PRÁCTICA Nª 05 PRÁCTICA Nª 05
I.
I. OBJETIVOSOBJETIVOS
-- Conocer el fundamento y los conceptos generales sobre la toma de muestras Conocer el fundamento y los conceptos generales sobre la toma de muestras sanguíneas.sanguíneas.
-- Conocer el fundamento y las técnicas de recuento de glóbulos rojos y Conocer el fundamento y las técnicas de recuento de glóbulos rojos y glóbulos blancos.glóbulos blancos.
-- Conocer el fundamento y las técnicas de determinación de hematocrito y velocidad deConocer el fundamento y las técnicas de determinación de hematocrito y velocidad de sedimentació
sedimentación n globular.globular.
II.
II. INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
La sangre para poder ser estudiada debe extraerse del organismo y en ocasiones fraccionarse en La sangre para poder ser estudiada debe extraerse del organismo y en ocasiones fraccionarse en sus componentes fundamentales como plasma o suero. La extracción sanguínea puede realizarse sus componentes fundamentales como plasma o suero. La extracción sanguínea puede realizarse por diversos métodos siendo los más empleados la punción venosa y la punción capilar. Al igual por diversos métodos siendo los más empleados la punción venosa y la punción capilar. Al igual que cualquier otra técnica o práctica médica, la extracción sanguínea precisa de un adecuado que cualquier otra técnica o práctica médica, la extracción sanguínea precisa de un adecuado control de calidad y que de ello depende muchas veces que el resultado del análisis de la muestra control de calidad y que de ello depende muchas veces que el resultado del análisis de la muestra de sangre sea correcto. Se efectuará en ayunas o
de sangre sea correcto. Se efectuará en ayunas o no dependiendo de la prueba a utilizar.no dependiendo de la prueba a utilizar.
Si se precisa obtener el plasma o estudiar algunas de las propiedades de la sangre o de alguno de Si se precisa obtener el plasma o estudiar algunas de las propiedades de la sangre o de alguno de los componentes celulares, en especial las plaquetas, es necesario añadir a la sangre recién los componentes celulares, en especial las plaquetas, es necesario añadir a la sangre recién extraída un anticoagulante. Para ello debe elegirse, el anticoagulante idóneo, procurando que extraída un anticoagulante. Para ello debe elegirse, el anticoagulante idóneo, procurando que exista una proporción adecuada entre éste y el volumen de sangre extraída.
exista una proporción adecuada entre éste y el volumen de sangre extraída.
Los eritrocitos son células maduras que carecen de núcleo. El recuento se realiza para determinar Los eritrocitos son células maduras que carecen de núcleo. El recuento se realiza para determinar el número de eritrocitos por mm
el número de eritrocitos por mm33 de sangre, utilizando para ello sangre con anticoagulante ode sangre, utilizando para ello sangre con anticoagulante o sangre obtenida por función cutánea. Se pueden emplear métodos autonómicos o sangre obtenida por función cutánea. Se pueden emplear métodos autonómicos o hemocitométricos.
hemocitométricos.
Valores referencia: Valores referencia: Unidades SI (célx 10
Unidades SI (célx 101212/l) /l) Unid. Unid. Tradicionales Tradicionales (millones (millones de de células/mmcélulas/mm33)) Varones Varones 4.5 4.5 a a 5.5 5.5 4.5 4.5 a a 5.55.5 Mujeres Mujeres 4.0 a 4.0 a 5.0 5.0 4.0 4.0 a a 5.05.0 Niños Niños 4.2 4.2 a a 5.2 5.2 4.2 4.2 a a 5.25.2 Lactantes Lactantes 3.8 3.8 a a 5.2 5.2 3.8 3.8 a a 5.25.2 Recién
Recién nacidos nacidos 5.0 5.0 a a 6.0 6.0 5.0 5.0 a a 6.06.0 Nota:
Nota: Las unidades tradicionales se escriben con ceros Las unidades tradicionales se escriben con ceros completoscompletos
HEMATOLOGIA I: TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA, RECUENTO DE
HEMATOLOGIA I: TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA, RECUENTO DE
GLÓBULOS R
GLÓBULOS ROJOS, REC
OJOS, RECUENTO DE
UENTO DE GLÓBULOS BLA
GLÓBULOS BLANCOS,
NCOS,
HEMATOCRITO Y
Variaciones Variaciones Policitemia.
Policitemia. Es el aumento del número de eritrocitos; puede presentarse en diarreas graves,Es el aumento del número de eritrocitos; puede presentarse en diarreas graves, intoxicaciones agudas y en personas que viven en gran altura.
intoxicaciones agudas y en personas que viven en gran altura. Oligocitemia.
Oligocitemia. Es la disminución en el número de eritrocitos; se presenta en anemias, en laEs la disminución en el número de eritrocitos; se presenta en anemias, en la leucemia y después de hemorragia.
leucemia y después de hemorragia.
El recuento del número de leucocitos o glóbulos blancos se expresa por mm
El recuento del número de leucocitos o glóbulos blancos se expresa por mm 33de sangre.de sangre.
La sangre se deposita en un líquido para diluir leucocitos, dejándolos intactos. En cambio los La sangre se deposita en un líquido para diluir leucocitos, dejándolos intactos. En cambio los eritrocitos son destruidos por este líquido. Luego se cuentan los leucocitos en una cámara de eritrocitos son destruidos por este líquido. Luego se cuentan los leucocitos en una cámara de recuento, por medio del microscopio, y se calcula el número que existe por mm
recuento, por medio del microscopio, y se calcula el número que existe por mm 33 de sangre. Esde sangre. Es importante conocer el número de leucocitos, pues este se altera en casos de enfermedades importante conocer el número de leucocitos, pues este se altera en casos de enfermedades infecciosas. Existen técnicas autonómicas y hemocitométricas para el recuento de estos y son infecciosas. Existen técnicas autonómicas y hemocitométricas para el recuento de estos y son similares al recuento de G.R.
similares al recuento de G.R.
Valores referencia Valores referencia Grupos
Grupos de de edad edad Leucocitos Leucocitos / / mmmm33 Hombres
Hombres y y mujeres mujeres 5,000 5,000 - - 10,00010,000 Niños
Niños de de 1 1 año año 8,000 8,000 - - 15,00015,000 Recién
Recién nacidos nacidos 10,000 - 10,000 - 12,00012,000 Niños
Niños de de 3 3 a a 9 9 meses meses 4,000 4,000 - - 15,00015,000
Variaciones Variaciones
Leucocitosis > 10,000 / mm Leucocitosis > 10,000 / mm33
Fisiológico: R.N., al final del embarazo, durante el trabajo de parto,
Fisiológico: R.N., al final del embarazo, durante el trabajo de parto, luego de emociones internasluego de emociones internas Infecciosa: Cuando es originado generalmente por gérmenes piógenos (apendicitis) y algunas Infecciosa: Cuando es originado generalmente por gérmenes piógenos (apendicitis) y algunas infecciones virales como rabia, hepatitis, también en necrosis, enfermedades del metabolismo, infecciones virales como rabia, hepatitis, también en necrosis, enfermedades del metabolismo, etc.
etc.
Leucomoide > 30 millones / mm Leucomoide > 30 millones / mm33
Se halla mayormente en infecciones como meningitis, tosferina, mononucleosis infecciosa, Se halla mayormente en infecciones como meningitis, tosferina, mononucleosis infecciosa, tuberculosis y otros procesos graves
tuberculosis y otros procesos graves Leucopenia < 5000 / mm
Leucopenia < 5000 / mm33 Fisiológico.
Fisiológico. Se presenta en anemia perniciosa, mala Se presenta en anemia perniciosa, mala nutrición, anemia aplásticanutrición, anemia aplástica Infecciosas.
Infecciosas. Se presenta en ciertas enfermedades infecciosas en las que disminuye la formación deSe presenta en ciertas enfermedades infecciosas en las que disminuye la formación de glóbulos blancos, como sucede en algunos casos: Muy frecuente en fiebre tifoidea, salmonelosis y glóbulos blancos, como sucede en algunos casos: Muy frecuente en fiebre tifoidea, salmonelosis y fiebre de malta (brucelosis).
fiebre de malta (brucelosis).
Un número disminuido de leucocitos (
Un número disminuido de leucocitos (leucopenialeucopenia) pueden aparecer en ciertas enfermedades:) pueden aparecer en ciertas enfermedades:
Fallo de la médula ósea (por tumores, Fallo de la médula ósea (por tumores, fibrosis, intoxicación, etc...)fibrosis, intoxicación, etc...)
Enfermedades autoinmunes (Lupus, etc...)Enfermedades autoinmunes (Lupus, etc...)
Enfermedades del hígado o riñónEnfermedades del hígado o riñón
Exposición a Exposición a radiacionesradiaciones
Un número aumentado de leucocitos (Un número aumentado de leucocitos (leucocitosisleucocitosis) puede deberse a:) puede deberse a:
Daño de tejidos en quemadurasDaño de tejidos en quemaduras
Enfermedades infecciosasEnfermedades infecciosas
Enfermedades inflamatorias (por autoinmunidad-reumáticas o por alergia)Enfermedades inflamatorias (por autoinmunidad-reumáticas o por alergia)
EstrésEstrés
LeucemiaLeucemia
ALTERACIONES DE LA MEDICIÓN PORLA ACTUACIÓN DE MEDICAMENTOS ALTERACIONES DE LA MEDICIÓN PORLA ACTUACIÓN DE MEDICAMENTOS Pueden
Pueden aumentaraumentar el número de leucocitos:el número de leucocitos:
AlopurinolAlopurinol
Epinefrina o adrenalinaEpinefrina o adrenalina
CortisonaCortisona CloroformoCloroformo HeparinaHeparina QuininaQuinina TriamtereneTriamterene Pueden
Pueden disminuirdisminuir el número de el número de leucocitos:leucocitos:
AntibióticosAntibióticos AnticonvulsivantesAnticonvulsivantes AntihistamínicosAntihistamínicos AntitiroideosAntitiroideos ArsenicalesArsenicales BarbitúricosBarbitúricos DiuréticosDiuréticos QuimioterápicosQuimioterápicos SulfonamidasSulfonamidas Determinación de hematocrito Determinación de hematocrito
Definida como el volumen ocupado por los eritrocitos en una determinada cantidad de sangre. Definida como el volumen ocupado por los eritrocitos en una determinada cantidad de sangre. Generalmente se expresa como volumen de eritrocitos por 100 ml. de sangre (%). Es útil para el Generalmente se expresa como volumen de eritrocitos por 100 ml. de sangre (%). Es útil para el diagnóstico de anemia.
diagnóstico de anemia.
Representa la proporción de glóbulos rojos en la sangre circulante y se expresa en volúmenes por Representa la proporción de glóbulos rojos en la sangre circulante y se expresa en volúmenes por ciento.
ciento.
Técnicas de determinación Técnicas de determinación
Técnica del
Técnica del MicrohematocritMicrohematocritoo Determinación de la
Determinación de la velocidad de sedimentación globular (Ertitrosedimentación)velocidad de sedimentación globular (Ertitrosedimentación)
Viene a ser la velocidad de caída de los eritrocitos en sangre con anticoagulante. La VSG depende Viene a ser la velocidad de caída de los eritrocitos en sangre con anticoagulante. La VSG depende de la velocidad de concentración del fibrinógeno, en menor
de la velocidad de concentración del fibrinógeno, en menor grado de la grado de la globulina y de la globulina y de la diferenciadiferencia existente entre la densidad del plasma y la masa gl
existente entre la densidad del plasma y la masa globular.obular.
Este examen mide la tendencia de los eritrocitos a sedimentar, a colocar sangre anticoagulada en Este examen mide la tendencia de los eritrocitos a sedimentar, a colocar sangre anticoagulada en un tubo en posición vertical. Se lee macroscópicamente a cabo de 1 hora la
Técnicas de determinación
Técnica de Microsedimentación
MATERIALES Y MÉTODOS 1. Sangre venosa
La sangre venosa es necesaria para la mayoría de las pruebas que requieran anticoagulación o cantidades mayores de sangre, plasma o suero de lo que podría proporcionar la sangre capilar. Materiales:
- Aguja Nº 21 de 1 ½” - Aguja de vacutainer
- Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo - Alcohol 70º
- Algodón
- Jeringas de 5 mL.
- Tubos de prueba con EDTA-sequestrene
- Tubos al vacío con anticoagulante EDTA (K3), EDTA (Na2) u otro anticoagulante. - Agujas con dispositivo para extracción de sangre al vacío:
- Nº 21 para adultos.
- Nº 22 para niños y neonatos.
De preferencia, ambas de bisel corto para evitar la coagulación - Gradilla - Guantes - Mascarillas - Marcador de vidrio - Lapiceros. Procedimiento
OBTENCIÓN DE SANGRE CON JERINGA O EN TUBO DE PRUEBA
a) La sangre venosa es normalmente obtenida de una de las venas de la fosa cubital.
b) Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de la flexión del codo. Sujetar con un medio nudo, verificar que los elementos a utilizar estén listos y que el paciente este cómodo.
c) Limpiar la zona con alcohol de 70º que puede ser iodado en un área de 2 pulgadas.
d) El paciente deberá abrir y cerrar la mano durante unos segundos y después la mantendrá cerrada. Esto ayuda a mantener las venas superficiales.
e) Se retira el estuche que protege la aguja de la jeringa y se coge de tal manera que el bisel se encuentre hacia arriba.
f) Se coloca la aguja paralela a la vena, se perfora la piel haciendo avanzar la aguja 0.5 a 1 cm, en el tejido subcutáneo, luego se perfora la vena.
g) Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido. En caso de usar tubo de prueba se deja gotear hasta obtener el volumen deseado.
h) Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puño. Se coloca algodón con escaso alcohol o sin él encima de la punción y se retira la aguja.
i) Retirar la jeringa y vaciar a los tubos de prueba con anticoagulante y una gota a la lámina portaobjetos puede ser utilizado para realizar el frotis. En caso de usar sólo aguja se retira la aguja.
j) Agitar el tubo en círculos sobre la mesa para homogeneizar con el anticoagulante, en caso que se extraiga para exámenes hematológicos. Para exámenes bioquímicos se extrae en tubos de prueba y luego se centrífuga.
OBTENCIÓN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequeña o cuando por diferentes motivos no pueda practicarse una punción venosa, debe recurrirse a la punción capilar.
Materiales - Lancetas descartables - Alcohol - Algodón - Marcador de vidrio - Lapiceros - Cuaderno de apuntes Procedimiento
a) La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anular en los adultos y en el dedo gordo del pie o talón en los niños.
b) Desinfectar la zona con alcohol de 70%, secar con algodón estéril.
c) Usar gasa estéril para desechar la primera gota y recoger las siguientes. Evitar comprimir la extremidad para obtener sangre por que se altera la composición sanguínea. La gota que se forma, para el análisis, debe ser redonda, caso contrario, significa que la piel está húmeda, secar con gasa estéril.
Recuento de eritrocitos: Método hemocitométrico Materiales:
- Sangre capilar o venosa (con o sin anticoagulante) - Solución de Hayem
- Pipeta de Thoma para G.R. - Sorbete
- Papel higiénico o algodón - Cámara de Neubauer - Laminilla de Neubauer - Agitador mecánico - Microscopio - Contómetro Procedimiento
Preparación para el recuento
2. Llenar la pipeta de glóbulos rojos con sangre hasta la marca de 0,5 para realizar una dilución de 1/200, y si se carga hasta 1, la dilución será 1/100. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente.
3. Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem) y llenar de líquido de dilución hasta la marca de 101.
4. Se coloca en un rotador automático o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos. 5. Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequeña
cerca de un extremo de la cámara para que por capilaridad se llene exactamente. 6. Hacer el recuento con objetivo de 40x
7. Se puede realizar con la pipeta automática, se toma 20 µL (0,02mL) de sangre total con anticoagulante, o sangre capilar y se deposita en un tubo de 12 x 75 que contenga 4 ml de solución de Hayem (aquí se tiene una dilución de 1:200). Se deja reposar aproximadamente 5 minutos y se procede a cargar la cámara con la misma pipeta usando un nuevo tip. El inconveniente aquí es el gasto de reactivo (4 ml) pero las medidas son más exactas.
Recuento
- Cuéntese los eritrocitos situados en 5 pequeños cuadraditos del gran retículo central (cada cuadradito pequeño a su vez está subdividido en 16 pequeños cuadraditos, además se debe considerar los 4 pequeños cuadraditos ubicados en los extremos y 1 central).
- Se incluyen al recuento las células que toquen los límites izquierdo y superior de los cuadrados, pero no aquellos que toquen los límites derecho e inferior.
- Anótese la cantidad hallada en cada uno de los cuadrados.
- Las diferencias entre las cifras mayor y menor no deberá exceder de 20.
- Multiplíquese el total de G.R. contados por 10,000 con el objeto de obtener el número de eritrocitos por mm3de sangre.
Cálculos
¿Por qué multiplicar por 10,000?, por lo siguiente: Dilución de la sangre: 1/200
Volumen total: 0.02 mm3, que resulta de multiplicar 0.00025 mm3 por 80 Factor 1/0.02 mm3 = 50
Glóbulos rojos/mm3= total de glóbulos rojos contados por inversa de la dilución x Factor = Total de glóbulos rojos contados por 10,000
Otra forma de realizar los cálculos sería el siguiente
No de hematíes x mm3 = hematíes contados en 5 cuadrados pequeños Altura x dilución x área
REEMPLAZANDO:
= hematíes contados en 5 cuadrados pequeños 1/10 x 1/200 x 1/5
1/10,000 1/10,000 =
= hematíes hematíes contados contados x x 10,00010,000 Nota
Nota 1). C
1). Cámara dámara de Nee Neubauer ubauer mejorada mejorada (hemocitómetro).(hemocitómetro).
2). Pipeta de glóbulos rojos (de Thoma).- Presenta cerca del extremo superior, una marca de 101, 2). Pipeta de glóbulos rojos (de Thoma).- Presenta cerca del extremo superior, una marca de 101, inmediatamente continúa una dilatación (bulbo) que contiene una perlita roja mezcladora, luego inmediatamente continúa una dilatación (bulbo) que contiene una perlita roja mezcladora, luego sigue el tallo (extremo más largo),
sigue el tallo (extremo más largo), la cual está dividida en diez partes la cual está dividida en diez partes con dos marcas: 1 con dos marcas: 1 (acabando(acabando el bulbo) y 0.5 a la mita
el bulbo) y 0.5 a la mitad del tallo. Se d del tallo. Se utiliza al igual que putiliza al igual que para los leucocitoara los leucocitos s una boquilla parauna boquilla para aspirar (sorbete).
aspirar (sorbete). 3).
3). Diluyente Diluyente de de glóbulos glóbulos Rojos: Rojos: Cloruro Cloruro de de Sodio Sodio al al 0.9%.0.9%. Diluyente de Hayem. Diluyente de Hayem.
Recuento Total de Leucocitos Recuento Total de Leucocitos
Materiales: Técnica hemocitométrica Materiales: Técnica hemocitométrica
-- Sangre capilar o venosa (con o sin Sangre capilar o venosa (con o sin anticoagulanteanticoagulante))
-- Solución de TurkSolución de Turk
-- Pipeta de Thoma para G.B.Pipeta de Thoma para G.B.
-- SorbeteSorbete
-- Papel higiénico o algodónPapel higiénico o algodón
-- Cámara de NeubauerCámara de Neubauer
-- Laminilla de NeubauerLaminilla de Neubauer
-- Agitador mecánicoAgitador mecánico -- MicroscopioMicroscopio -- ContómetroContómetro Procedimiento Procedimiento
Preparación para el recuento Preparación para el recuento
-- Emplear sangre venosa con anticoagulante o Emplear sangre venosa con anticoagulante o sangre obtenida por punción cutánea.sangre obtenida por punción cutánea.
-- Utilizando la pipeta de Thoma, aspirar sangre hasta la Utilizando la pipeta de Thoma, aspirar sangre hasta la marca 0.5marca 0.5 Limpiar la sangre excedente del extremo de la pipeta,
Limpiar la sangre excedente del extremo de la pipeta, con papel filtro o gasa, (cantidad)con papel filtro o gasa, (cantidad)
-- Completar hasta la marca 11, Completar hasta la marca 11, con solución de Turk y mantener en posición horizontalcon solución de Turk y mantener en posición horizontal Evitar la formación de burbujas (volumen)
Evitar la formación de burbujas (volumen)
-- Agitar la pipeta durante de 03 minutos, utilizando un agitador mecánico o cubriendo losAgitar la pipeta durante de 03 minutos, utilizando un agitador mecánico o cubriendo los extremos con los dedos de la mano.
extremos con los dedos de la mano. Utilizar guantes por bioseguridad Utilizar guantes por bioseguridad
-- Eliminar la cuarta parte del contenido de la Eliminar la cuarta parte del contenido de la pipeta (3 a 5 gotas)pipeta (3 a 5 gotas) Para permitir formar muestra del émbolo de
Para permitir formar muestra del émbolo de la pipeta.la pipeta.
-- Cargar inmediatamente un lado de la cámara Cargar inmediatamente un lado de la cámara de Neubauer, colocando para ello una gotade Neubauer, colocando para ello una gota entre la superficie de la cámara y
entre la superficie de la cámara y el cubreobjetos.el cubreobjetos. Se debe evitar la sobrecarga.
Se debe evitar la sobrecarga.
-- Dejar en reposo durante 03 minutos.Dejar en reposo durante 03 minutos. Para que sedimenten los G. R. en la
-- Colocar la cámara sobre la platina del microscopio y enfocar a menor aumento (10X),Colocar la cámara sobre la platina del microscopio y enfocar a menor aumento (10X), localizando el retículo de la
localizando el retículo de la cámara.cámara. Aplicar normas de manejo del
Aplicar normas de manejo del microscopiomicroscopio Recuento
Recuento
-- Cuéntese los leucocitos situados en los 4 cuadrantes de los retículos externos de laCuéntese los leucocitos situados en los 4 cuadrantes de los retículos externos de la cámara de Neubauer (cada cuadrado está subdividido en 16 cuadraditos).
cámara de Neubauer (cada cuadrado está subdividido en 16 cuadraditos).
-- Multiplíquese el total de G.R. contados por 50 con el objeto de obtener el número deMultiplíquese el total de G.R. contados por 50 con el objeto de obtener el número de eritrocitos por mm
eritrocitos por mm33de sangre.de sangre.
-- Se incluyen al recuento las células que toquen los límites izquierdo y superior de losSe incluyen al recuento las células que toquen los límites izquierdo y superior de los cuadrados, pero no aquellos que toquen los límites derecho e inferior.
cuadrados, pero no aquellos que toquen los límites derecho e inferior.
-- Anótese la cantidad hallada en cada uno de los Anótese la cantidad hallada en cada uno de los cuadrados.cuadrados.
-- Las diferencias entre las cifras mayor y menor Las diferencias entre las cifras mayor y menor no deberá exceder de 10.no deberá exceder de 10.
-- El recuento deberá ser efectuado a menor aumento con objetos de 10X.El recuento deberá ser efectuado a menor aumento con objetos de 10X. Cálculos
Cálculos
¿Porqué multiplicar por 50?, por lo sig
¿Porqué multiplicar por 50?, por lo siguiente:uiente: Dilución de la sangre: 1/20 Dilución de la sangre: 1/20 Volumen total: 0.4 mm Volumen total: 0.4 mm33 Factor 1/0.4 mm3 = 2.5 Factor 1/0.4 mm3 = 2.5 Glóbulos blancos/mm
Glóbulos blancos/mm33 = total de glóbulos blancos contados por inversa de la dilución x= total de glóbulos blancos contados por inversa de la dilución x Factor = Total de glóbulos rojos contados por 50.
Factor = Total de glóbulos rojos contados por 50.
Determinación del hematocrito:Técnica del Microhematocrito Determinación del hematocrito:Técnica del Microhematocrito
Materiales Materiales
-- Sangre con o sin anticoagulanteSangre con o sin anticoagulante
-- Microcapilares heparinizadMicrocapilares heparinizados o os o no heparinizadosno heparinizados
-- Plastilina o mechero de BunsenPlastilina o mechero de Bunsen
-- GradillaGradilla
-- CronómetroCronómetro
-- Regla milimetradaRegla milimetrada Procedimiento
Procedimiento
Se emplea tubos capilares de 7 cm. de largo y 1 mm. de diámetro interior. Algunos capilares Se emplea tubos capilares de 7 cm. de largo y 1 mm. de diámetro interior. Algunos capilares están cubiertos con heparina al 1/100. Otros no tiene y se utiliza sangre con anticoagulante. están cubiertos con heparina al 1/100. Otros no tiene y se utiliza sangre con anticoagulante. Se puede utilizar sangre venosa o capilar. El tubo se llena hasta 1 cm del extremo y este se Se puede utilizar sangre venosa o capilar. El tubo se llena hasta 1 cm del extremo y este se cierra a llama o se tapona con plastilina. Se centrífuga a altas velocidades en centrífuga cierra a llama o se tapona con plastilina. Se centrífuga a altas velocidades en centrífuga especial a 16.,500 rpm/3 minutos o a 10,000 rpm/5 minutos o a 3,000 rpm/30 minutos. especial a 16.,500 rpm/3 minutos o a 10,000 rpm/5 minutos o a 3,000 rpm/30 minutos. Después se lee la proposición del volumen ocupado por los hematíes con una regla Después se lee la proposición del volumen ocupado por los hematíes con una regla milimetrada con tabla de lectura para hematocrito o con el dispositivo que para tal fin milimetrada con tabla de lectura para hematocrito o con el dispositivo que para tal fin acompaña a la centrífuga. acompaña a la centrífuga. Valores de referencia Valores de referencia Varones 40 Varones 40 – –50%50% Mujeres 38 Mujeres 38 – –44%44%
Niños
Niños (5 (5 años) años) 3838 – –44%44% Lactantes
Lactantes (3 (3 meses) meses) 3737 – –42%42% Recién
Recién nacidos nacidos 5050 – –58%58% Variaciones
Variaciones
-- En una anemia crónica posEn una anemia crónica pos – – hemorragia, según Wintrobe, el volumen de eritrocitoshemorragia, según Wintrobe, el volumen de eritrocitos sedimentados se reduce al 13%, en anemia perniciosa 8%, en la eritemia 60% y en la sedimentados se reduce al 13%, en anemia perniciosa 8%, en la eritemia 60% y en la clorosis 25%. Su valor diagnóstico incluye la intensidad del luecopenia, leucocitosis, clorosis 25%. Su valor diagnóstico incluye la intensidad del luecopenia, leucocitosis, alteraciones en el número de trombocitos y aspectos sanguíneos.
alteraciones en el número de trombocitos y aspectos sanguíneos.
-- En general disminuye los valores de hematocrito en los casos de hemodilución talesEn general disminuye los valores de hematocrito en los casos de hemodilución tales como: la hidremia fisiológica del embarazo; al contrario de la hemoconcentración a como: la hidremia fisiológica del embarazo; al contrario de la hemoconcentración a consecuenc
consecuencia de shock ia de shock que dan a que dan a valores elevados, aparentemente patológicas.valores elevados, aparentemente patológicas.
B).-
B).- Determinación Determinación de de la la velocidad velocidad de de Sedimentación Sedimentación Globular Globular (Ertitrosedimentación)(Ertitrosedimentación) Materiales
Materiales
Técnica de
Técnica de MicrosedimentaciónMicrosedimentación
-- Sangre con o sin anticoagulanteSangre con o sin anticoagulante
-- Microcapilres heparinizados o no heparinizadosMicrocapilres heparinizados o no heparinizados
-- Plastilina o Plastilina o mechero dmechero de Bunsene Bunsen
-- GradillaGradilla
-- CronómetroCronómetro
-- Regla milimetradaRegla milimetrada Procedimiento
Procedimiento
Se emplea tubos capilares de 7 cm de largo 1 mm de diámetro interior. Algunos capilares Se emplea tubos capilares de 7 cm de largo 1 mm de diámetro interior. Algunos capilares están cubiertos con heparina al 1/100. Otros no tiene y se utilizan sangre con están cubiertos con heparina al 1/100. Otros no tiene y se utilizan sangre con anticoagulante.
anticoagulante.
Se puede utilizar sangre venosa o capilar. El tubo se llena hasta 1 cm del extremo y este se Se puede utilizar sangre venosa o capilar. El tubo se llena hasta 1 cm del extremo y este se cierra a llama o se tapona con plastilina. Se deja en reposo en posición vertic
cierra a llama o se tapona con plastilina. Se deja en reposo en posición vertical / al / 01hs.01hs. Después se lee la proporción del volumen ocupado por el plasma con una
Después se lee la proporción del volumen ocupado por el plasma con una regla milimetrada.regla milimetrada. Valores de referencia
Valores de referencia Varones
Varones hasta hasta 14 14 mm mm / / hh Mujeres
Mujeres hasta 20 hasta 20 mm mm / / hh
Variaciones Variaciones
Se modifica siempre y cuando exista un desequilibrio humoral que afecta a las proteínas Se modifica siempre y cuando exista un desequilibrio humoral que afecta a las proteínas plasmáticas acelerándose cuando aumenta la proporción fibrinógeno que ocurre los plasmáticas acelerándose cuando aumenta la proporción fibrinógeno que ocurre los hematíes y los adhiere entre sí formando globulinas, otros factores son prácticamente hematíes y los adhiere entre sí formando globulinas, otros factores son prácticamente despreciables.
Se observa aumento en todas las enfermedades infecciosas agudas o crónicas en período de evolutivitas, en las afecciones purulentas, tumores malignos, fiebre reumática, enfermedades generativas, enfermedades de la sangre y del sistema hematopoyético, embarazo, etc. La eritrosedimentación también se encuentra aumentada por la ingestión de dextrano, penicilina y vitamina A.
Se halla disminuida en la policitemia vera, en algunas afecciones hepáticas, etc.
Anexo N° 01
Información Sobre la Cámara de Recuento 1. Lo que es una cámara de conteo y dónde se utiliza
La cámara de conteo es un aparato de vidrio óptico especial de precisión. Se utiliza para contar células u otras partículas en suspensiones bajo el microscopio.
Las cámaras de conteo se utilizan principalmente para el análisis de sangre (conteo de leucocitos, eritrocitos, trombocitos) y conteo de pulgadas en el licor. Pero las cámaras de conteo sirven también para el conteo de bacterias y esporas del moho.
2. Principio de construcción
Todas las cámaras de conteo muestran el mismo principio de construcción.
En una placa base rectangular y gruesa de vidrio óptico especial, del tamaño de un porta-objetos, en el tercio medio se hallan cuatro ranuras longitudinales, que transcurren en paralelo con respecto a los laterales cortos.
Las dos superficies laterales más grandes están sin trabajar y sirven para la rotulación. El puente central y los dos puentes exteriores están rectificados planos y pulidos. La superficie del puente central es más profunda que los dos puentes exteriores. En el puente central (fondo de la cámara) están grabadas las redes de conteo.
Cuando se coloca un cubreobjeto sobre los puentes exteriores, entre la cara inferior del cubreobjeto y el puente central de la cámara de conteo se produce una ranura capilar.
3. Ejecución e identificación de las cámaras de conteo Ejecución
Ejecución simple - puente central sin dividir (una red de conteo)
Ejecución doble - puente central dividido (dos redes de conteo)
Además, existen dos ejecuciones diferentes de división de redes: la normal y la de líneas claras:
• En la ejecución normal, la red de conteo está directamente grabada en el vidrio.
• En la ejecución de líneas claras, primero se recubre con rodio el fondo de la cámara y luego se raya la red de conteo en la capa de rodio. Mediante el desplazamiento del contraste, debajo del microscopio es posible la inversión de color, de manera que la red de conteo se puede ver opcionalmente en líneas claras u oscuras.
Identificación
En las dos superficies laterales, sin trabajar, de la cámara de conteo están impresas las siguientes indicaciones:
•El sistema de la red de conteo
•El nombre y la marca registrada del fabricante •La profundidad de la cámara en milímetros
•La superficie del cuadrado más pequeño en mm2 4. Fabricación y explicaciones de calidad
Las cámaras de conteo son aparatos de precisión. Se utilizan principalmente en laboratorios médicos. En Alemania sólo pueden utilizarse las cámaras de conteo y los cubreobjetos oficialmente contrastados, en el extranjero pueden ser usados también sin contrastar. Todas las cámaras de conteo distribuidas por la empresa Marienfeld se fabrican de acuerdo con la disposición válida sobre el contraste y la norma DIN. Por esta razón, hay que distinguir entre cámaras de conteo clasificadas y cámaras de conteo susceptibles de ser contrastadas.
Fabricación
Por esta razón, sólo se pretende describir a grandes rasgos la fabricación de cámaras de conteo. El mecanizado comprende varias operaciones parciales, seguidas de los correspondientes controles rigurosos.
El puente interior (fondo de la cámara) y los dos exteriores se rectifican y pulen. Gracias a este mecanizado se consiguen superficies especialmente planas y el puente interior (fondo de la cámara) enfrente de los puentes exteriores se rebaja exactamente en la profundidad de la cámara deseada.
Después de estas operaciones de trabajo, en la máquina divisora se graba con un diamante la red de conteo correspondiente (sistema).
Finalmente se efectúa la fase de impresión y secado al horno. Todas las cámaras de conteo se someten a un riguroso control final, que es regido por las exigencias de la norma DIN en vigor y las prescripciones de contraste.
Exigencias en cuanto al control de calidad
Las desviaciones de límites según la norma DIN 12847 son las siguientes:
• Para la profundidad de la cámara en la zona de una red de conteo + 2 % del valor nominal
•Para las distancias inferiores a 0,4 mm entre cualquieras líneas + 2 µm
• Para las distancias superiores a 0,4 mm entre cualquieras líneas + 0,5 % del valor nominal •Para los ángulos de la distribución de red + 1 grado
•El ancho de las marcas no podrá ser superior a 5 µm.
La tolerancia de planeidad, según DIN 7184, parte 1, es la siguiente:
•Para el fondo de la cámara en la zona de una red de conteo 2 µm
•Para las superficies de apoyo en la zona de una red de conteo 2 µm
•Para las láminas cubreobjetos 3µm (según DIN 58884) 5. Llenado de una cámara de conteo
Los puentes exteriores se humedecen con agua destilada y luego se coloca el cubreobjeto a suave presión desde delante sobre la cámara de conteo.
¡Atención: Peligro de rotura del cubreobjeto!
La formación de líneas de interferencia (anillos de Newton) entre los puentes exteriores y el cubreobjeto indica que el cubreobjeto ha sido correctamente colocado.
Alimentación
Quitar del sacudidor la pipeta bien mezclada y rechazar las primeras gotas. Limpiar, secando, desde el exterior la pipeta y luego mantenerla inclinada hasta que se haya formado una pequeña gota en la punta de la misma.
Esta gota se sitúa en el punto entre el cubreobjeto y la cámara de conteo. Por capilaridad se llena la hendedura entre el cubreobjeto y el fondo de la cámara. Antes de que la solución de sangre pueda hincharse en los bordes de la parte de la cámara, deberá haberse retirado de nuevo ya hacia un lado la punta de la pipeta. Si son visibles las burbujas de aire o si el líquido se hincha sobre los bordes en las ranuras, deberá limpiarse la cámara y alimentarse de nuevo.
Pipetas de mezclado de sangre utilizadas
•Pipeta de eritrocitos (perla roja)
6. Recuento de las partículas Técnica de conteo
El recuento presupone un conocimiento exacto de las líneas límite de las cámaras de conteo utilizadas. Éstas se pueden ver en la ilustración.
Para que las células, que están en o cerca de las líneas de limitación, no se cuenten dos veces o se sobrepasen en el conteo, hay que atenerse a determinadas reglas (p.ej., véase la ilustración derecha).
Se cuentan todas las células dentro de una zona de medición definida.
También se cuentan las células (marcadas en negro), que se apoyan o tocan en las 2 caras (I), p.ej. en la línea de medida izquierda y superior.
Esto también es válido para el tipo de la operación de conteo propiamente dicha, que debe efectuarse en forma de meandro.
El recuento se efectúa en el ángulo superior izquierdo en dirección de la flecha.
a) En todos los conteos de cámaras, el diagrama del condensador en el microscopio deberá estar cerrado en gran parte.
b) La diferencia de las células contadas en los cuadrados grandes y en los cuadrados de grupos no podrá ser superior a 10 células.
c) En todos los conteos de células, han de realizarse dobles determinaciones. Después del recuento de la red de conteo superior, se recuenta como control también la red de conteo inferior. Ha de tenerse en cuenta que la cámara no esté resecada. Esto puede evitarse cuando la cámara inferior se llene justo poco antes del recuento y se recuente después del tiempo de sedimentación.
d) La diferencia entre las sumas del recuento de ambas redes de conteo no podrá ser superior a 10 células. El valor medio de los conteos se aplica luego en una fórmula de cálculo o se multiplica por el factor correspondiente.
7. Cálculo Fórmula:
EJEMPLO:
Cámara: Neubauer improved a) Leucocitos
1. Células recontadas 161 leucocitos
2. Superficie recontada 4 cuadrados ( = 4 × 1 mm² ) = 4 mm² 3. Profundidad de la cámara 0,1 mm
4. Dilución 1 : 20
b) Eritrocitos
1. Células recontadas 507 eritrocitos
2. Superficie recontada 5 cuadrados ( = 5 × 0,04 mm² ) = 0,2 mm² 3. Profundidad de la cámara 0,1 mm
4. Dilución 1 : 200
8. Limpieza de las cámaras de conteo
Inmediatamente después del conteo realizado, se quita el cubreobjeto y la cámara de conteo se limpia con agua o - en caso de necesidad - con una solución limpiadora suave.
A continuación, la cámara se seca con un paño blando o se lava con acetona. 9. Breve descripción de la cámara de conteo
Neubauer-improved
Los diferentes sistemas de cámaras de conteo se diferencian por la ejecución de la red de conteo y la profundidad de la cámara. La red de conteo está compuesta de una división de red cuadrada que sólo queda visible con el microscopio (aprox. 100 aumentos). A continuación se pretende describir la cámara de conteo Neubauer-improved más utilizada: Cuadrado grande : 1 mm²
Cuadrado de grupos : 0,04 mm² Cuadrado pequeño : 0,025 mm²
La profundidad de la cámara es de 0,100 mm. La división de red de esta cámara muestra 3 cuadrados grandes 3 veces de una superficie de 1 mm2, respectivamente. Los 4 cuadrados rectangulares se utilizan para el conteo de los leucocitos. El gran cuadrado en el centro está adicionalmente dividido en 5 cuadrados en grupos de 5 con una longitud lateral de 0,2 mm, respectivamente, y un contenido de superficie de 0,04 mm2. A su vez, los cuadrados de los grupos están subdivididos en 16 cuadrados pequeños de 0,0025 mm2 cada uno.
Cinco de estos cuadrados de grupos son utilizados en el conteo de eritrocitos. Merece especial atención el hecho de que la cámara muestre triples líneas límite por todos los lados, de las cuales la línea central (!) ha de considerarse la línea de medida propiamente dicha. Esto es importante para valorar si las células que están en la zona límite, han de ser o no contadas también.
10. Por qué cámaras de recuento ocupan su puesto en el laboratorio a pesar de contadores eléctricos
• En laboratorios menores no vale la pena la compra de aparatos electrónicos caros. • Se usan las cámaras de recuento para p.ej. el recuento de células de licor ó de efusiones, recuento de huevos de verme, bacterias y esporas del moho.
•Para el recuento de pocos trombocitos los instrumentos electrónicos son menos exactos que las cámaras de recuento.
En la práctica ocurren aplicaciones incorrectas como sigue:
•La cámara de recuento no estaba limpiada
•El cubre-objeto no está puesto correctamente (ningunos anillos de interferencia)
•Hay burbujas de aire en el relleno de la cámara
•La cámara está sobrellenada
•El tiempo de sedimentación era demasiado corto contadores eléctricos
•En laboratorios mayores se usan (gastos altos de inversión)
•Desventaja: Con frecuencia se distinguen los tipos de células por tamaños. Resultan errores en los contadores eléctricos a causa de partículas de polvo ó hilachas.
muchas partículas. Durante el recuento resulta el error estadístico Fórmula: error estadístico = 1 : n
con n = 100 de células contadas 1:100 = 0,1 = 10 % con n = 10.000 células contadas 1:10.000 = 0, 01 = 1 %
CUESTIONARIO
1. Mencione las ventajas y desventajas de la extracción sanguínea venosa y capilar.
2. Esquematice las zonas de punción adecuada para la extracción sanguínea venosa y capilar.
3. Investigue porque se forma hematomas después de la extracción sanguínea. 4. Mencione otros métodos para la determinación de hematíes y las variaciones
en el recuento con respecto a los valores referenciales.
5. ¿Qué sucede con la sangre cuando entran en contacto con la solución de Hayen? Explique.
6. Explique cuando ocurre la polisemia.
7. Mencione en que tipos de enfermedades varían los valores de la VSG. 8. Refiérase a las aplicaciones del método automático en hematología.
PRÁCTICA N° 06
I. OBJETIVOS
- Conocer las diferentes técnicas que se aplican en la determinación del hemograma. - Desarrollar las actividades y destrezas del alumno, en el manejo de las técnicas. - Que el alumno tenga la suficiente capacidad de interpretación de los resultados. II. INTRODUCCIÓN
El hemograma es un análisis de sangre en el que se mide en global y en porcentajes los tres tipos básicos de células que contiene la sangre, las denominadas tres series celulares sanguíneas:Serie eritrocitaria o serie roja, serie leucocitaria o serie blanca y serie plaquetaria
Cada una de estas series tiene unas funciones determinadas, y estas funciones se verán perturbadas si existe alguna alteración en la cantidad o características de las células que las componen.
La serie roja está compuesta por los hematíes o glóbulos rojos. Su función primordial es transportar el oxígeno desde los pulmones (a donde llega a través de la respiración) a todas las células y tejidos del organismo.
En el hemograma se cuantifica el número de hematíes, el hematocrito, la hemoglobina y los índices eritrocitarios:
El hematocrito mide el porcentaje de hematíes en el volumen total de la sangre.
La hemoglobina es una molécula que forma parte del hematíe, y que es la que transporta el
oxígeno y el dióxido de carbono; se mide su concentración en sangre.
Los índices eritrocitarios proporcionan información sobre el tamaño (VCM), la cantidad (HCM)
y la concentración (CHCM) de hemoglobina de los hematíes; el más usado es el VCM o volumen corpuscular medio.
Todos estos valores varían dentro de la normalidad según la edad y el sexo.
La serie blanca está formada por los leucocitos o glóbulos blancos. Sus funciones principales son la defensa del organismo ante las infecciones y la reacción frente a sustancias extrañas.
El recuento de leucocitos tiene dos componentes. Uno es la cifra total de leucocitos en 1 mm3de
sangre venosa; el otro, la fórmula leucocitaria, mide el porcentaje de cada tipo de leucocitos, que son: segmentados o neutrófilos, monocitos, linfocitos, eosinófilos y basófilos. El aumento del porcentaje de un tipo de leucocitos conlleva disminución en el porcentaje de otros.
Estos valores varían dentro de la normalidad según la edad.
La serie plaquetaria compuesta por plaquetas o trombocitos, se relaciona con los procesos de coagulación sanguínea.
En el hemograma se cuantifica el número de plaquetas y el volumen plaquetario medio (VPM). El VPM proporciona información sobre el tamaño de las plaquetas.
El recuento de plaquetas también varía con la edad.
Como realizar la prueba.
Esta prueba no precisa ayuno previo. Previa desinfección se extraen en torno a 5 cc de sangre venosa, generalmente de una vena de la flexura del codo. Tras terminar la extracción y retirar la aguja, se aplica presión en el punto de punción durante unos minutos. Posteriormente se comprueba que no haya hemorragia en dicho punto.
Utilidad
El hemograma es una prueba que sirve para orientar hacia el diagnóstico de diversas enfermedades que se han sospechado por la historia clínica y la exploración física.
A veces, los datos que nos da son suficientes para confirmar o descartar la enfermedad sospechada, pero con frecuencia se necesita utilizar otras pruebas diagnósticas que aporten más información.
Factores que interfieren en los resultados
Serie roja:
Alteración en el tamaño de los hematíes. Un número muy alto de leucocitos.
Hemodilución: aumento de la cantidad proporcional de agua en la sangre. Deshidratación: pérdida de agua del organismo, que se refleja en la sangre. Embarazo: porque se produce hemodilución.
Residencia a gran altitud: por ejemplo, la gente que vive en el altiplano andino. Hemorragia inmediatamente previa a la prueba.
Medicamentos. Serie blanca:
La ingestión de algunos alimentos, la actividad física y el estrés pueden aumentar
el número de leucocitos.
Durante el último mes de embarazo y en el parto, puede aumentar la cifra de
leucocitos.
Las personas a las que se les ha extirpado el bazo pueden tener una elevación leve
y persistente de la cifra de leucocitos.
Medicamentos, que pueden aumentar o disminuir los niveles.
Serie plaquetaria:
La residencia a gran altitud puede aumentar los niveles de plaquetas.
El ejercicio muy intenso puede aumentar el número de plaquetas. Medicamentos, que pueden aumentar o disminuir las cifras.
III. MATERIALES Y METODOS
Se basarán en las siguientes metodologías:
1. Recuento de Glóbulos Rojos: Método hemocitométrico 2. Recuento de Glóbulos Blancos: Método hemocitométrico 3. Recuento de Plaquetas: Recuento en Lámina Porta Objetos 4. Fórmula Leucocitaria: Recuento hemocitométrico
5. Determinación del hematocrito: Técnica del Microhematocrito
7. Índices hematológicos: VCM, HCM y CHCM
RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (FORMULA LEUCOCITARIA)
OBJETIVOS
Conocer, diferenciar y resaltar las funciones de los diversos leucocitos.
INTRODUCCION
La fórmula leucocitaria tiene por objetivo determinar los porcentajes de las distintas clases de leucocitos normales y anormales en la sangre. A partir de los porcentajes puede incluso calcularse el número real de cada clase de leucocitos por mm3 de sangre (valor absoluto), conociéndose el total de leucocitos.Por ejemplo:Si se tiene 60% de neutrófilos segmentados y el recuento total de leucocitos total es de 20 000, entonces la cifra absoluta de neutrófilos segmentados sería:
60/100 x 20 000 = 12 000 (valor absoluto)
Valores de referencia absolutos de neutrófilos segmentados = 3000 - 5000
Conclusión: Los valores relativos sólo nos sirven cuando los valores totales de leucocitos se encuentran dentro del valor normal. En caso contrario (leucocitosis o leucopenia) se debe emplear la fórmula para obtener el valor real, y así determinar que elemento celular se encuentra fuera del rango nor- mal, sea elevado o disminuido.
PROCEDIMIENTO
1.
Preparación del frotis por el método de los dos
portaobjetos
Consiste en la extensión de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75), empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensión.
MATERIALES
Lancetas descartables
Alcohol 70°
Algodón
Portaobjetos limpios y desengrasados (25 x 75 mm).
PROCEDIMIENTO
Una vez extraída la sangre con cualquiera de las metodologías, se coloca una pequeña gota de sangre (5mL) (aprox. 3 mm de diámetro) sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos.
Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficie del primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre) formando un ángulo de 45º.
Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre el otro en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida sobre la superficie del primer portaobjeto.
El grosor del frotis sanguíneo puede variar según sea el ángulo que formen entre sí ambos portaobjetos. Así, si es superior a 45º, la extensión obtenida será gruesa y corta, si es inferior a 45º será larga y fina. El secado del frotis es a temperatura ambiente y en posición horizontal.
Zona excesivamente gruesa: Se halla en la región inmediata al punto de partida de la extensión (cabeza). En ella se aprecia siempre un aumento de linfocitos.
Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensión y termina en un área donde las células adoptan una posición acartonada (barbas). En esta región existe un exceso de granulocitos y monocitos.
ella existe un reparto equilibrado de células.
2. COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis, se procede a la tinción hematológica con el colorante de Romanowsky, constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno. Dentro de éstas tenemos:
Colorante de Giemsa.
Colorante de Wright.
Colorante de Leishman
No todos los leucocitos (G.B.) que circulan en la sangre son idénticos. Existen 5 tipos principales que se diferencian por el tamaño, la forma del núcleo y el color de los gránulos del citoplasma.La proporción o porcentaje de cada tipo de leucocitos es importante para el diagnóstico. Esta proporción o porcentaje se denomina: fórmula leucocitaria.
- Para trabajar esta fórmula se cuentan 100 leucocitos y se anota el número que se ha encontrado de cada tipo de ellos.
- Los colorantes más usados son:
- Para el estudio de las células sanguíneas utilizar el 3 y 4, mientras que para estudio de hemoparásitos utilizar el 1. El 2 utilizar para casos especiales en que se desee observar con mayor claridad y especificidad los gránulos de los neutrófilos.
Valores de Referencia
Eosinófilos 1 - 4% Basófilos 0 - 1% Neutrófilos: Abastonados (cayado) 2 - 5% Segmentados 45 - 65% Linfocitos 20 - 45% Monocitos 4 - 8%Factores de error
Frotis mal elaborado
Tiempo inadecuado de exposición al colorante.
3. Utilización de materiales sucios y/o húmedos.
3. TINCIÓN CON COLORANTE DE WRIGHT
Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar la sangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura, forma y tamaño de los eritrocitos, su contenido de hemoglobina y sus propiedades de coloración. La información obtenida de un frotis de sangre periférica depende en gran parte de la calidad del extendido y la coloración.
MATERIALES
Colorante de Wright
Frasco gotero.
Solución amortiguada tamponada
Agua tamponada
PROCEDIMIENTO
1. Una vez obtenido el frotis sanguíneo, se le dejará secar entre 15 y 20 minutos. 2. Luego se coloca la preparación en un soporte y se cubre con el colorante de
Wright, dejándolo por espacio de 5 minutos.
3. Posteriormente se añade solución amortiguada tamponada en partes iguales hasta obtener un brillo metálico, dejando 6 minutos adicionales.
4. Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar.
5. Se coloca en el microscopio y, con pequeño aumento, se revisa la calidad de la coloración, la cantidad aproximada de glóbulos blancos y se escoge el s itio para iniciar el recuento. Se coloca una gota de aceite de inmersión y se enfoca a un aumento de 100x
6. La forma de los glóbulos rojos se examinará detenidamente observando además del color (cantidad de hemoglobina), presencia de plaquetas, su agrupación y distribución.
CUESTIONARIO.
1. Mencione las variaciones en el recuento diferencial de leucocitos en relación a los valores de referencia de los mismos.
PRÁCTICA N° 07
I. OBJETIVOS
- Conocer el fundamento y las técnicas para determinar las diferentes fases de la hemostasia. - Desarrollar actividades y destrezas del estudiante.
II. INTRODUCCIÓN
Si por alguna razón se produce la ruptura de un vaso sanguíneo, es decir una solución de continuidad en el endotelio vascular, se producirá la pérdida de la sangre (hemorragia). El organismo pone en movimiento una serie de mecanismos encargados de detener el sangrado; esta respuesta se llama hemostasia.
Fases Técnicas
a. Fase vascular Tiempo de sangría
b. Fase plaquetaria Recuento de plaquetas HemorragiaHEMOSTASIA Intrínseca Tiempo de tromboplastina
c. Fase de coagulación Tiempo de coagulación Extrínseca Tiempo de protrombina d. Fase de fibrinolisis Prueba de fibrinolisis 2. TOMA DE MUESTRAS
Consideraciones generales
1. Uso de los anticoagulantes indicados; el tipo y la proporción del anticoagulante deben ser evaluados previamente para cada muestra.
2. La sangre; y luego de su centrifugación, el plasma; obtenido son activados por contacto con el vidrio. Esto puede alterar algunas pruebas por ello se sugiere usar recipientes de
superficie “no humedecibles”, como vidrio o plástico siliconado.
3. El material de vidrio debe lavarse con detergente y luego ser puesto en mezcla sulfocrómica por lo menos durante seis horas. Luego debe ser enjuagada con agua destilada varias veces, que residuos de proteínas deben contener sustancias tromboplásticas que activan el mecanismo de coagulación.
4. Las pruebas deben realizarse lo antes posible y de haber demora, éstas se podrán en refrigeración a 4º C, para ser procesadas después.
5. Las pruebas se realizan por duplicado, haciendo uso de controles normales.
6. Las muestras controles serán obtenidos usando la misma técnica empleada para obtener la muestra problema.
7. Los promedios no deben diferir del 10% entre sí.
HEMOSTASIA: RECUENTO DE PLAQUETAS, TIEMPO DE SANGRÍA Y
TIEMPO DE COAGULACIÓN
EXPLORACIÓN DE LA HEMOSTASIA INTRODUCCIÓN
La exploración global de la hemostasia sanguínea puede realizarse mediantevarias pruebas que miden el tiempo que tarda en coagular la sangre o elplasma. No sirve para el diagnóstico del déficit de un factor en particular, perosuministra una idea general sobre el estado de la vía intrínseca y de la víacomún.
Para ello existe un conjunto de principios elementales y comunes a todas las técnicas que es preciso conocer para evitar errores en las determinaciones.
Limpieza del material de vidrio
Las pipetas y los tubos de hemólisis deben estar muy limpios. Los restos de detergente o de plasma influyen sensiblemente en el análisis.
Disolución y conservación de los reactivos
Para disolver los reactivos deben emplearse agua bidestilada procurando no agitar (evitar la formación de espuma y burbujas). Cuando se emplee plasma control, el tiempo indicado por las diferentes firmas comerciales debe ser respetado.
Los reactivos que deben conservarse a unos 4 ºC se guardarán en la nevera. Si existe algún tiempo de caducidad, éste viene siempre indicado en el lote correspondiente. Asimismo, la estabilidad de los reactivos una vez disuelto se está indicada en cada una de las correspondientes metodologías de trabajo.
Antes de su empleo, los reactivos deben estabilizarse a la temperatura indicada en la normativa correspondiente.
OBTENCIÓN DEL PLASMA
A una parte de citrato trisódico estéril 0,1 mol/L se le añade nueve partes desangre (1/10). La punción debe ser directa en la vena. No debe aspirar se violentamente para evitar la formación de espuma y con ello la existencia de un cierto grado de hemólisis, lo que haría inservible el plasma para la realización de las diferentes pruebas.
Una vez extraída la sangre, se centrifuga durante 15 minutos a 3500 rpm. El plasma sobrenadante se trasvasa cuidadosamente a otro tubo de hemólisis y puede conservarse hasta cuatro horas a 4 ºC antes de su utilización
Tiempo de incubación
El tiempo de incubación del plasma con los reactivos correspondientes debe ser muy exacto y la temperatura siempre a 37 ºC. Cuando no se empleen métodos automatizados, el tiempo se medirá mediante un cronómetro, el cual debe dispararse simultáneamente con la adición del reactivo y pararse en el instante en que se inicia la coagulación.
Causas de error
En la obtención del plasma
– Estasis venosa prolongada. Favorece la fibrinólisis local. – Punción venosa inadecuada.
– Dilución errónea del plasma. Proporción de sangre-anticoagulante inexacta.
Esta proporción (una parte de citrato trisódico + nueve partes de sangre)debe mantenerse con toda exactitud.
– Tiempo de centrifugación inadecuado. – Presencia de hemólisis en el plasma.
– Conservación prolongada del plasma antes de realizar la prueba. Ello conduce a un descenso de la actividad de los factores lábiles (V y VIII) y, por tanto, el plasma debe ser analizado dentro de las dos o cuatro horas de practicada la extracción.
En la realización de la técnica – Errores de pipeteo.
– Empleo de los reactivos inadecuados o caducados. – Empleo de los reactivos mal preparados.
– Empleo de una temperatura inadecuada. – Tiempos de incubación inexactos.
– Empleo de agua no destilada. III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Tiempo de Sangría
Principio. Es definido como el tiempo que transcurre entre la producción del sangrado por la incisión estandarizada realizada en los pequeños vasos superficiales y la terminación de dicho sangrado mediante la producción del tapón plaquetario.
Técnicas: Método de Duke Materiales: - Lanceta estéril - Papel filtro - Alcohol yodado - Cronómetro Procedimiento
- Limpiar el lóbulo de la oreja con alcohol yodado sin presionar - Practicar la incisión no más de 4 mm con una lanceta
- Cada 30 segundos absorber la gota de sangre que se forma con un papel filtro, sin tocar la oreja, hasta que deje de salir sangre.
Observaciones
Si el tiempo de sangrado se prolonga examine una extensión de sangreteñida según el método de Romanowski para observar si las plaquetasson escasas.
Valores de referencia 1 a 4 minutos
Interpretación
El tiempo de sangría por este método es la mejor valoración de la funciónplaquetaria. La prolongación del tiempo en esta prueba se encuentra entrombocitopenias o las enfermedades de alteración funcional de las plaquetas,como son la enfermedad de Von Willebrand, la tromboastenia de Glasmann,el Síndrome de Bernard-Soulier, la enfermedad de Storage Pool y
otras. Midein vivo la adhesión, la agregación y la liberación plaquetaria como respuestadel organismo a la lesión vascular.
Al realizar esta prueba, debe tenerse siempre en cuenta que la ingesta previade ácido acetilsalicílico puede alterar los resultados.
3.2. Tiempo de coagulación
Principio. La sangre al ser extraída sin mayor contaminación con tromboplastina tisular es capaz de coagular cuando se deposita en un tubo de vidrio. El tiempo que tarda este proceso está en relación con el sistema de procaoagulantes e inhibidores fisiológicos y adquiridos que influyen en la formación del coágulo.
Técnicas:
Método de Burker Lámina portaobjetos Materiales - Sangre capilar - Lancetas estériles - Láminas Portaobjetos - Alcohol yodado Procedimiento
- Desinfectar el pulpejo del dedo y secarlo con algodón estéril
- Practicar la punción con lanceta descartable, eliminar la primera gota - Colocar 03 gotas de sangre en el portaobjetos y tomar el tiempo
- Cada 15 a 30 segundos examinar la formación del coágulo con la punta de la lanceta. El punto final, es la formación de un hilo de fibrina que se adhiere a la punta de la lanceta. Valores de Referencia
Burker 2 a 4 minutos
Se considera alargado el tiempo de coagulación, cuando difiere en más de 2 minutos del límite superior establecido en cada laboratorio.
Interpretación
Se observa una reducción del tiempo de coagulación después de hemorragias, esplenectomía, cardiopatía descompensada y anestesia general. Se encuentra aumentado en la afibrinogenemia, hipofibrinogenemia, hemofilia, trombocitopenia, trombocitopatía, déficit acentuado de los factores II, V y X, después del tratamiento con heparina y por hipocalcemia consecutiva a transfusiones reiteradas. También aumenta por la ingestión de anticoagulantes y tetraciclinas.
4. Recuento de Plaquetas
Principio. El contaje de plaquetas se realiza directamente en el microscopio de contraste de fases, previa lisis de los hematíes. También se pueden contar en láminas coloreadas mediante la técnica Wright.
Técnicas:
Recuento en láminas portaobjetos Técnica hemocitométrica
Toma de Muestra
Se realiza por punción venosa mediante el empleo de jeringa descartable obteniéndose 2 mL. de sangre. A continuación depositar una gota mediana de sangre s obre la lámina portaobjetos; proceder a realizar el frotis sanguíneo. Retirar la aguja de la jeringa y en seguida depositar el contenido de sangre en un frasco con EDTA de secado, tapar y rotar nuevamente la base del frasco hasta la disolución del anticoagulante.
Materiales:
- Sangre capilar o venosa - Cámara de Neubauer - Pipeta de Thoma para G. R. - Placas Petri
- Diluyente: Solución de procaína Solución de procaína: Clorhidrato de Procaína 3g. NaCl 200 mg.
Agua destilada csp 100 mL.
Conservar en frasco oscuro a 4º C.
Disolver, filtrar y guardar por refrigeración hasta por 2 semanas - Anticoagulante EDTA
Procedimiento
1. Disponer 0.38 mL. de solución de procaína en tubos de plástico de 12 x 75 mm. 2. Agregar 0.02 mL. (20 µL.) de sangre anticoagulada con EDTA.
3. Mezclar por agitación.
4. Reposo a temperatura ambiente por 15 a 20 minutos. 5. Cargar en cámara de Neubauer en ambiente húmedo. 6. Reposo a temperatura ambiente de 15 a 20 minutos.
7. realizar el recuento de 5 cuadrados grandes en el retículo de Thoma y multiplicar x 1000. Recuento en láminas portaobjetos.
Materiales:
- Aceite de inmersión. - Agua taponada. - Colorante de Wright.
Polvo colorante de wright. 2 g. Alcohol metilico. 1,000 mL.
Preparación: Colocar el colorante en un mortero al cual se va agregando pequeñas cantidades de metanol hasta disolución total.
El colorante así preparado debe dejarse madurar por lo menos 5 días. Se filtra antes de usar.
Procedimiento:
- Agregar agua taponada y controlar 9’. - Lavar con agua corriente.
- Secar.
- Echar aceite de cedro en ambos bordes de la lámina y contar el número total de 5 campos en cada borde, teniendo cuidado de que en ellos las plaquetas no estén aglomeradas.
- El recuento realizado debe multiplicarse por 1,000. Nota:
Ambos recuentos en cámara y en lámina deben guardar relación; se saca un promedio y éste es el valor que se reporta.
Valores de Referencia:
V.N: 150,000 a 400,000/ mm3
Causas más frecuentes de contaminación en las muestras
Hemólisis. Las muestras parcialmente hemolizadas contienen fragmentos del estroma de hematíes, los que producirían un recuento falsamente aumentados.
Fragmentos citoplasmáticos celulares. Como los presentes en leucemias pueden interferir en el recuento.
Valores de Referencia
150,000 a 400,000 plaquetas / mm3 Interpretación
Trombocitosis. Se denomina así al aumento de plaquetas por mm3 su importancia diagnóstica es escasa, acompaña a estados infecciosos agudos, como escarlatina, fiebre reumática, diversos tipos de septicemia, leucemia mieloide crónica, clorosis, etc.
Trombopenia. Es la disminución más o menos acentuada del número de plaquetas; posee importancia diagnóstica. Se observa en la anemia perniciosa, anemia aplástica, leucemia aguda o linfática crónica y algunas veces, al comienzo de enfermedades infecciosas agudas (tifoidea, paludismo, neumonía). Puede ser provocado por antibióticos como el cloranfenicol, la estreptomicina, analgésicos como la antipirina y el salicilato de sodio y la sulfonamida, derivados sulfamídicos, etc.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué es la hemofílica? Explique las causas que conllevan a esta patología. 2. Esquematice la megacariopoyesis.
PRÁCTICA N° 09
DETERMINACION DE UREA MÉTODO CINÉTICO OBJETIVOS
Aplicar el manejo adecuado de la técnica para la determinación de urea en una muestra biológica
Establecer los valores de referencia de la urea y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar.
Definir cuáles son las principales patologías que se presentan si tenemos valores altos o bajos de urea en una muestra biológica.
a. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE UREA EN SANGRE. FUNDAMENTO DEL MÉTODO:
La ureasa descompone especialmente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoniaco; esta reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimétricamente.
PROCEDIMIENTO:
TÉCNICA EN SUERO O PLASMA:
En tres tubos de foto colorímetro marcados B (blanco), S (Standard) y D (desconocido) colocar una o dos gotas de agua y agregar.
B S D
Standard - 20 µl
-Suero o Plasma - - 20 µl
Ureasa 1 gota 1 gota 1 gota Mezclar por agitación suave e incubar 5 minutos a 37ºC luego agregar
Reactivo 1 1 ml 1 ml 1 ml Reactivo 2 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar por agitación suave e incubar 5 minutos a 37ºC. Luego agregar. Agua destilada 10 ml 10 ml 10 ml
Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 10 minutos leer en foto colorímetro con filtro verde (510 –550 nm) o en espectrofotómetro a 540 nm, llevando a cero con el blanco.
VALORES REFERENCIALES: 0.20 –O.45 g/L.
INTERPRETACION.
Su aumento, se interpreta generalmente como una posible disfunción renal, no se deja de lado al hecho que los valores séricos de urea están relacionados con la dieta y el metabolismo proteico. c. DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE
FUNDAMENTO. La glucosa se oxida enzimáticamente por la glucosa oxidasa a ácido glucónico y agua oxigenada; agua oxigenada en presencia de peroxidasa produce la copulación oxidativa del fenol con la 4- aminoferazona (4-AF) dando lugar a la formación de un cromógeno rojo cereza con observancia máxima a 505 nm.
PROCEDIMIENTO
Entre tubos de ensayo, marcados B(Blanco) S(Estándar) y D(Desconocido). colocar.
B S D
STANDAR - 20 µL
-MUESTRA - - 20 µL
REACTIVO DE TRABAJO 2 µL 2 µL 2 µL
Incubar por 10 minutos en Baño María a 37º C, luego leer en espectrofotómetro a 505 nm. calibrando el aparato a cero con el blanco.
VALOR DE REFERENCIA En suero 0,70 –1.10 g/L. INTERPRETACION
DIABETES MELLITUS: Síndrome caracterizado por una secreción anormal de insulina, que se refleja en una tendencia a la hiperglicemia, asociado con glucosuria.
d. DETERMINACIÓN DE CREATITINA FUNDAMENTO DEL METODO
La creatinina y otros compuestos de la muestra reaccionan con ácido pícrico en medio alcalino dando un complejo coloreado, rojo que se cuantifica mediante lectura fotométrica.
La determinación de creatinina puede llevarse a cabo por medio de una técnica de punto final, o por una técnica cinética eliminándose en ambas el color que se debe a los cromógenos no creatinina.
En el primer caso, la adición de ácido o al medio, destruye el picrato de creatinina pero no el color formado por los de más compuestos. Por lo tanto la diferencia entre la lectura fotométrica antes y después del agregado de ácido, permite cuantificar la creatinina en forma específica.
En la técnica cinética, los cromógenos no creatinina, reaccionan dentro de los primeros 302 de iniciada la reacción, que se comporta como cinética de primer orden para la creatinina. De manera dentro de los 30” y los 5 segundos posteriores al inicio de la reacción, el incremento de color se
debe exclusivamente a la creatinina. LA CREATININA DIRECTA
Elimina la interferencia dada por proteínas, mediante el empleo de un bloqueador de sitios reactivos (La 5 –Dimetil Animo Naftalen Sulfonamida o DANS) determinando creatinina en forma
PROCEDIMIENTO
En tres tubos de ensayo marcados B(blanco), S (standard) y D (desconocido), colocar.
B S D(suero) Desproteinizado --- --- 3 ml Estándar --- 0.5 ml ---Agua destilada 1 ml 0.5 ml ---Reactivo 1 2 ml 2 ml ---Reactivo 2 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Se mezcló por inversión, se incubó 20 minutos a temperatura ambiente. Luego leer en fotocolorímetro con filtro verde (500 a 540 nm.), se llevó a cero el aparato con agua destilada. Reactivos:
Reactivo 1 : ácido pícrico 41.4 mol/L
Reactivo 2 : buffer glicina/NaOH 1mol/L, PHfinal 12.4 Reactivo 3 : solución de creatinina 20mg/L
Cálculos:
Creatinina en suero (mg/L) = D x F; F=20mg/L
Valores de Referencia:
Creatinina: 0.8 –1.4mg/100mL.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué es el estándar y cuál es su aplicación?
2. ¿Qué pruebas bioquímicas se realizan para diagnosticar enfermedades hepáticas, cardiovasculares, metabólicas y pancreáticas?
