BLOQUE 2: ESTUDIO DEL EFECTO DE PALIPERIDONA EN UN MODELO DE NEUROINFLAMACIÓN INDUCIDO POR ESTRÉS.

La exposición a estrés físico/psicosocial es un factor de riesgo importante para el desarrollo de la enfermedad psiquiátrica (Stahl, 2010). Brevemente, el estrés desencadena una respuesta neuroinflamatoria en donde convergen diversos

mecanismos, comenzando por la activación del eje hipotalámico hipofisiario adrenal (eje HHA). La posterior liberación de glucocorticoides y catecolaminas influirán en la actividad de las células del sistema inmune, estimulando la secreción de citoquinas proinflamatorias. De igual manera, el glutamato liberado durante el estrés, induce la secreción de citoquinas proinflamatorias, y la posterior activación de la vía del NFkB. Por otro lado, el estrés es capaz de activar la vía del TLR4, generando mayor inflamación.

Un modelo animal ampliamente usado en el estudio de patologías asociadas a estrés es el de movilidad restringida (“restraint stress”), consiste en inmovilizar a los animales introduciéndolos en conos de plástico tipo Decapicone® (Braintree, MA. EEUU), con forma de cono truncado que se ajusta al cuerpo de la rata, impidiendo el movimiento de las extremidades y de la cabeza, pero sin alterar la respiración ni impidiendo el movimiento de la cola (Magariños et al., 1997; Leza et al., 1998).

En este bloque de experimentos empleamos el modelo de movilidad restringida para el estudio del efecto de Paliperidona bajo condiciones neuroinflamatorias. Este modelo es agudo, inescapable debido a que el animal no puede evitar la exposición al agente estresante, impredecible debido a que no puede anticipar la aparición ni la duración del estrés y mixto físico-psicológico debido a la doble naturaleza del estímulo. Además es un modelo fácil de repetir y que se puede cronificar (Poland et al., 1999). Cuando el modelo pasa a ser crónico (restricción del movimiento por seis horas al día, durante 21 días), el modelo puede clasificarse como inescapable, predecible y mixto físico-psicológico.

Por último, es un modelo que se ha utilizado tradicionalmente en nuestro grupo de investigación, de manera que existe un elevado dominio de la técnica y gran cantidad de resultados previos (García-Bueno et al., 2008a; Gárate et al., 2014).

Tras el periodo de habituación la inmovilización se inició a las 09.00 horas para evitar la influencia de los niveles bajos de cortisol. El estrés duró seis horas durante un único día en el caso del modelo agudo, y se repitió durante 21 días en el caso del modelo crónico.

Para la realización de este segundo bloque de experimentos, se utilizó como herramienta farmacológica PALI a una dosis de 1mg/kg (P1). Todas las administraciones se realizaron por vía oral.

Para evaluar los efectos de PALI sobre el modelo neuroinflamatorio agudo inducido por estrés, se separaron aleatoriamente los animales en 4 grupos (Fig.20). El primer grupo recibió el vehículo (n=5), al segundo grupo se le administró PALI a una dosis de 1mg/kg(P1, n=5), el tercer grupo corresponde al modelo neuroinflamatorio per

se, el cual recibió el vehículo y fue sometido al protocolo de estrés durante seis horas

(n=5), al cuarto grupo se le administró PALI 1mg/kg y fue sometido al mismo protocolo de estrés (n=5). Los animales no sometidos a estrés fueron manipulados brevemente (sacando al animal de la jaula y volviendo a introducirlo en ella), y se les privó de alimento y agua durante el tiempo de experimentación para que todos los animales estuviesen bajo las mismas condiciones experimentales.

Figura 20. Diseño experimental de los efectos de Paliperidona en un modelo neuroinflamatorio

agudo inducido por estrés. Veh: vehículo; P1: Paliperidona 1mg/kg; APS: antipsicótico; PFC: corteza

prefrontal; PBMC: células mononucleares de sangre periférica.

De igual manera, para evaluar los efectos de PALI sobre el modelo neuroinflamatorio crónico inducido por estrés se realizó el siguiente diseño experimental (Fig.21), se separaron aleatoriamente los animales en 4 grupos. El primer grupo recibió el vehículo (n=6), al segundo grupo se le administró PALI a una dosis de 1mg/kg (P1, n=6), el tercer grupo corresponde al modelo neuroinflamatorio per se, el cual recibió el vehículo y fue sometido al protocolo de estrés durante seis horas (n=7), al cuarto grupo se le administró PALI 1mg/kg y fue sometido al mismo protocolo de

estrés (n=7). Los animales a los que no se les sometió al protocolo de estrés fueron manipulados brevemente, y se les privó de alimento y agua durante el tiempo de experimentación.

Figura 21. Diseño experimental de los efectos de Paliperidona en un modelo neuroinflamatorio

crónico inducido por estrés. Veh: vehículo; P1:Paliperidona 1mg/kg; APS: antipsicótico; PFC: corteza

prefrontal; PBMC: células mononucleares de sangre periférica.

En este segundo bloque de experimentos se realizaron las mismas determinaciones proinflamatorias/antiinflamatorias que en el primer bloque, tanto a nivel de PFC como a nivel periférico.

Por otro lado, también se evaluó en PFC la activación inmune a través de la vía de señalización del TLR4 mediante los niveles de mRNA y proteicos de sus principales proteínas. En este mismo ámbito se estudió la presencia de señales activadoras de la vía del TLR4 como el LPS mediante ELISA y de algunos DAMPs como HSP60/70 y HMGB1 mediante sus niveles de mRNA y proteicos; de igual manera se evaluó el estado inflamatorio intestinal mediante los niveles proteicos de las enzimas proinflamatorias inducibles iNOS y COX-2, y el primer mecanismo de defensa con que cuenta la barrera intestinal, para lo cual se midió los niveles de IgA presentes en el intestino por ELISA, y los niveles proteicos de la quimioquina CCL28 por Western Blot.

Siguiendo con el desequilibrio inflamatorio presente en el modelo animal y pretendiendo ahondar en las posibles propiedades antiinflamatorias del fármaco se procedió a estudiar una batería de citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias mediante ELISA o sus niveles de mRNA. Se ha observado que según las citoquinas presentes en el ambiente, las macrófagos pueden desarrollar un perfil proinflamatorio

o antiinflamatorio, es por ello que en este apartado estudiamos algunos marcadores microgliales antiinflamatorios como ArgI y FOLR2 mediante RT-PCR, Western Blot e inmunofluorescencia. De igual manera evaluamos la vía antioxidante del NRF2 mediante los niveles de mRNA y proteicos de sus principales elementos, al igual que de sus principales productos mediante RT-PCR.

Finalmente, dado el papel homeostático que juega el sistema endocannabinoide, se procedió a su estudio mediante los niveles de mRNA y proteicos de sus principales receptores CB1 y CB2, al igual que de algunos receptores alternativos como PPARα, TRPV1 y GPR55. De igual manera, se estudió las principales enzimas participantes en el metabolismo de los endocannabinoides AEA y 2-AG.

1.1.3. BLOQUE 3: ESTUDIO DEL EFECTO DE PALIPERIDONA EN UN MODELO DE