TÉCNICAS EXPERIMENTALES.

4.1 OBTENCIÓN DE HOMOGENIZADO TOTAL.

Los segmentos de PFC destinados a la realización de homogenizado total fueron sonicados (Digital Sonifier, Branson) en 400µl de cóctel de homogenización formado por tampón PBS pH 7,4 con inhibidores de proteasas (Complete® Proteasa Inhibitor Mixture, Roche Diagnostics, Alemania). En el caso del colon, los trozos fueron homogenizados por el procedimiento mecánico de vidrio-teflón en la misma solución que los PFCs. Los homogenizados resultantes fueron centrifugados a 12000g por 10 minutos a 4°C, se recogieron los sobrenadantes para determinar el contenido proteico mediante el método de Bradford y se almacenaron para futuros experimentos de western blots.

4.2 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS NUCLEARES Y CITOSÓLICOS.

La extracción se realizó según el método de Schreiber (1989) con algunas modificaciones. Los trozos de PFC aislados para esta finalidad se homogenizaron con 300µl de tampón de lisis consistente en: HEPES 10mmol/L a pH 7,9, con cóctel de inhibidores de proteasas (Roche), EDTA (1mM), EGTA (1mM), KCl (10mM), NaF (5mM), NaVO4 (1mM), sacarosa (0.5M) y Na2MoO4 (10mM). Las muestras se incubaron en hielo durante 15 minutos y se añadió el detergente Nonidet P-40 (Roche, Alemania) a una concentración de 0,5%. Los tubos fueron agitados durante 30 segundos y la mezcla se centrifugó a 8000g durante 10 minutos. Se aspiró el sobrenadante que constituye la “fracción citosólica”, por otro lado el pellet resultante se resuspendió en 80µl de tampón suplementado con glicerol al 20% y KCL 0.4M, se agitaron durante 30 minutos a 4°C y posteriormente se centrifugó a 12000g para recoger el sobrenadante y obtener la “fracción nuclear”. Ambas fracciones se almacenaron a -80°C para futuros estudios.

Para la extracción de núcleos y citosoles desde PBMC se siguió el mismo protocolo, pero con la salvedad de que los volúmenes de los tampones utilizados fue menor. Para la extracción de la fracción citosólica se utilizaron 150 µl de tampón de lisis, y posteriormente 50 µl del tampón de extracción para la obtención de la fracción nuclear.

4.3 CUANTIFICACIÓN PROTEICA.

Las muestras utilizadas en los protocolos de Western Blot, cuantificación de Malondialdehído, cuantificación de nitritos y determinaciones en tejido mediante ELISAS fueron previamente cuantificadas para conocer su contenido proteico.

Para ello se siguió el método de Bradford©, el cual se basa en la capacidad de las proteínas de unirse a determinados colorantes. En este caso el colorante azul brillante G-250 coomasie en presencia de ácido fosfórico se adhiere a la proteína, tornándose en otro color que puede ir desde marrón claro a azul intenso, cuya máxima absorción se mide a los 570-590 nm y es proporcional a la concentración de proteína en la muestra. Como curva patrón se utilizaron concentraciones conocidas de albúmina sérica bovina con siete puntos entre 0 y 0,8mg/ml. Para las mediciones se diluyeron las muestras, en el caso del homogenizado total se diluyó 1/80, para los extractos provenientes de tejidos la dilución fue 1/40 y 1/20 para los provenientes de PBMC. Se mezclaron 10 µl de la dilución o estándar con 200 µl del reactivo de Bradford y se midió la absorbancia con un lector de placas (Synergy 2, BioTek, Alemania).

4.4 WESTERN BLOT (WB).

Los homogenizados y extractos citosólicos/nucleares de las distintas muestras fueron ajustados según su contenido proteico a 2 µg/µl, y se mezclaron con igual volumen de tampón de carga (Laemmli© Buffer con 5% de β-mercaptoetanol), alcanzando una concentración final de 1 µg/µl.

En los geles de electroforesis de SDS-poliacrilamida de porcentaje variable (según el peso molecular de la proteína a estudiar) y 1.5mm de grosor, se cargaron entre 10 y 20 µg de muestra según la proteína a estudiar. La electroforesis se realizó a 100 voltios hasta la completa migración de las proteínas en un sistema Mini-Protean® _{Tetra Cell} (BioRad, España). Los geles se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Amersham, GE Healthcare, España) por transferencia semiseca a 24mA (Trans-Blot® Semi-Dry Transfer Cell, BioRad, España) durante 30 a 120 minutos según el peso molecular de la proteína y la cantidad de geles a transferir. En ocasiones se usaron para la transferencia packs comerciales de membranas de nitrocelulosa con un poro de

0.2µm, Transfer Packs y se realizó una transferencia semiseca rápida de 3 a 10 minutos usando el sistema Trans-Blot® Turbo™ (BioRad, España). Las membranas fueron bloqueadas con albúmina sérica bovina (BSA; Merck) al 5% en TBS-tween o leche desnatada al 5% en TBS-tween durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente se incubaron con el anticuerpo primario durante toda la noche a 4°C bajo condiciones específicas para cada proteína resumidas en la tabla 1. Luego de tres lavados de 10 minutos cada uno con TBS-tween, las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios específicos durante 90 minutos (tabla 2). Antes de proceder al revelado de las bandas se lavó nuevamente tres veces con TBS-tween durante 10 minutos cada uno.

Las bandas proteicas reconocidas por los anticuerpos se revelaron mediante un kit ECL Plus© de quimioluminiscencia (Amersham, Suecia) y visualizadas en películas de rayos X o bien mediante el detector Odyssey® FC (Licor, Alemania). Las imágenes obtenidas por ambos métodos se cuantificaron mediante la densitometría de las bandas (Image J, NIH, EEUU).

Como control de carga se utilizaron las proteínas β-actina para los homogenizados totales y los extractos citosólicos, y por otro lado, GAPDH y HDAC1 para los extractos nucleares.

Proteína

(peso kDa) Tipo de muestra Acrilamida

Anticuerpo 1° (dilución) Anticuerpo 2°(dilución) TLR-4 (89 kDa) Homogenizado PFC 8% sc-16240 (1:750 BSA 1%) α-Goat (1:4000) MD-2 (20 kDa) Homogenizado PFC 14% sc-20668 (1:500 BSA 2,5%) α-Rabbit (1:2000) MyD88 (35 kDa) Homogenizado PFC 8% ab2064 (1:750 BSA 5%) α-Rabbit (1:2000) IκBα (36 kDa) Extracto Citoplasmático 8% sc-371 (1:1000) α-Rabbit (1:2000) NFκB

(65 kDa) Extracto Nuclear 8%

sc-372 (1:1000) α-Rabbit (1:2000) COX-2 (72 kDa) Homogenizado PFC/Colon 8% sc-1747 (1:750 BSA 2,5%) α-Goat (1:4000) mPGES1 (16 kDa) Homogenizado PFC 14% CAY 10004350 (1:1000 BSA 1%) α-mouse (1:2000) iNOS (130 kDa) Homogenizado PFC/Colon 8% sc-650/ sc-651 (1:750 BSA 1%) α-Rabbit (1:2000) CCL28

(15 kDa) Homogenizado Colon 14%

R&D AF533 (1:500 BSA 2,5%) α-Goat (1:4000) HSP60 (60 kDa) Homogenizado PFC 8% sc-13966 (1:1000) α-Rabbit (1:2000)

HSP70