La validación del método es crítica tanto para los laboratorios como para las autoridades de control. Lo ideal es que un número limitado de laboratorios capacitados verifique las características de cada método en cuanto a su capacidad de dar resultados reproducibles, sensibles y específicos. El Centro Común de Investigación de la Comisión Europea fue el primero en validar los métodos ELISA y PCR para materias primas constituidas por soja Roundup Ready y un método PCR para maíz Maximizer (Bt-176), así como un método PCR tanto para soja Roundup Ready como para maíz Maximizer (Bt-176) en fracciones de alimentos transformados (Lipp et al., 1999, 2000 y 2001). Después se han desarrollado y validado algunos otros métodos de análisis tanto cuali como cuantitativo. Para obtener mas información sobre los métodos validados de detección y cuantificación de OGM en la dirección: http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm La preparación de las muestras, tanto si se aplican métodos de ADN como de proteínas, es crítica para la detección y la cuantificación. Es importante saber las limitaciones de cada procedimiento en función del aspecto que interese (p. ej., análisis cuali o cuantitativo). Tanto el tamaño de la muestra como los procedimientos de muestreo influyen muchísimo en las conclusiones que puedan extraerse de estos métodos de ensayo.
Los dos tipos de métodos dependen fundamentalmente de la disponibilidad de
materiales de referencia certificados que sean adecuados. Las muestras
utilizadas en el curso son materiales de referencia certificados producidos en el IRMM del CCI (Trapmann et al., 2002 y 2001). Las características y los certificados correspondientes se presentan en la sesión nº 3. Otra fase crítica, que debe mencionarse aunque no se va a efectuar durante el curso, es la homogeneización
de la muestra.
La figura 1 resume las distintas fases efectuadas durante el curso. Es fundamental optimizar la extracción del ADN para garantizar la presencia y calidad del ADN extraído y amplificable por PCR. Este aspecto es particularmente importante, ya que la mayoría de los productos alimentarios comercializados a base de soja o maíz están muy transformados. Es bien sabido que el ADN puede degradarse considerablemente durante la transformación de los alimentos, sobre todo por tratamiento térmico en presencia de agua. Por tanto, a medida que se transforman más los alimentos, puede disminuir el número de fragmentos de ADN que siguen siendo suficientemente largos y conteniendo intacta la secuencia de interés para permitir la detección de la presencia de OGM en alimentos transformados. Además,
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Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 2
un método verdaderamente adecuado de extracción del ADN debe conseguir la eliminación de las sustancias inhibidoras que pueda haber en la muestra. Este tema se tratará en la sesión nº 4. Se han elaborado diversos métodos de extracción de ADN y son muchas las empresas comerciales que producen kits especializados listos para usarse. Durante el curso se hablará sobre las características y la validez de los diferentes protocolos disponibles. Sin embargo, para evitar la implicación directa de empresas comerciales, se ha decidido efectuar la extracción del ADN con el denominado método CTAB, protocolo validado y versátil que ha demostrado su idoneidad para varias matrices diferentes.
Tras la extracción del ADN, las muestras (así como los productos de la PCR) se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa (sesión nº 5).
En la sesión nº 6 se presentan los principios, ventajas y desventajas de la reacción
en cadena de la polimerasa.
Como ya se ha indicado, la utilización eficaz de las técnicas modernas para la detección de OGM depende de la disponibilidad de información exacta. La detección de OGM exige el conocimiento al menos parcial de la secuencia del gen diana y del tipo de modificación genética. En la sesión nº 7 se presentan las características específicas de las líneas transgénicas de maíz MON810, maíz Bt-176 y soja Roundup Ready.
Se han elaborado distintos planteamientos de PCR para la detección de los OGM autorizados. La especificidad de la PCR depende de la selección exacta de los cebadores. Los cebadores de la PCR pueden dirigirse a diferentes elementos utilizados en el proceso de transformación. Pueden obtenerse sistemas de detección de PCR de «banda ancha», denominados generalmente «métodos de cribado», diseñando cebadores específicos de las secuencias más comunes utilizadas en la transformación. Se trata generalmente de las secuencias reguladoras (promotor y terminador). Los vegetales modificados genéticamente pueden dividirse también en «categorías» según el gen estructural introducido. Otra forma más de dirigir la especificidad de la reacción es elegir unos cebadores específicos de las secuencias de ADN localizadas en distintos elementos genéticos (p. ej., promotor-gen estructural, gen estructural-terminador). Finalmente, siempre que se disponga de información específica y completa sobre la secuencia, a fin de obtener métodos realmente específicos de un determinado vegetal modificado genéticamente, pueden elaborarse sistemas «con especificidad de línea» (específicos de una transformación) seleccionando una combinación «única» de secuencias, presente tan solo en esa línea transformada concreta. Esto se consigue generalmente diseñando cebadores con hibridación en la región del ADN en la que se incluye el
Presentación del Manual, Métodos de Trabajo e Introducción del Curso 9
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 2
empalme del sitio de integración. El empalme entre el ADN insertado (ADN-T) y el ADN hospedador ofrece una secuencia nucleotídica única que constituye una diana ideal para un ensayo muy específico por PCR. Los métodos realizados durante el curso se resumen en la figura 1, y se describen con detalle en la sesión nº 8. La parte experimental de los métodos y protocolos se encuentra en la sesión nº 9. Como se indica anteriormente, la necesidad de cuantificar el OGM presente en una muestra hizo que se elaboraran muchos protocolos basados en la PCR, los cuales permiten no solo una respuesta cualitativa (presencia / ausencia), sino también una indicación, más o menos precisa (según el método elegido) de la cantidad relativa del OGM presente en una muestra determinada. Los dos planteamientos de ADN más comunes son la PCR competitiva y la PCR en tiempo real (sesión nº 10). La PCR en tiempo real se efectúa utilizando una instrumentación específica y compleja, que por ahora solo puede adquirirse en unas pocas empresas comerciales. En la sesión nº 11 se indican los protocolos que se van a seguir durante el curso.
Finalmente, la sesión nº 12 contiene una introducción general al planteamiento serológico de la detección de organismos genéticamente modificados. En concreto se explicará la técnica ELISA y se proporcionará el protocolo para efectuar un ensayo ELISA específico de Roundup Ready.
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Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 2 No se efectuará durante el curso
Materias primas y transformadas
PCR-lectina para soja y PCR-zeína para maíz ADN vegetal presente Sin ADN vegetal detectable
Detección de elementos reguladores (promotor 35S y terminador nos)
Vegetal GM Vegetal no GM
Figura 1. Diagrama de flujo de los métodos utilizados durante el curso.
Extracción del ADN
Comprobación de la presencia de ADN vegetal por PCR
+
PCR de cribado Homogeneización de la muestra-
+
-
Detección de OGM específicos por PCR anidada Cuantificación del OGM mediante PCR en tiempo real Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría Detección de OGM mediante ELISAPresentación del Manual, Métodos de Trabajo e Introducción del Curso 11
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 2
Bibliografía
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(https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/atta chements/ERM-BF410_report.pdf) (Último acceso enero de 2010)
Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G. N., Schimmel, H., Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede, G. y Anklam, E. (2001). The certification of reference materials of dry mixed maize powder with different mass fractions of MON810 maize. Certified Reference Materials IRMM-413. (https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/atta chements/ERM-BF413_report.pdf). (Último acceso enero de 2010)
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