de prueba (lado izquierdo; prueba del Ag NS1 del dengue, lado derecho; prueba de IgG/IgM para dengue). La prueba rápida de Ag NS1 para dengue en el lado izquierdo es. TE. una prueba de un paso in Vitro inmunocromatográfica diseñada para la determinación. IO. cualitativa del antígeno NS1 del virus del dengue en suero humano, o plasma para el diagnóstico de la infección inicial aguda del dengue. Este dispositivo de prueba contiene. BL. una tira con membrana, la cual está precubierta con Ag de captura NS1 anti-dengue en la. BI. región de la banda de prueba. El conjugado de coloide de oro con Ag NS1 anti-dengue y la muestra de suero o plasma se mueven a los largo de la membrana cromatográficamente hacia la región de prueba (T) y forma una línea visible como el complejo anticuerpoantígeno-anticuerpo partícula de oro. 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. De la estabilidad y almacenamiento del kit, La prueba rápida SD BIOLINE Dengue Duo debe almacenarse a temperatura ambiente. La tira de prueba es sensible a la humedad así como al calor. Realice la prueba inmediatamente después de retirar la tira de prueba del. prueba (lote: 11DDC007A) Fecha de vencimiento (01/MARZO/2019) [SD BIOLINE Dengue NS1 Ag].. Retire el dispositivo de muestra del empaque de aluminio y colóquela en una. G. 1.. IC AS. empaque de aluminio. No lo use después de la fecha de caducidad. Procedimiento de la. 2.. LO. superficie plana y seca.. Con un gotero desechable, añada 3 gotas (cerca de 100㎕) de muestra en el. 3.. BI O. pozo de muestra (S).. Como la prueba comienza a funcionar, verá moverse color púrpura a través. AS. de la ventana de resultados en el centro del dispositivo de la prueba. Interprete los resultados de la prueba a los 15-20 minutos.. 5.. Un resultado positivo no cambiará una vez que ha sido establecido a los 15-. EN CI. 4.. 20 minutos. De cualquier modo, para prevenir cualquier resultado incorrecto,. CI. el resultado de la prueba no deberá ser interpretado después de 20 minutos.. RT-PCR-Tiempo Real Extracción del material genético (ARN – Viral). DE. . 1. AL ABRIR UN KIT. CA. Reconstituir el carriel (tapa Roja) según indica el vial, agregando 310 uL de AVE al carrier liofilizado, usar a 4°c y conservar a -20, preparar la cantidad suficiente de. BI. BL. IO. TE. AVL según Indica la siguiente tabla.. 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla N° 01. Volúmenes de AVL (buffer) y RNA-AVE (carrier), para procedimiento manual en QIAamp Viral RNA.. G. 1 2 3 4 5 10. Vol. Carrier RNA- AVE(uL) 5.6 11.2 16.8 22.4 28.0 56.0. IC AS. Vol. Buffer AVL (ml) 0.56 1.12 1.68 2.24 2.8 5.6. LO. N° Muestras. PROTOCOLO DE EXTRACCION. BI O. 1. Agregar 560 uL de la mezcla AVL – carrier a un vial eppndorf de 1.5 ml. 2. Agregar 140 uL de suero al vial, mezclar por 15 segundos. 3. Centrifugar (mini-spin).. AS. 4. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente.. EN CI. 5. Adicionar 560 ul de Etanol absoluto, vortexear 15 seg. 6. Centrifugar por unos segundos (mini Spin).. 7. Agregar 630 ul de la solución del paso anterior a la columna de silica.. CI. 8. Centrifugar 8,000 rpm por 1 minuto.. 9. Descartar el tubo que contiene el filtrado y realizar el paso 7.. DE. 10. Descartar el tubo que contiene el filtrado. 11. Lavar con 500 ul de buffer AW1 a cada muestra.. CA. 12. Centrifugar 8,000 rpm por 1 minuto. 13. Lavar con 500 ul de buffer AW2 a cada muestra.. TE. 14. Centrifugar a 14,000 rpm por 3 minutos. 15. Adicionar 60 ul de buffer AVE, incubando 1 minuto.. IO. 16. Centrifugar por 8,000 rpm por 1 minuto.. BI. BL. 17. Recuperar el eluído estéril y conservar a -40°c.. 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla N° 02: Volúmenes de ingredientes del Master Mix, según el número de reacciones. 1Rx. 10Rx. 1X. 12.50. 125.0. 0.5 uM 0.5 uM 0.15 uM 0.5 uM 0.5 uM 0.15 uM 0.5 uM 0.5 uM 0.15 uM 0.5 uM 0.5 uM 0.15 uM 0.25 uL/react. 0.61 0.63 0.63 0.4 0.63 0.63 0.4 0.63 0.63 0.4 0.63 0.63 0.4 0.25 20.0. 6.1 6.3 6.3 4.0 6.3 6.3 4.0 6.3 6.3 4.0 6.3 6.3 4.0 2.5 200.0. LO. G. IC AS. CONCENTRACION. BI O. MIX 2x RG Multiplex RT- PCRMaster Mix RNase – Free water Primer DEN1-F 20 uM Primer DEN1-C 20 uM Probe DEN1-10 uM Primer DEN2-F 20 uM Primer DEN2-C 20 uM Probe DEN2-10 uM Primer DEN3-F 20 uM Primer DEN3-C 20 uM Probe DEN3-10 uM Primer DEN4-F 20 uM Primer DEN4-C 20 uM Probe DEN4-10 uM Enzima (RG-TAQ MIX) TOTAL. NOTA: Agregar a la muestral 7.0 uL de ARN extraído y Control positivo. EN CI. Tiempo 15 min 5min 15 seg 35 seg. Ciclos 1 ciclo 1 ciclo 45 ciclos 45 ciclos. 2.3. DE. CI. Temperatura Reverso transcripción (50°C) Activación de enzima (95°C) Desnaturalización (95°C) Extensión (60°C). AS. Tabla N° 03: Ciclaje RT – PCR Multiplex – Dengue – Tiempo Real.. ANALISIS ESTADISTICO:. CA. Los datos obtenidos en los procedimientos metodológicos fueron procesados utilizando un programa estadístico para medir la Sensibilidad y Especificidad de la prueba. TE. rápida con sus respectivos valores predictivos. Así mismo para determinar dependencia CHI CUADRADO con corrección de continuidad y LA PRUEBA phi (confirma chi. BI. BL. IO. cuadrado y determina el grado de asociación que tiene las variables).. 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. III. RESULTADOS. Para medir el nivel de confiabilidad se usaron 187 muestras en fase febril (1 a 5 días de. IC AS. inicio de enfermedad), las cuales se procesó de RT - PCR tiempo real, obteniéndose el siguiente resultado:. G. Tabla N° 04: Frecuencias obtenidas en base al procesamiento de muestras por RT – PCR Tiempo Real - Dengue. N°. %. POSITIVO. 82. NEGATIVO. 105. 56.1. Total. 187. 100.0. LO. PCR - Dengue. AS. BI O. 43.9. Prueba rápida. CI. POSITIVO. EN CI. Tabla N° 05: Frecuencias obtenidas en base al procesamiento de muestras por Prueba rápida SD Bioline Dengue Duo.. DE. NEGATIVO Total. %. 76. 40.6. 111. 59.4. 187. 100.0. FECHA VENCIMIENTO:. 01/MARZO/2019. BI. BL. IO. TE. CA. LOTE: 11DDC007A. N°. 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD. Para la Sensibilidad y Especificidad, se confrontaron los resultados obtenidos de las. IC AS. pruebas rápidas con el método Gold Stándar RT –PCR tiempo real, dando el siguiente resultado:. PCR - Dengue Prueba rápida. NEGATIVO. 12. Total. 82. AS. 70. 6. 76. 99. 111. 105. 187. EN CI. POSITIVO. Total. NEGATIVO. BI O. POSITIVO. LO. G. Tabla N° 06: Comparación del SD Bioline Dengue Duo en la detección de la proteína NS1 con el método Gold Estándar (RT – PCR- Tiempo Real).. Tabla N° 07: Sensibilidad y Especificidad de la prueba rápida SD Bioline Dengue Duo.. SENSIBILIDAD OBTENIDA. ESPECIFICIDAD OBTENIDA. 85.4%. 94.3%. CI. METODO Dx.. TE. CA. DE. PRUEBA RÁPIDA. BI. BL. IO. Tabla N° 08: Valor predictivo positivo y valor predicitivo negativo, para la prueba rápida SD Bioline Dengue Duo.. METODO Dx.. VPP. VPN. PRUEBA RÁPIDA. 92.1%. 89.2%. 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 1. Grados de libertad:. EN CI. AS. BI O. LO. G. IC AS. Figura N° 01: Chi cuadrado para la prueba rápida SD Bioline Dengue Duo.. k=1. α = 0.05. 2. El valor Alfa. X2g.l;α = 3.841. CI. 3. El valor que se busca:. X2CAL = 121.087. DE. H0 = No existe relación significativa entre los resultados de PCR y Prueba Rápida. CA. H1 = Si existe relación significativa entre los resultados de PCR y Prueba Rápida. Decisión: Se rechaza la hipótesis nula.. TE. Conclusión: Los resultados del PCR se relacionan significativamente con los. BI. BL. IO. resultados del PR. 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IV. DISCUSION. El presente estudio evaluó la validación de la prueba rápida SD Bioline Dengue Duo,. IC AS. comparando con el método Gold Stándar (PCR-Tiempo Real). Durante el periodo de estudio se capto una población de 187 muestras en fase aguda (1 – 5 días de inicio de enfermedad) las cuales se les proceso PCR – Tiempo Real obteniendo: 44% positivo (82. G. muestras) y 56% negativos (105 muestras) y en la prueba rápida se obtuvo: 41% positivo. LO. (76 muestras) y 59% negativas (111 muestras).. Los parámetros que se determinaron para conocer la validez de la prueba diagnóstica. BI O. fueron la sensibilidad y especificidad; y para conocer la seguridad de la prueba fueron los valores predictivos.. AS. En la Tabla N° 07, los valores de sensibilidad y especificidad para la detección de NS1,. EN CI. encontrados en el presente estudio fueron de 85.4% y 94.3% respectivamente. Así mismo con la sensibilidad, este método de diagnostico estaría demostrando que del total de 82 muestras positivas, la prueba rápida detecta el 85.4%(70 muestras) y 14.6%(12 muestras) serian falsos negativos; y la especificidad de un total de 105 muestras negativas, la prueba. CI. rápida descartaría el 94.3%(99 muestras) y 5.7%(6 muestras) serian falsos positivos.. DE. En la Tabla N° 08, los valores predictivos encontrados; con una prevalencia de 44% son de: VPP 92.1% y VPN 89.2%, demostrando que del total de 76 muestras con prueba rápida. CA. positiva el 92.1%(70 muestras) son verdaderos positivos y 7.9%(6 muestras) serian los falsos negativos y de 111 muestras con resultados negativo en prueba rápida el 89.2%(99. TE. muestras) son los verdaderos negativos y el 10.8%(12 muestras) serian los falsos negativos. Se han realizado diferentes evaluaciones a nivel internacional de sistemas que detectan la. IO. proteína NS1, tanto tipo ELISA como en formato prueba rápida. Andries y otros al. BL. evaluación el impacto en el manejo clínico de un Kit de diagnóstico rápido SD Dengue Duo. que detecta el dengue NS1, IgM e IgG, encontraron una sensibilidad de 58.4% y 98.3 % de. BI. especificidad y los valores predictivos positivo y negativo 98% y 63.1% respectivamente, comparadas también con la técnica TR-RCP.(21). 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tricou y otros al valorar el sistema rápido anterior en conjunto con el SD Dengue Duo. IC AS. encontraron una sensibilidad de 62,4% y 100 % de especificidad y los valores predictivos positivo y negativo 100% y 33,8% respectivamente, comparadas también con la técnica. G. TR-RCP.(22) Valdez y otros, al evaluar el sistema de diagnostico SD Bioline Dengue Duo. LO. encontraron una sensibilidad de 57.75%(IC 95% 45,55-69,94) y una especificidad de 98,89%(IC 95% 96,17-100), utilizando como método de comparación el kit comercial. BI O. Platelia NS1.(25) Hang y otros al evaluar el sistema prueba rápida de flujo lateral NS1. AS. (LFRT- BIORAD), encontraron 73 % de sensibilidad y 100 % de especificidad utilizando TR-RCP en tiempo real como prueba de referencia.(23) Wang y otros al valorar el sistema. EN CI. rápido anterior en conjunto con el SD Dengue Duo encontraron una sensibilidad de 65,4% y 98,8%, respectivamente, y los valores predictivos positivo y negativo. 99,2 y 55,2. CI. respectivamente, comparadas también con la técnica TR-RCP.(26) Dussart y otros,. DE. evaluaron dos pruebas rápidas y encontraron una sensibilidad y especificidad de 76% y 100 % (Dengue NS1 Ag strip x 15 min.), y 77.6% y 100% (Dengue NS1 Ag strip x 30 min), en. CA. muestras colectadas a los 4 y 5 días o más, respectivamente, utilizando la prueba NS1 Ag. TE. Strip (BIORAD) en comparación con Platelia NS1(24).. IO. Andries, Tricou, Valdez y Wang, usaron SD Dengue Duo encontrando observándose una. BL. baja sensibilidad y una alta especificidad, respaldando el presente estudio. Así mismo Hang. BI. y Dussart usaron pruebas rápida de otras marcas demostrando la misma tendencia. Se ha planteado que la detección de la proteína NS1 se favorece si las muestras son tomadas dentro de los primeros días de comenzado los síntomas, donde los niveles de NS1 19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. son más altos y los de anticuerpos son bajos o están ausentes, porque la presencia de anticuerpos afecta la detección por la formación de inmunocomplejos20. IC AS. Los resultados obtenidos en el presente estudio, no coinciden con los del kit puesto que no se considero los días de enfermedad ya que la producción de anticuerpos inhibe la. G. detección de antígenos. Así mismo un resultado negativo puede presentarse si la cantidad. LO. de antígeno NS1 del virus del dengue presente en la muestra está por debajo de los limites. BI O. de detección del ensayo.. La determinación del nivel de correlación del uso de la prueba rápida SD Bioline Dengue Duo con la prueba PCR-Tiempo Real, para el diagnóstico de Dengue en fase febril se uso el. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI. EN CI. AS. método estadístico de CHI CUADRADO, con un intervalo de confianza de 0.95.. 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSION. V. IC AS.  Existe un nivel de correlación aceptable en el uso de la prueba rápida SD Bioline Dengue Duo, planteándose que la detección de la proteína NS1 se favorece si las muestras son tomadas dentro de los primeros días de comenzado los síntomas.. LO. G.  Todo establecimiento del primer nivel de atención debe implementar el uso regular de las pruebas rápidas para determinar diagnostico presuntivo, y tomar acciones. BI O. que ayuden a cortar transmisión y controlar un posible brote en forma oportuna; no dejando de lado el envío de las muestras a un establecimiento de nivel superior para. AS. determinar diagnóstico definitivo.. EN CI.  los valores de sensibilidad, especificidad y los valores predictivos positivos y negativo señalan que la prueba rápida es aceptable en las condiciones en que se. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI. justifique su utilización, ya sea por su sencillez.. 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. de siglo de su reemergencia. Rev. Peruana de Medicina Experimental y Salud Pública 2015; 32(1):1-9. 11. Organización Mundial de La Salud. Dengue y Dengue Grave. Nota. 12. IC AS. Descriptiva. Abril 2017.. Guzmán María, Vásquez Sunana. Apuntes sobre el Diagnostico de Laboratorio del virus Dengue, Rev. Cubana Medicina Tropical, 2002;. Arias Puentes J. Análisis de la respuesta inmunitaria inflamatoria en la. LO. 13. G. 54(3):180-88. infección por virus dengue y su significancia clínica. [TESIS DOCTORAL].. BI O. ALCALÁ, UNIVERISDAD ALCALÁ DE HENARES, 2011. 14. Biotecnología para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Asamblea. AS. Mundial de Delegados de la OIE, Mayo 2012.Cap.3.2. 15. Garza R, López M, Saavedra T. La reacción en cadena de la polimerasa y su. EN CI. aplicación al diagnóstico de las enfermedades bacterianas. Universidad Nacional. Autónoma. de. México.. 1998.. Disponible. en. http://depa.fquim.unam.mx/bacteriologia/pdfs/ART%CDC-PCR.pdf Paz M, Gaitán I. Manual de prácticas de laboratorio de inmunología.. CI. 16. Universidad Mariano Gálvez Guatemala. 2013. C. Ochoa Sangrador, G. Orejas. Epidemiologia y metodología científica. DE. 17. aplicada a la pediatría (IV): Pruebas diagnósticas. Asociación Española de. CA. Pediatría.1999; 50:301-314. 18. Sebastián Bravo Grau, Juan Pablo Cruz Q. Estudios de exactitud diagnostica:. 19. TE. Herramientas para su interpretación. Rev Chil Radiol.2015:21(4).158-164. Tamay de Dios L, Ibarra C, Velasquillo C. Fundamentos de la reacción en. BL. IO. cadena. BI. 20. de. la. polimerasa. (PCR). y. de. la. PCR. en. tiempo. real.Rev.Med.Mex.2013; 2(2)70 – 78. Young PR, Hilditch PA, Bletchly C, Halloran W. An antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay reveals high levels of the dengue virus protein NS1 in the sera of infected patients. J Clin Microbiol. 2000;38 (3):1053-7. 23. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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(37) EN CI. AS. BI O. LO. G. IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI. ANEXOS. 25. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) BI O. LO. G. IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CABINA DE BIOSEGURIDAD MASTER MIX. BL. IO. TE. CA. DE. CI. EN CI. AS. PRUEBA RAPIDA SD – BIOLINE DENGUE DUO. CENTRIFUGA REFRIGERADA. BI. TERMOCICLADOR. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI. EN CI. AS. BI O. LO. G. IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI. EN CI. AS. BI O. LO. G. IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 28. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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