Estandarización y validación de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa Nested Múltiple para el diagnóstico de HTLV 1

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. CI. AS. BI. O. LO. G. IC A. S. ESCUELA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. TE CA. DE. CI. EN. Estandarización y validación de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa Nested Múltiple para el diagnóstico de HTLV-1. TESIS. PARA OBTENER EL TITULO PROFESIONAL DE:. IO. BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO. BL. AUTOR. : Br. SERRANO SEGURA, Kevin Osnar. BI. ASESORA : Dra. LUJAN VELASQUEZ, Manuela CO-ASESORES : CÁRDENAS BUSTAMANTE, Fany MIRANDA ULLOA, Eduardo Fernando ROMERO RUIZ, Soledad Elena TRUJILLO – PERÚ 2019. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. G. CI. AS. BI. O. LO. Dr. Orlando Moisés Gonzáles Nieves RECTOR. IC A. S. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. TE CA. DE. CI. EN. Dr. Rubén César Vera Véliz VICE-RECTOR ACADÉMICO. BI. BL. IO. Dr. Steban Alejandro Ilich Zerpa SECRETARIO. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. G. IC A. S. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. LO. Dr. Freddy Mejía Coico. CI. AS. BI. O. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. Dr. William Zelada Estraver. TE CA. DE. CI. EN. SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. Dr. Jaime Agreda Callirgo. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE. BI. BL. IO. MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEL ASESOR. El que suscribe: Dra. Manuela Lujan Velásquez, asesora de la presente tesis titulada:. S. Estandarización y validación de la técnica de Reacción en Cadena de la. IC A. Polimerasa Nested Múltiple para el diagnóstico de HTLV-1. O. LO. G. CERTIFICA:. BI. Que ésta ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por. AS. la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad con su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido. EN. CI. redactado acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.. CI. Por lo tanto, autorizo a Serrano Segura Kevin Osnar, continuar con el. TE CA. DE. trámite del reglamento correspondiente.. BL. IO. Trujillo, abril del 2019. BI. ___________________________ Dra. Manuela Lujan Velásquez ASESOR. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. IC A. S. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. G. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de. LO. Grados y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra. O. consideración y criterio, el informe de tesis titulado: Estandarización y validación. BI. de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa Nested Múltiple para el. AS. diagnóstico de HTLV-1, con el propósito de obtener el Título Profesional de. DE. CI. EN. CI. Biólogo – Microbiólogo.. BI. BL. IO. TE CA. Trujillo, abril del 2019. __________________________ Br. Serrano Segura Kevin Osnar. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. _________________________________. CI. AS. BI. O. LO. PRESIDENTE. G. Dr. Heber Max Robles Castillo. IC A. S. MIEMBROS DEL JURADO. EN. _________________________________. CI. Ms. C. Juan Hector Wilson Krugg. _________________________________ Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez VOCAL. BI. BL. IO. TE CA. DE. SECRETARIO. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador,. S. declaran que el presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales. BI. O. LO. G. IC A. y fundamentales, siendo aprobado por unanimidad.. _________________________________. AS. Dr. Heber Max Robles Castillo. DE. CI. EN. CI. PRESIDENTE. _________________________________. SECRETARIO. BI. BL. IO. TE CA. Ms. C. Juan Hector Wilson Krugg. _________________________________ Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez VOCAL. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. S. A Dios, por haberme dado la vida, guiado y ser mi mayor soporte en los. IC A. momentos de alegría y tristeza y de cada obstáculo que se presenta en el. G. camino.. LO. A mis padres Elmer y Amelia, por haber sido mi principal inspiración para continuar a pesar de las dificultades de la vida y que lo más importante es el. O. amor, respeto, responsabilidad, honestidad en cada una de las metas que uno. AS. BI. se traza en la vida y el cariño incondicional a los hijos y la familia.. A mi hermana Fiorela, por comprenderme, ayudarme y darme palabras de. CI. aliento en momentos de apuros, por ser un ejemplo de humildad y de servicio al. EN. prójimo.. CI. A mi familia, porque a lo largo de todo el periodo de estudio estuvieron apoyándome incondicionalmente, y darme un ejemplo claro que a pesar que uno. BI. BL. IO. TE CA. de cada miembro.. DE. pueda tener diferencias la familia debe permanecer unida, respetando las ideas. KEVIN OSNAR SERRANO SEGURA. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTOS. Mis agradecimientos a mi asesora Dra. Manuela Natividad Luján. IC A. conocimientos académicos durante mi formación profesional.. S. Velásquez, por brindarme su tiempo, apoyo y consejos en base a sus. G. Mis más profundos agradecimientos a mis co-asesores Fany Cárdenas. LO. Bustamante, Soledad Elena Romero Ruiz, Eduardo Fernando Miranda Ulloa, por. BI. O. su dedicación, tiempo y para la realización de este trabajo de investigación.. Mis agradecimientos especiales a mi tutora Susan Espetia Anco por su. AS. constante dedicación, tiempo, conocimientos y experiencia para la ejecución de. CI. este trabajo de investigación.. EN. Mis agradecimientos al Instituto Nacional de Salud por permitirme. CI. desarrollar el trabajo de investigación en el Laboratorio de Referencia Nacional. DE. VTS - VIH/SIDA.. Mis agradecimientos al personal del Laboratorio de Referencia Nacional. TE CA. VTS - VIH/SIDA por su apoyo, tiempo y tolerancia en la ejecución de este trabajo. BI. BL. IO. de investigación.. KEVIN OSNAR SERRANO SEGURA. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INDICE. DEDICATORIA ...................................................................................................................... viii. S. AGRADECIMIENTOS .............................................................................................................. ix. IC A. RESUMEN............................................................................................................................... xi. LO. G. ABSTRACT............................................................................................................................. xii. INTRODUCCION ...................................................................................................................... 1. Diseño metodológico .................................................................................................... 6. BI. 2.1.. O. METODOS ............................................................................................................................... 6. Tipo de investigación ............................................................................................... 6. 2.1.2.. Población................................................................................................................. 6. 2.1.3.. Muestra y muestreo ................................................................................................. 6. 2.1.4.. Variables ................................................................................................................. 7. 2.1.5.. Técnicas e instrumentos de recolección de datos..................................................... 9. 2.1.6.. Procedimientos y análisis de datos ........................................................................ 12. CI. EN. CI. AS. 2.1.1.. DE. RESULTADOS........................................................................................................................ 18 Resultados de la estandarización ............................................................................. 18. 3.2.. Resultados de la validación ...................................................................................... 22. TE CA. 3.1.. DISCUSION ............................................................................................................................ 29. IO. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 33. BL. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 34. BI. ANEXOS................................................................................................................................. 40. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. DE. CI. EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC A. S. En el Perú se desconoce la existencia de un algoritmo normativo de diagnóstico, se asume que es similar al del VIH por ello se estandarizó y validó una prueba de PCR nested múltiple para el diagnóstico de HTLV-1 en muestras de ADN proviral de material de referencia de la línea celular MT-2. Se validó la prueba con muestras de ADN proviral a partir de sangre total, se determinó en 70 muestras caracterizadas por serología, su sensibilidad y especificidad analítica, veracidad y precisión en comparación con la prueba de inmunoblot (gold estándar). Los resultados de la validación mostraron un límite de detección de 0.5 ng de ADN por reacción de 25 µL del gen Pol y LTR y una precisión con una tasa de detección 100% para 0.4, 0.5 y 0.6 ng de ADN. Además, en comparación con una prueba de Inmunoblot (INNOLIA) considerada prueba de referencia para nuestro estudio, la PCR nested múltiple obtuvo un 97% de sensibilidad, 100% de especificidad, un valor predictivo positivo y negativo de 97.5 y 99.9% respectivamente y un factor de concordancia kappa de 0.97. El método estandarizado (PCR nested múltiple) en este estudio es idóneo y valido para el diagnóstico de HTLV-1 en muestras de sangre total y puede ser implementado en el algoritmo del diagnóstico de HTLV en el Laboratorio de Referencia Nacional de VTS-VIH/SIDA y resolver los resultados indeterminados para el diagnóstico confirmatorio de los niños menores de 18 meses con una alta sensibilidad y especificidad.. BI. BL. IO. TE CA. Palabras clave: HTLV-1, PCR nested, sensibilidad, especificidad, validación.. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT. DE. CI. EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC A. S. In Peru, the existence of a normative diagnostic algorithm is unknown, it is assumed that it is similar to HIV, therefore a multiple nested PCR test was standardized and validated for the diagnosis of HTLV-1 in proviral DNA samples of reference material of the MT-2 cell line. The test was validated with proviral DNA samples from whole blood, it was determined in 70 samples characterized by serology, its sensitivity and analytical specificity, veracity and accuracy in comparison with the immunoblot test (gold standard). The results of the validation showed a limit of detection of 0.5 ng of DNA per reaction of 25 μL of the Pol and LTR gene and an accuracy with a 100% detection rate for 0.4, 0.5 and 0.6 ng of DNA. In addition, in comparison with an Immunoblot test (INNOLIA) considered a reference test for our study, the multiple nested PCR obtained 97% sensitivity, 100% specificity, a positive and negative predictive value of 97.5 and 99.9% respectively and a kappa match factor of 0.97. The standardized method (multiple nested PCR) in this study is suitable and valid for the diagnosis of HTLV-1 in whole blood samples and can be implemented in the diagnosis algorithm of HTLV in the National Reference Laboratory of VTS-HIV / AIDS and to resolve the indeterminate results for the confirmatory diagnosis of children under 18 months with a high sensitivity and specificity.. BI. BL. IO. TE CA. Key words: HTLV-1, nested PCR, sensitivity, specificity, validation.. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCION. Los virus linfotrópico T humano HTLV-1, HTLV-2, HTLV-3 y HTLV-4, constituyen el grupo de retrovirus delta que comparten una serie de características epidemiológicas y moleculares.1 El HTLV-1 fue el primer retrovirus patogénico que se identificó en. S. humanos aislado de un paciente con linfoma cutáneo. 2,3 Luego, en 1982, se aisló el. IC A. HTLV-2 de un tipo de leucemia rara, conocida con el nombre de leucemia de células pilosas.4 En la actualidad el HTLV-1 se encuentra asociado con un gran número de. G. desórdenes clínicos. Sin embargo, la leucemia/linfoma de células T del adulto (LLTA) y. LO. la paraparesia espástica tropical o mielopatía asociada al HTLV-1 (PET/MAH), son las asociaciones epidemiológicas mejor documentadas. 5-8 Asimismo, este virus se halla. O. involucrado en el desarrollo de una variedad de patologías inflamatorias tales como la. AS. BI. uveítis, artritis, polimiositis, dermatitis infectiva, síndrome de Sjögren, entre otras. 9,10 El 50% de personas afectadas por PET/MAH, se vuelven dependientes a la silla de. CI. ruedas, mientras que en los afectados por LLTA causa mortalidad con una supervivencia. EN. media de seis a ocho meses.11. EL HTLV-1 identificado como el primer retrovirus oncogénico humano hace 30 años, no. CI. es un virus ubicuo. El HTLV-1 está presente en todo el mundo, con grupos de alta. DE. endemicidad ubicados a menudo en áreas cercanas donde el virus está casi ausente, ha sido ampliamente estudiado. A pesar de ello, aún no se tiene una cifra aproximada del número de individuos infectados en el mundo, pues la mayoría de datos de. TE CA. prevalencia provienen de estudios realizados en donantes de sangre de bajo riesgo o en grupos de población seleccionados (gestantes, pacientes con enfermedades neurológicas o hematológicas, grupos nativos, usuarios de drogas endovenosas,. BL. 13,14. 12,. IO. trabajadores sexuales y homosexuales), no representativos de la población general.. Sin embargo, las principales regiones altamente endémicas de HTLV-1 son la parte. BI. suroeste de Japón, África subsahariana y América del Sur, el área del Caribe y focos en Oriente Medio y Australo-Melanesia; en sudamerica comprende 13 países, incluyendo Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Colombia, Ecuador, Guyana Francesa, Guyana, Paraguay, Perú, Surinam, Uruguay y Venezuela. Esto representa alrededor de 400 millones de personas.19 Se han realizado numerosos estudios sobre la prevalencia de HTLV-1 en muchos de estos países, especialmente en Brasil, Perú, Colombia, Chile, 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Argentina y Guyana Francesa, En Perú, un verdadero país multiétnico habitado principalmente por mestizos y amerindios, la prevalencia de HTLV-1 en donantes de sangre varía de 1.2 a 1.7% según la región y de 1.3 a 3.8% en mujeres embarazadas o en la población general adulta. Además, se han informado varias series grandes de TSP/HAM y ATL. Sin embargo, varios estudios han demostrado claramente que las. S. personas de origen amerindio (grupos de habla quechua), que a menudo viven en áreas. IC A. aisladas, son altamente endémicas de HTLV-1.11,12,13,15-19. G. HTLV-1 es intracelular cuyo blanco principal son los linfocitos T. La concentración de. LO. formas libres del virus en plasma es baja. Por lo tanto, la transmisión se da a partir del contacto con linfocitos infectados, siendo las principales vías de transmisión, la lactancia. O. materna prolongada, las relaciones sexuales y las transfusiones sanguíneas. En otros. BI. países, el intercambio de agujas y jeringas entre usuarios de drogas endovenosas. AS. representa otra vía de transmisión. 20,22,23. Es importante destacar que en el Perú la forma de transmisión por la lactancia materna. CI. es la más prevalente, se han realizado estudios en gestantes de Lima, Huamanga. EN. (Ayacucho), Quillabamba y Cusco, con prevalencias de HTLV-1 de 1.7%, 0.5% y 2.3%. CI. respectivamente.23. El diagnóstico de la infección causada por el HTLV-1 se basa en la detección serológica. DE. de anticuerpos específicos para componentes antigénicos de diferentes partes del virus. Entre las pruebas de tamizaje existentes se puede señalar el ELISA, la. TE CA. Quimioluminiscencia y la prueba de látex; y en entre las pruebas confirmatorias se conocen la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) y el Inmunoblot (Western blot o Inmunoensayo en línea). Estas pruebas suelen ser muy eficientes, sin embargo estas técnicas tienen varias desventajas, como en casos con resultados indeterminados y su. IO. imposibilidad de ser utilizados en pacientes inmunodeprimidos o en infecciones neonatales, estos inmunoensayos, que se basan en la detección de anticuerpos,. BL. también pueden dar resultados falsos-negativos para infecciones recientes, en. BI. consecuencia, los ensayos moleculares son útiles para definir de manera inequívoca el diagnóstico. de. infección. en. estos. sujetos. con. patrones. persistentemente. indeterminados. Por otro lado, las técnicas moleculares son una herramienta valiosa para diagnosticar la infección por HTLV-1 en niños menores de 18 meses, porque los anticuerpos maternos del HTLV pueden persistir y, por lo tanto, interferir con la interpretación de una prueba positiva de anticuerpos contra el HTLV, y diagnosticar la. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. infección durante el período ventana entre la exposición al virus y la seroconversión. En estos casos, las técnicas de biología molecular son la mejor alternativa.10,24,25 Se han desarrollado pruebas de PCR bajo diversos criterios. Al respecto, se revisaron que a nivel internacional se realizaron investigaciones como: En California (EE. UU) se analizaron 60 muestras de las cuales 40 fueron positivas para HTLV por PCR.26 En Los. S. Países Bajos y el Caribe se realizó un estudio, en donde 53 muestras fueron positivas,. IC A. 15 negativas y 228 indeterminadas por WB, de los 53 todos fueron positivos por PCR,. las 228 y 15 todos fueron negativos por PCR.27 En la ciudad de Nueva York se. G. analizaron 429 muestras de las cuales 204 fueron positivas a HTLV por pruebas. LO. serológicas de estos solo 200 fueron confirmados como positivos a HTLV-2 por PCR.28 En Colombia se realizó un estudio en 31 muestras de sangre de individuos infectados. O. con el HTLV-1 pertenecientes a diferentes grupos étnicos, fueron analizados por. BI. pruebas serológicas y confirmadas por PCR. 29 En Argentina se trabajaron 57 muestras de banco de sangre de las cuales, 22 fueron positivas, 1 negativa y 34 indeterminadas. AS. por WB, estos fueron confirmados por PCR, de los indeterminados 5 fueron positivos. 30 En Costa Rica 14 muestras de donantes de sangre positivas e indeterminadas por. CI. pruebas serológicas, se analizaron por PCR, de las cuales 10 fueron negativas, 3. EN. positivas por HTLV-1 y una fue positiva por HTLV-2.31. CI. A nivel nacional en el Perú se realizó una revisión sistemática de estudios epidemiológicos sobre la infección por el virus linfotrópico de células T humanas 1 y 2,. DE. con la búsqueda en Medline y LILACS se halló un total de 50 artículos los cuales fueron publicados entre 1988 y 2010; de los cuales sólo 19 de ellos fueron estudios. TE CA. epidemiológicos de HTLV en el Perú. 11 El HTLV-1 no presenta viremia plasmática (ARN viral circulante en grandes cantidades en el plasma o suero). Esta característica significa que la búsqueda del ADN proviral,. IO. obtenido de células mononucleares de sangre periférica, sea un método de elección y. BL. el más adecuado para el diagnóstico molecular del HTLV-1.32. BI. El HTLV-1 y el HTLV-2 tienen propiedades biológicas similares y tropismo para linfocitos T, pero el HTLV-1 infecta preferentemente linfocitos T CD4 +, mientras que el HTLV-2 tiene tropismo para linfocitos T CD8+, con efecto hematológico diferente del HTLV-1.10 La expresión de las proteínas del HTLV-1 en las células infectadas promueve la progresión del ciclo celular, la supervivencia y propagación del ADN proviral por división. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. celular, como un genoma integrado (provirus), el genoma de HTLV-1 es de aproximadamente 9 Kb de longitud y contiene los genes estructurales gag, Pol y Env (propios de los retrovirus), los genes reguladores Tax y Rex y esta flanqueado por dos «long terminal repeat» (LTR).10,33,34. S. Las técnicas de diagnóstico serológico que se utilizan para detectar la infección por. IC A. HTLV-1 no han demostrado del todo resultados satisfactorios, ya que fallan en la detección de una infección reciente, cuando la respuesta inmune aún se está. G. desarrollando y los anticuerpos específicos no siempre están presentes en los. LO. individuos. En cambio, en las pruebas basadas en la detección de ácido nucleico no ocurre este tipo de problema, pues el ADN se encuentra presente en muchas células. BI. O. infectadas.10. Las pruebas moleculares se basan en la detección de secuencias genómicas provirales. AS. en células mononucleares periféricas lisadas enzimáticamente por la proteinasa K (extracción de ADN). Se emplean técnicas de amplificación de segmentos genómicos,. CI. por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). A continuación, se procede. EN. a la electroforesis de los productos genómicos amplificados en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN amplificados se pueden ver directamente en el gel de agarosa,. CI. coloreados con bromuro de etidio (fluorocromo capaz de conectarse a los ácidos. DE. nucleicos y emitir fluorescencia cuando se irradia por luz ultravioleta). 10,35 En el Perú no existe una guía de manejo clínico al paciente con HTLV, tampoco una. TE CA. norma técnica establecida por el ministerio de salud para el diagnóstico de estos pacientes; normalmente en el Perú se hace el tamizaje de HTLV a los donantes de sangre dentro de los siete marcadores de banco de sangre, sin embargo a otro tipo de. IO. pacientes como las gestantes no se les hace un descarte de HTLV. Muchos de los algoritmos para el diagnóstico de HTLV, realizan primero pruebas de tales. BL. tamizaje. como. las. ELISAS,. luego. pruebas. de. confirmación. como. BI. inmunofluorescencia indirecta y pruebas de inmunoblot, en ambos casos son pruebas serológicas, cuando estas pruebas arrojan resultados indeterminados, estas son llevadas a pruebas moleculares. En el Perú se desconoce la existencia de un algoritmo normativo de diagnóstico, se asume que es similar al del VIH; por ello se propone la estandarización y validación de la técnica de PCR nested multiple a partir de ADN proviral para el diagnóstico de HTLV-1 con el fin de complementar el algoritmo de. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. diagnóstico lo cual nos permitiría resolver situaciones como la resolución de los niveles indeterminados del inmunoblot, el diagnóstico precoz de la transmisión vertical y el diagnóstico de pacientes menores de 18 meses. Existen exámenes comerciales para realizar la técnica de PCR para HTLV, pero son de muy alto costo, por lo tanto el presente estudio establece estandarizar y validar la técnica. S. de PCR nested multiple con tecnología propia (in house) generando menores costos. El. IC A. desarrollo del estudio permitiría resolver la siguiente pregunta: ¿Es válida la técnica de. Reacción en Cadena de la Polimerasa Nested Múltiple para el diagnóstico de HTLV-1. G. en muestras de sangre conservadas en la hemoteca del Laboratorio de Referencia. BI. BL. IO. TE CA. DE. CI. EN. CI. AS. BI. O. LO. Nacional de VTS-VIH/SIDA?. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MÉTODOS. 2.1.. Diseño metodológico. S. 2.1.1. Tipo de investigación. IC A. Estudio experimental. El tipo de ensayo para alcanzar los objetivos de esta investigación corresponde a: Prueba diagnóstica. Bajo este enfoque el diseño es apropiado para. G. estimar la capacidad de una medida que permita discriminar entre personas con. LO. enfermedad y sin enfermedad.. BI. O. 2.1.2. Población. No existe población de estudio definida dado que el estudio está enfocado en. AS. estandarizar y validar una prueba de laboratorio. Por ello se utilizarán principalmente. CI. materiales de referencia consistentes en ADN de líneas celulares no pertenecientes a individuos. Sin embargo, para la determinación de la veracidad, se seleccionaron. EN. muestras de sangre total almacenadas pertenecientes a la hemoteca del Laboratorio de. DE. 2.1.3. Muestra y muestreo. CI. Referencia Nacional de VTS-VIH/SIDA del año 2017.. Se realizó una selección muestral no probabilística por conveniencia, de 70 muestras. Criterios de inclusión. IO. a.. TE CA. de la hemoteca del Laboratorio de Referencia Nacional de VTS-VIH/SIDA del año 2017.. Muestras de sangre total de la hemoteca del Laboratorio de Referencia. BL. . BI. Nacional de VTS-VIH/SIDA del año 2017 almacenadas a -20°C con sus. . respectivos muestra paralela de suero o plasma. Muestras con resultados definidos a las pruebas de ELISA, IFI e Inmunoblot.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. b.. Criterios de exclusión . Muestras mal conservadas, almacenadas a temperatura ambiente fuera de las 72 horas de haberse extraído la sangre.. . Muestras de sangre total que no contengan su muestra paralela de suero o. IC A. . S. plasma.. Muestras de resultados inespecíficos o indeterminados a las pruebas de. LO. G. ELISA, IFI e Inmunoblot.. Definición conceptual: Es la menor concentración del analito que una prueba puede. AS. a.. Límite de detección. BI. 2.1.4.1.. O. 2.1.4. Variables. Dimensiones: Es una variable cuantitativa de tipo continua, cuya escala de medición. EN. b.. CI. detectar con una precisión mayor o igual a un 95%.. es de intervalo y representa la cantidad ADN en nanogramos incorporado en una. Definición operacional: Es la menor cantidad ADN incorporado en una reacción de. DE. c.. CI. reacción de PCR.. PCR que permita la detección del gen Pol y LTR del HTLV-1 identificado como una. 2.1.4.2.. Especificidad analítica. Definición conceptual: Es la capacidad de una prueba de detectar sólo el analito de. IO. a.. TE CA. banda de amplificación de 136 y 527 pares de bases (pb) respectivamente.. BL. interés y no ser afectado por reacciones cruzadas generadas por agentes con. BI. características similares.. b.. Dimensiones: Es una variable cuantitativa de tipo continua y representa la tasa de. detección del gen Pol y LTR. c.. Definición operacional: Es la tasa de presencia o ausencia del producto de amplificación de 136 y 527 pb en un gel de agarosa correspondiente al gen Pol y. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LTR del HTLV-1 en muestras conteniendo ADN de VIH, Sífilis y VHB en ausencia del ADN del HTLV-1 2.1.4.3.. concordantes con una prueba de referencia o gold standard.. Dimensiones: Es una variable cuantitativa de tipo continua y representa la tasa de. G. b.. S. Definición conceptual: Es la capacidad de una prueba en brindar resultados. IC A. a.. Veracidad. LO. detección del gen Pol y LTR en muestras con resultado serológico de ELISA, IFI e. Definición operacional: Tasa de verdaderos positivos (sensibilidad diagnostica) y. BI. c.. O. Imunoblot conocida.. verdaderos negativos (especificidad diagnostica) asociado a la presencia o. AS. ausencia de amplificación de los productos de 136 y 527 pb en un gel de agarosa correspondiente al gen Pol y LTR del HTLV-1 por PCR y el resultado serológico de. a.. Precisión. CI. 2.1.4.4.. EN. CI. Inmunoblot como prueba de referencia.. Definición conceptual: Es la capacidad de la prueba en brindar mediciones. DE. repetibles y reproducibles de un analito evaluado mediante la dispersión o la tasa. b.. TE CA. de detección en métodos cuantitativos y cualitativos respectivamente. Dimensiones: Es una variable cuantitativa de tipo continua, cuya escala de medición es de intervalo y representa la tasa de detección del gen Pol y LTR en repeticiones. c.. IO. con diferente concentración del analito. Definición operacional: Es la tasa de detección del producto de amplificación de 136. BL. y 527 pb del gen Pol y LTR del HTLV-1 en 5 repeticiones de 3 concentraciones de. BI. ADN en el límite de detección, 20% mayor y 20% menor y procesadas en 3 días diferentes.. 2.1.5. Técnicas e instrumentos de recolección de datos. 2.1.5.1.. Material biológico. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. a.. Control negativo de HTLV-1. Se tomó una muestra de sangre total con resultado serológico (ELISA, IFI e Inmunoblot) negativo a HTLV-1, se le realizó la extracción de ADN con el kit comercial GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit Thermo. S. Scientific, siguiendo los pasos detallados en el ITT-CNSP-419 (Anexo 01). La. IC A. concentración de ADN fue cuantificada por fluorometría mediante el Qubit dsDNA. HS Assay Kit - Invitrogen, diluida a una concentración de 20 ng/µL con agua de. Control positivo de HTLV-1.. O. b.. LO. G. PCR (water for molecular biology)- AppliChem y almacenada a -20°C hasta su uso.. BI. Se tomó una muestra de sangre total con resultado serológico (ELISA, IFI e Inmunoblot) positivo a HTLV-1, se le realizó la extracción de ADN con el kit. AS. comercial GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit Thermo Scientific, siguiendo los pasos detallados en el ITT-CNSP-419 (Anexo 01). La. CI. concentración de ADN fue cuantificada por fluorometría mediante el Qubit dsDNA. EN. HS Assay Kit - Invitrogen, diluida a una concentración de 20 ng/µL con agua de. Control blanco de reacción.. DE. c.. CI. PCR (water for molecular biology)- AppliChem y almacenada a -20°C hasta su uso.. Es el agua de PCR (water for molecular biology)- AppliChem libre de ADN utilizado. TE CA. en las diluciones de las muestras de ADN que es incorporado en la reacción para evaluar la contaminación que pudieran explicar la presencia de amplificaciones falsas positivas.. Material de referencia.. IO. d.. BL. Células linfocitarias de cultivo celular de la línea MT-2 infectadas con HTLV-1. Se. BI. le realizó la extracción de ADN con el kit comercial GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit Thermo Scientific, siguiendo los pasos detallados en el ITT-CNSP-419 (Anexo 01). La concentración de ADN fue cuantificada por. fluorometría mediante el Qubit dsDNA HS Assay Kit – Invitrogen, fue diluida a una concentración de 20 ng/µL con agua de PCR (water for molecular biology)-. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AppliChem como control positivo de sistema y utilizado para la estandarización de la PCR, se almacenó a -20°C hasta su uso. Células linfocitarias de cultivo celular de la línea K562 libres de HTLV-1. Se le realizó la extracción de ADN con el kit comercial GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit Thermo Scientific, siguiendo los pasos detallados en el ITT-. S. CNSP-419 (Anexo 01). La concentración de ADN fue cuantificada por fluorometría. IC A. mediante el Qubit dsDNA HS Assay Kit – Invitrogen, fue diluida a una concentración. de 20 ng/µL con agua de PCR (water for molecular biology)- AppiChem como. Selección de muestras.. O. e.. LO. G. control negativo, se almacenó a -20°C hasta su uso.. BI. Se seleccionaron por conveniencia 70 muestras de sangre total para la verificación y 25 muestras para la especificidad almacenadas a -20°C, con sus respectivos. AS. sueros o plasmas de la hemoteca del Laboratorio de Referencia Nacional de VTS-. CI. VIH/SIDA estas fueron clasificadas en dos grupos.. EN.  Grupo A: 35 muestras de sangre positivos a HTLV-1 confirmados por pruebas. CI. serológicas ELISA, IFI e Inmunoblot..  Grupo B: 35 muestras de sangre negativos a HTLV-1 confirmados su negatividad. DE. por pruebas serológicas ELISA, IFI e Inmunoblot.. TE CA.  Grupo C: 10 muestras positivas a VIH, 10 muestras positivas a Sífilis y 05 muestras positivas a VHB (confirmada su positividad por pruebas serológicas); y negativos a HTLV-1 confirmados su negatividad por pruebas serológicas ELISA,. IO. IFI e Inmunoblot. Técnicas. BL. 2.1.5.2.. Extracción de ADN.. BI. a). Se realizó la extracción tanto de ADN con el kit comercial GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit Thermo Scientific, siguiendo las instrucciones según el protocolo ITT-CNSP-419 (Anexo 01). Las muestras de la hemoteca fueron tomadas mediante sistema de extracción al vacío en tubos conteniendo EDTA y. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. centrifugadas a 4000 rpm por 10 minutos, se separó el plasma y la fase de la capa lifocitaria. La concentración de ADN fue determinada por fluorometría mediante el Qubit dsDNA HS Assay Kit – Invitrogen, diluida en Nuclease-Free Water - Qiagen y almacenada a -20°C hasta su uso.. S. Para evaluar de la calidad del ADN extraído se empleó una reacción de PCR. IC A. amplificando un fragmento de 150 pb del gen celular de la β-globina como control. interno de la reacción del grupo de muestras A y B con los primers HU β3 (5’-. G. CGGCTGTCATCACTTAGACCTC -3’), UH β4 (5’- CTTCATCCACGT TCACTTTGC. LO. -3’) según un protocolo MET-CNSP-007 (Anexo 02). La mescla de reacción fue de 5 µL buffer 10X, 4 µL de MgCl2 25 mM, 4 µL de solución de dNTPs 2.5 mM, 0.5 µL. O. de cada primers (HU β3 y HU β4) 10 pmol/µL, 0.1 µL de la enzima taq polimerasa. BI. 5 U/µL, para un volumen final de 50 µL; se agregó 5 µL de ADN de muestra. Las condiciones de ciclado fueron: 94°C 7 minutos; 35 ciclos de 94°C 30 segundos,. AS. 60°C 1 minuto y una extensión final de 72°C 7 minutos. Se incluyó un control positivo (muestra β-globina positiva por PCR) y agua libre de DNasa y RNasa como. CI. control de contaminación. El producto se sometió a una electroforesis en gel de. EN. agarosa 2.0%, se sembró 5µL del producto y se corrió el gel a 100 voltios durante 30 minutos en buffer solución de tris-acetato-EDTA (TAE) 1X. El gel se visualizó. CI. con un fotodocumentador ChemiDoc XRS – BIORAD, comparando las bandas obtenidas con un marcador de peso molecular de 100pb – Thermo Scientific. Sólo. DE. las muestras positivas para el gen de β-globina fueron incluidas en el estudio. Aquellas que resultaron negativas se procesaron nuevamente incluida la extracción. TE CA. de ADN, excluyéndose del estudio los casos en que el resultado final fue nuevamente negativo.. Prueba de ELISA para HTLV-1/2.. IO. b). Se utilizó el bioelisa HTLV-I+II 5.0 - BIOKIT, el cual detecta anticuerpos séricos. BL. específicos del HTLV-1 y HTLV-2 mediante su interacción con antígenos virales. BI. Gag y Env, y anticuerpos secundarios ligados a enzimas absorbidos a una placa de polietileno. La prueba indica tener un 100% de sensibilidad y un 99,82% de especificidad para los virus del HTLV-1 y HTLV-2. Un resultado reactivo indica la presencia de anticuerpos contra el HTLV-1, HTLV-2 o ambos, mientras que el resultado no reactivo indica la ausencia de anticuerpos a estos virus.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. c). Prueba de IFI para HTLV-1. Se utilizó la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para la detección de anticuerpos contra HTLV-1 en cultivos celulares MT-2 y K562 fijados en láminas. La. Prueba de Inmunoblot para HTLV-1/2.. IC A. d). S. prueba indica tener una sensibilidad de 98,75% y una especificidad de 98,67%.36. G. Se utilizó INNO-LIA HTLV I/II Score es un inmunoensayo en tira para confirmar la. LO. presencia de anticuerpos contra el virus linfotrópico humano de células T de tipo I (HTLV- I) y de tipo II (HTLV- II) en suero o plasma humano. La prueba indica tener. BI. O. una sensibilidad del 98.8% y una especificidad de 99.0%.. AS. 2.1.6. Procedimientos y análisis de datos. El estudio se realizó en dos procesos: estandarización, y validación. La estandarización. CI. establece especificaciones para el aislamiento del ADN, concentraciones de los. EN. componentes del master mix, selección de la metodología de PCR, estudio exploratorio de las variantes de la PCR, y la validación evalúa el rendimiento de la prueba y su ajuste. CI. al propósito deseado a fin de confirmar el grado de exactitud y consistencia de los. Procedimientos de la estandarización. TE CA. 2.1.6.1.. DE. resultados mediante experimentos.. La estandarización de la prueba de PCR Nested Múltiple utilizó agua de PCR (water for molecular biology)- AppliChem, cloruro de magnesio (MgCl2) – Millipore, buffer de reacción de PCR NovaTaq Hot Star Buffer - Millipore, dNTPs Mix - Invitrogen y la enzima. IO. NovaTaq Hot Start ADN Polymerase - Millipore. En la electroforesis se utilizó gel de agarosa al 2.0% - Promega y marcador de peso molecular de 100 pares de bases –. BL. Thermo Scientific. Las condiciones térmicas de la PCR fueron dadas por el. BI. termociclador TOne – Analytik Jena. Para la amplificación de los productos del gen Pol. y la región LTR se utilizaron los siguientes primers detallados en la tabla 1.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 1. Oligonucleotidos utillizados para la amplificación del gen viral Pol, la región LTR y del gen celular de la Betaglobina Secuencia (5’3’). Tamaño Primera. Pol HTLV-1. SK111. Pol HTLV-1. 800LA. LTR. R 3Vext. LTR. CCC TAC AAT CCA ACC AGC TCA G. 186 pb. S. SK110. Ronda GTG GTG AAG CTG CCA TCG GGT TTT CTC ACA CGG CCT CAT ACA GTA CTC. 562 pb. CGC AGT TCA GGA GGC ACC RM. Segunda POL 3.1. Pol HTLV-1. 800LA. LTR. R 3Vint. LTR. CTC ACA CGG CCT CAT ACA GTA CTC. O. la. Betaglobina. CGG CTG TCA TCA CTT AGA CCT C. 150 pb. AS. β-globina. de. GAA CGC RAC TCA ACC GGC RYG GAT GG. CTT CAT CCA CGT TCA CTT TGC. CI. HU 4. TGG CAG TTG GTT AAC ACA TTC AGG. 527 pb Gen. HU 3. TTG TAG AAC GCT CTA ATG GCA TTC. 136 pb. LO. Pol HTLV-1. Ronda. BI. POL 1.1. IC A. Gen-virus o Región. G. Primers. El volumen de reacción fue de 25 µL, de los cuales se tomaron 5 µL, se mesclaron con. EN. 2 µL de colorante de corrida y se sembró la totalidad en un gel de agarosa al 2.0% y fueron detectados mediante electroforesis con la fuente de poder Power Pac 300 -. CI. BIORAD. Las bandas de 136 y 527 pares de bases del gen Pol y LTR fueron. DE. visualizadas con el fotodocumentador ChemiDoc XRS - BIORAD. Las condiciones de la prueba (concentración de componentes del master mix y. TE CA. temperaturas de amplificación) a partir de la cual se desarrolló la PCR, fueron las mismas tanto como para la primera como para la segunda ronda. Determinación de la concentración de cloruro de magnesio.. IO. a.. BL. Se determinó la tasa de detección de los productos de 136 y 527 pares de bases correspondiente al gen Pol y LTR del HTLV-1 en un ensayo de PCR a. BI. concentraciones de cloruro de magnesio de 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 mM. La muestra a evaluar fue el material de referencia células MT-2, con una concentración de ADN de 20 ng/µL, el volumen agregado por cada reacción de PCR fue de 3 µL, se hicieron tres repeticiones por cada variante de concentración. Las condiciones de ciclado fueron 95°C por 7 minutos, seguido de 35 ciclos (extensión de 2 segundos. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. por ciclo) a 94°C por 1 minuto, 55 por 1 minuto, 72°C por dos minutos y una extensión final de 72°C por 7 minutos y 4°C indefinido La mezcla de reacción para el gen Pol y LTR del HTLV-1 fue de: 2.5 μL de buffer 10X, MgCl2 a concentraciones de 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 mM, 0.5μL de dNTPs 10. S. mM, 0.5 μL de primers 10 pmol/μL, 0.125 μL de Nova Taq Hot Star DNA Polimerasa. IC A. (Millipore) 5U/μL, agua PCR y 3 μL de ADN, con un volumen de reacción de 25 μL. La mezcla de reacción de la segunda ronda fue igual a la primera, a excepción de. G. los oligonucleótidos utilizados y 2 μL de producto de amplificación de la primera. Determinación de la concentración de los primers.. BI. O. b.. LO. ronda.. Se determinó la tasa de detección de los productos de 136 y 527 pares de bases. AS. correspondiente al gen Pol y LTR del HTLV-1 en un ensayo de PCR a concentraciones de 0.2, 0.3, 0.4 pmol/µL de cada uno de los primers. La muestra a. CI. evaluar fue el material de referencia células MT-2, con una concentración de ADN. EN. de 20 ng/µL, el volumen agregado por cada reacción de PCR fue de 3 µL, se hicieron tres repeticiones por cada variante de concentración. Las condiciones de. CI. ciclado fueron 95°C por 7 minutos, seguido de 35 ciclos (extensión de 2 segundos por ciclo) a 94°C por 1 minuto, 55 por 1 minuto, 72°C por dos minutos y una. DE. extensión final de 72°C por 7 minutos y 4°C indefinido. TE CA. La mezcla de reacción para el gen Pol y LTR del HTLV-1 fue de: 2.5 μL de buffer 10X, 4 μL de MgCl2 25 mM, 0.5μL de dNTPs 10 mM, primers a concentraciones de 0.2, 0.3, 0.4 pmol/µL, 0.125 μL de Nova Taq Hot Star DNA Polimerasa (Millipore) 5U/μL, agua PCR y 3 μL de ADN, con un volumen de reacción de 25 μL. La mezcla. IO. de reacción de la segunda ronda fue igual a la primera, a excepción de los. BL. oligonucleótidos utilizados y 2 μL de producto de amplificación de la primera ronda. Determinación de la concentración de dNTPs. BI. c.. Se determinó tasa de detección de los productos de 136 y 527 pares de bases correspondiente al gen Pol y LTR del HTLV-1 en un ensayo de PCR a concentraciones de 0.2, 0.3, 0.4 mM de dNTPs. La muestra a evaluar fue el material de referencia células MT-2, con una concentración de ADN de 20 ng/µL, el volumen. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. agregado por cada reacción de PCR fue de 3 µL, se hicieron tres repeticiones por cada variante de concentración. Las condiciones de ciclado fueron 95°C por 7 minutos, seguido de 35 ciclos (extensión de 2 segundos por ciclo) a 94°C por 1 minuto, 55 por 1 minuto, 72°C por dos minutos y una extensión final de 72°C por 7. S. minutos y 4°C indefinido. IC A. La mezcla de reacción para el gen Pol y LTR del HTLV-1 fue de: 2.5 μL de buffer 10X, 4 μL de MgCl2 25 mM, dNTPs a concentraciones de 0.2, 0.3, 0.4 mM, 0.5 μL. G. para la región Pol y 1.0 μL para la región LTR de primers 10 pmol/µL, 0.125 μL de. LO. Nova Taq Hot Star DNA Polimerasa (Millipore) 5U/μL, agua PCR y 3 μL de ADN, con un volumen de reacción de 25 μL. La mezcla de reacción de la segunda ronda. O. fue igual a la primera, a excepción de los oligonucleótidos utilizados y 2 μL de. Determinación de la concentración de la Taq polimerasa.. AS. d.. BI. producto de amplificación de la primera ronda.. CI. Se determinó tasa de detección de los productos de 136 y 527 pares de bases. EN. correspondiente al gen Pol y LTR del HTLV-1 en un ensayo de PCR a concentraciones de 0.5, 1.0, 1.5 U/µL de Taq polimerasa. La muestra a evaluar fue. CI. el material de referencia células MT-2, con una concentración de ADN de 20 ng/µL, el volumen agregado por cada reacción de PCR fue de 3 µL, se hicieron tres. DE. repeticiones por cada variante de concentración. Las condiciones de ciclado fueron 95°C por 7 minutos, seguido de 35 ciclos (extensión de 2 segundos por ciclo) a 94°C. TE CA. por 1 minuto, 55 por 1 minuto, 72°C por dos minutos y una extensión final de 72°C por 7 minutos y 4°C indefinido La mezcla de reacción para el gen Pol y LTR del HTLV-1 fue de: 2.5 μL de buffer. IO. 10X, 4 μL de MgCl2 25 mM, 0.8 dNTPs 10 mM, 0.5 μL para la región Pol y 1.0 μL para la región LTR de primers 10 pmol/µL, Nova Taq Hot Star DNA Polimerasa. BL. (Millipore) a concentraciones de 0.5, 1.0, 1.5 U/µL, agua PCR y 3 μL de ADN, con. BI. un volumen de reacción de 25 μL. La mezcla de reacción de la segunda ronda fue igual a la primera, a excepción de los oligonucleótidos utilizados y 2 μL de producto de amplificación de la primera ronda.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.6.2.. Procedimientos de validación. Las condiciones de reacción fueron obtenidas durante la estandarización: Temperatura de desnaturalización: 95°C. -. Temperatura de hibridación: 55°C. -. Temperatura de elongación: 72°C. -. N° ciclos de amplificación: 35. -. Concentración de MgCl2: 4.0 mM. -. Concentración de Taq polimerasa por reacción de PCR: 0.5 U/µL.. -. Concentración de primers: 0.2 pmol/µL para Pol y 0.4 pmol/µL para LTR. -. Concentración de dNTPs: 0.2 mM.. IC A G. LO. O BI. Límite de detección (sensibilidad analítica).. AS. a.. S. -. Se realizaron diluciones seriadas del material de referencia células MT-2 en. CI. cantidades de 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 nanogramos de ADN. EN. por microlitro para la curva de límite de detección. Se tomó como límite detección la concentración mínima a la cual pueden visualizarse los productos 136 y 527. b.. DE. CI. pares de bases correspondientes al gen Pol y LTR del HTLV-1. Especificidad analítica.. TE CA. Se determinó la tasa de detección verdaderos negativos de los productos 136 y 527 pares de bases correspondientes al gen Pol y LTR del HTLV-1 en un ensayo de PCR con 25 muestras del grupo C (10 de VIH, 10 de Sífilis y 5 de VHB) en un. Veracidad (sensibilidad y especificidad diagnostica).. BL. c.. IO. solo ensayo.. BI. Se determinó la tasa de detección verdaderos positivos y negativos de los productos. de 136 y 527 pares de bases correspondientes al gen Pol y LTR del HTLV-1 en un ensayo de PCR con 35 muestras positivas a HTLV-1 confirmadas por serología (grupo A) y 35 muestras negativas a HTLV-1 confirmadas por serología (grupo B). Posteriormente, mediante una tabla de contingencia se determinó la proporción de verdaderos. positivos. (sensibilidad. diagnóstica),. verdaderos. negativos. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. (especificidad diagnóstica) y el índice de concordancia kappa en referencia con el gold estándar Inmunoblot. d.. Precisión (repetibilidad y reproducibilidad).. S. Se determinó la tasa de detección de los productos de 136 y 527 pares de bases. IC A. correspondientes al gen Pol y LTR del HTLV-1 en tres ensayos de PCR con material. de referencia células MT-2, tomando como valor central el límite de detección, más. G. el 20 % mayor y el 20% menor (0.4, 0.5, 0.6 ng/µL de ADN por reacción). Para ello. LO. se procesaron 5 repeticiones del material de referencia de células de MT-2 con las condiciones estandarizadas de PCR para cada una de las tres variantes en tres. Análisis de los datos.. AS. 2.1.6.3.. BI. O. días diferentes.. CI. Los datos obtenidos del estudio fueron almacenados en formato Excel y analizados. EN. mediante el estadístico Epidat 3.1. Para la veracidad del ensayo se determinó sensibilidad diagnostica, especificidad diagnostica, valores predictivos positivos y. BI. BL. IO. TE CA. DE. CI. negativos y el índice de concordancia kappa.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS. 3.1.. Resultados de la estandarización. La concentración de cloruro de magnesio, se muestra en la Figura 1, un gel de. S. electroforesis de PCR a concentraciones de cloruro de magnesio de 2.5, 3.0, 3.5, 4.0,. IC A. 4.5 mM. En la primera columna está el marcador de peso molecular de 100 pares de. bases seguido de cuatro controles y tres repeticiones del Material de referencia células. G. MT-2 por cada concentración de cloruro de magnesio. Se observa la presencia de. LO. amplificación del gen Pol y LTR de 136 y 527 pb. La tasa de detección del Material de referencia en las diferentes concentraciones de cloruro de magnesio fue de 100% con. O. diferentes intensidades de bandas. La concentración de cloruro de magnesio con la. BI. mejor intensidad de bandas fue 4.0 mM, la cual se seleccionó como óptimo para este. DE. CI. EN. CI. AS. estudio.. IO. TE CA. Figura 1. Determinación de la concentración de cloruro de magnesio. Carril 1. Marcador de peso molecular (100 pb). Carril 2: Control Positivo de muestra. Carril 3: Control Negativo K562. Carril 4: Control Negativo de muestra. Carril 5: Control Blanco. Carril 6, 7 y 8: MgCl2 2.5 mM. Carril 9, 10 y 11: MgCl2 3.0 mM. Carril 12, 13 y 14: MgCl2 3.5 mM. Carril 15, 16 y 17: MgCl2 4.0 mM. Carril 18, 19 y 20: MgCl2 4.5 mM. Tabla 2. Registro de resultados de la determinación de la concentración de cloruro de magnesio.. 1. Material biológico Cel. MT-2. 2. Cel. MT-2. MgCl2. 2.5. 20. 5. Positivo. 3. Cel. MT-2. MgCl2. 2.5. 20. 5. Positivo. 4. Cel. MT-2. MgCl2. 3.0. 20. 5. Positivo. 5. Cel. MT-2. MgCl2. 3.0. 20. 5. Positivo. 6. Cel. MT-2. MgCl2. 3.0. 20. 5. Positivo. 7. Cel. MT-2. MgCl2. 3.5. 20. 5. Positivo. BI. BL. N. MgCl2. MgCl2 mM 2.5. ADN ng/µL 20. Taq Pol U/µL 5. variante. Interpretación Positivo. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Cel. MT-2. MgCl2. 3.5. 20. 5. Positivo. 9. Cel. MT-2. MgCl2. 3.5. 20. 5. Positivo. 10. Cel. MT-2. MgCl2. 4.0. 20. 5. Positivo. 11. Cel. MT-2. MgCl2. 4.0. 20. 5. Positivo. 12. Cel. MT-2. MgCl2. 4.0. 20. 5. Positivo. S. 8. IC A. La concentración de los primers se muestra en la Figura 2, un gel de electroforesis de PCR a concentraciones de primers de 0.2, 0.3, 0.4 pmol/µL. En la primera columna está el marcador de peso molecular de 100 pares de bases seguido de cuatro controles y. G. tres repeticiones del Material de referencia células MT-2 por cada concentración de. LO. primers. Se observa la presencia de amplificación del gen Pol y LTR de 136 y 527 pb. La tasa de detección del material de referencia en las diferentes concentraciones de. O. primers fue de 100% con diferentes intensidades de bandas. La concentración de. BI. primers con la mejor intensidad de bandas fue 0.2 pmol/µL, para la una mejor definición. AS. de bandas se tomó 0.2 pmol/µL para los primers de la región Pol y se duplico el valor a. TE CA. DE. CI. EN. CI. 0.4 pmol/µL para los primers de la región LTR.. IO. Figura 2. Determinación de la concentración de primers. Carril 1. Marcador de peso molecular (100 pb). Carril 2: Control Positivo de muestra. Carril 3: Control Negativo K562. Carril 4: Control Negativo de muestra. Carril 5: Control Blanco. Carril 6, 7 y 8: primers 0.2 pmol/µL. Carril 9, 10 y 11: primers 0.3 pmol/µL. Carril 12, 13 y 14: primers 0.4 pmol/µL.. BL. Tabla 3. Registro de resultados de la determinación de la concentración de primers .. Material biológico. Variante. MgCl2 mM. Primers pmol/ µL. ADN ng/µL. 1. Cel. MT-2. Primers. 4.0. 0.2. 20. Taq Pol U/µL 5. 2. Cel. MT-2. Primers. 4.0. 0.2. 20. 5. Positivo. 3. Cel. MT-2. Primers. 4.0. 0.2. 20. 5. Positivo. 4. Cel. MT-2. Primers. 4.0. 0.3. 20. 5. Positivo. 5. Cel. MT-2. Primers. 4.0. 0.3. 20. 5. Positivo. BI. N. Interpretación Positivo. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 6. Cel. MT-2. Primers. 4.0. 0.3. 20. 5. Positivo. 7. Cel. MT-2. Primers. 4.0. 0.4. 20. 5. Positivo. 8. Cel. MT-2. Primers. 4.0. 0.4. 20. 5. Positivo. 9. Cel. MT-2. Primers. 4.0. 0.4. 20. 5. Positivo. S. La concentración de dNTPs se muestra en la Figura 3 muestra un gel de electroforesis. IC A. de PCR a concentraciones de dNTPs a 0.2, 0.3, 0.4 µM. En la primera columna está el marcador de peso molecular de 100 pares de bases seguido de cuatro controles y tres. repeticiones del Material de referencia células MT-2 por cada concentración de dNTPs.. G. Se observa la presencia de amplificación del gen Pol y LTR de 136 y 527 pb. La tasa de. LO. detección del Material de referencia en las diferentes concentraciones de dNTPs fue de 100% con diferentes intensidades de bandas. La concentración de dNTPs con la mejor. DE. CI. EN. CI. AS. BI. O. intensidad de bandas fue 0.3 mM, la cual se seleccionó como óptimo para este estudio.. TE CA. Figura 3. Determinación de la concentración de dNTPs. Carril 1. Marcador de peso molecular (100 pb). Carril 2: Control Positivo de muestra. Carril 3: Control Negativo K562. Carril 4: Control Negativo de muestra. Carril 5: Control Blanco. Carril 6, 7 y 8: dNTPs 0.2 mM. Carril 9, 10 y 11: dNTPs 0.3 mM. Carril 12, 13 y 14: dNTPs 0.4 mM.. N. Material biológico. Variante. MgCl2 mM. Primers pmol/ µL. dNTPs mM. ADN ng/µL. Taq Pol U/µL. Interpretación. Cel. MT-2. dNTPs. 4.0. 0.2/0.4*. 0.2. 20. 5. Positivo. Cel. MT-2. dNTPs. 4.0. 0.2/0.4*. 0.2. 20. 5. Positivo. BL. 1. IO. Tabla 4. Registro de resultados de la determinación de la concentración de dNTPs.. BI. 2 3. Cel. MT-2. dNTPs. 4.0. 0.2/0.4*. 0.2. 20. 5. Positivo. 4. Cel. MT-2. dNTPs. 4.0. 0.2/0.4*. 0.3. 20. 5. Positivo. 5. Cel. MT-2. dNTPs. 4.0. 0.2/0.4*. 0.3. 20. 5. Positivo. 6. Cel. MT-2. dNTPs. 4.0. 0.2/0.4*. 0.3. 20. 5. Positivo. 7. Cel. MT-2. dNTPs. 4.0. 0.2/0.4*. 0.4. 20. 5. Positivo. 8. Cel. MT-2. dNTPs. 4.0. 0.2/0.4*. 0.3. 20. 5. Positivo. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 9 Cel. MT-2 dNTPs 4.0 0.2/0.4* 0.3 20 *Concentración de primers 0.2 para la región Pol y 0.4 para región LTR.. 5. Positivo. La concentración de la Taq polimerasa se muestra en la Figura 4 muestra un gel de electroforesis de PCR a concentraciones de Taq polimerasa a 0.5, 1.0, 1.5 U/µL. En la. S. primera columna está el marcador de peso molecular de 100 pares de bases seguido. IC A. de cuatro controles y tres repeticiones del Material de referencia células MT-2 por cada concentración de dNTPs. Se observa la presencia de amplificación del gen Pol y LTR. G. de 136 y 527 pb. La tasa de detección del Material de referencia en las diferentes concentraciones de la Taq polimerasa fue de 100% con diferentes intensidades de. LO. bandas. La concentración de la Taq polimerasa con la mejor intensidad de bandas fue. CI. EN. CI. AS. BI. O. 0.5 U/µL, la cual se seleccionó como óptimo para este estudio.. TE CA. DE. Figura 4. Determinación de la concentración de la taq polimerasa. Carril 1. Marcador de peso molecular (100 pb). Carril 2: Control Positivo de muestra. Carril 3: Control Negativo K562. Carril 4: Control Negativo de muestra. Carril 5: Control Blanco. Carril 6, 7 y 8: taq polimerasa 0.5 U/ µL. Carril 9, 10 y 11: taq polimerasa 1.0 U/ µL. Carril 12, 13 y 14: taq polimerasa 0.5 U/ µL.. IO. Tabla 5. Registro de resultados de la determinación de la concentración de la taq polimerasa. Material biológico. Variante. MgCl2 mM. Primers pmol/ µL. dNTPs mM. ADN ng/µL. Taq pol U/µL. Interpretación. Cel. MT-2. Taq pol. 4.0. 0.2/0.4*. 0.3. 20. 0.5. Positivo. 2. Cel. MT-2. Taq pol. 4.0. 0.2/0.4*. 0.3. 20. 0.5. Positivo. 3. Cel. MT-2. Taq pol. 4.0. 0.2/0.4*. 0.3. 20. 0.5. Positivo. 4. Cel. MT-2. Taq pol. 4.0. 0.2/0.4*. 0.3. 20. 1.0. Positivo. 5. Cel. MT-2. Taq pol. 4.0. 0.2/0.4*. 0.3. 20. 1.0. Positivo. 6. Cel. MT-2. Taq pol. 4.0. 0.2/0.4*. 0.3. 20. 1.0. Positivo. 7. Cel. MT-2. Taq pol. 4.0. 0.2/0.4*. 0.3. 20. 1.5. Positivo. 8. Cel. MT-2. Taq pol. 4.0. 0.2/0.4*. 0.3. 20. 1.5. Positivo. N. BI. BL. 1. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 9 Cel. MT-2 Taq pol 4.0 0.2/0.4* 0.3 20 *Concentración de primers 0.2 para la región Pol y 0.4 para región LTR.. 1.5. Positivo. 3.2. Resultados de la validación. S. El límite de detección (sensibilidad analítica) de la reacción de la PCR múltiple Pol/LTR. IC A. fue de 0.5 ng/µL donde se obtuvieron productos específicos de 136 pb y 527 pb del. CI. AS. BI. O. LO. G. HTLV-1.. DE. CI. EN. Figura 5. Límite de detección. Carril 1. Marcador de peso molecular (100 pb). Carril 2: Control Positivo de muestra. Carril 3: Control Negativo K562. Carril 4: Control Negativo de muestra. Carril 5: Control Blanco. Carril 6: 50 ng/µL. Carril 7: 10 ng/µL. Carril 8: 5 ng/µL. Carril 9: 1 ng/µL. Carril 10: 0.5 ng/µL. Carril 11: 0.1 ng/µL. Carril 12: 0.05 ng/µL. Carril 13: 0.01 ng/µL. Carril 14: 0.005 ng/µL. Carril 15: 0.001 ng/µL.. Tabla 6. Registro de resultados del límite de detección.. Material biológico Cel. MT-2. Parámetro. Resultado. Interpretación. 50. LD*. Cualitativo. Positivo. Cel. MT-2. 10. LD*. Cualitativo. Positivo. Cel. MT-2. 5. LD*. Cualitativo. Positivo. Cel. MT-2. 1. LD*. Cualitativo. Positivo. Cel. MT-2. 0.5. LD*. Cualitativo. Positivo. Cel. MT-2. 0.1. LD*. Cualitativo. Negativo. 7. Cel. MT-2. 0.05. LD*. Cualitativo. Negativo. 8. Cel. MT-2. 0.01. LD*. Cualitativo. Negativo. 9. Cel. MT-2. 0.005. LD*. Cualitativo. Negativo. 10. Cel. MT-2. 0.001. LD*. Cualitativo. Negativo. 1 2. 5. BI. BL. 6. IO. 3 4. ADN ng/µL. TE CA. N. *LD: Limite de Detección. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La Especificidad Analítica del ensayo de PCR usando ADN del grupo C de muestras, de tres agentes infecciosos fueron negativos, la figura 6 muestra esos resultados para los agentes probados Sifilis, VIH y VHB se mostró así la especificidad de los iniciadores.. EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC A. S. La tasa de detección de verdaderos negativos fue 100%.. TE CA. DE. CI. Figura 6. Especificidad analítica de PCR grupo C. Carril 1 y 21. Marcador de peso molecular (100 pb). Carril 2: Control Positivo MT-2. Carril 3: Control Positivo de muestra. Carril 4: Control Negativo K562. Carril 5: Control Negativo de muestra. Carril 6: Control Blanco. Carril 7-16: muestras negativas a HTLV-1 con etiología Sífilis. Carril 17-27: muestras negativas a HTLV-1 con etiología VIH, Carril 28-32: muestras negativas a HTLV-1 con etiología VHB. Tabla 7. Registro de resultados de especificidad analítica.. N. BI. BL. IO. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12. Material biológico Sif-01 Sif-02 Sif-03 Sif-04 Sif-05 Sif-06 Sif-07 Sif-08 Sif-09 Sif-10 VIH-01 VIH-02. Parámetro. Resultado. Interpretación. Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A. Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo. Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. S. Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo. IC A. Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo Cualitativo. Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A Esp. A. G. VIH-03 VIH-04 VIH-05 VIH-06 VIH-07 VIH-08 VIH-09 VIH-10 VHB-01 VHB-02 VHB-03 VHB-04 VHB-05. LO. 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25. O. *Esp. A: Especificidad Analítica. BI. 3.2.1. Veracidad (sensibilidad y especificidad diagnostica).. AS. Se muestra dos geles de electroforesis del ensayo de PCR para la determinación de la veracidad de las muestras del grupo A y B, también se corrió el PCR de competencia. BI. BL. IO. TE CA. DE. CI. EN. CI. de la betaglobina.. Figura 7. PCR de competencia betaglobina grupo A. Carril 1 y 21. Marcador de peso molecular (100 pb). Carril 2: Control Blanco. Carril 3: Control Positivo MT2. Carril 4-39: Muestras del grupo A.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) AS. BI. O. LO. G. IC A. S. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE CA. DE. CI. EN. CI. Figura 8. PCR de competencia betaglobina grupo B. Carril 1 y 21. Marcador de peso molecular (100 pb). Carril 2: Control Blanco. Carril 3: Control Positivo MT2. Carril 4-39: Muestras del grupo B.. Figura 9. Validación de PCR grupo A. Carril 1, 16 y 31. Marcador de peso molecular (100 pb). Carril 2: Control Negativo K562. Carril 3: Control Negativo de muestra. Carril 4: Control Blanco. Carril 5: Control Positivo MT-2. Carril 6: Control Positivo de muestra. Carril 7-43: muestras positivas a HTLV-1 grupo A.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..