El enfoque del ADN
Cada vez se utilizan más los métodos analíticos basados en la técnica de la PCR para la detección de secuencias de ADN asociadas con OGM.
La PCR permite la amplificación selectiva de segmentos específicos de ADN presentes con baja frecuencia en una mezcla compleja con otras secuencias de ADN. En la PCR, los pequeños fragmentos de ADN complementario se llaman cebadores y se utilizan por pares. Estos cebadores se diseñan para hibridarse con sitios de reconocimiento de la secuencia complementaria en hebras opuestas del gen de interés. A través de una serie de ciclos térmicos diferenciales repetitivos, una enzima ADN polimerasa ayuda a la replicación y a la amplificación exponencial de la secuencia situada entre el par de cebadores. Finalmente, estos fragmentos amplificados se someten a electroforesis en gel normal para poder detectar su presencia en función de la determinación de su tamaño.
Se han desarrollado muchos métodos basados en esta PCR que pueden detectar y cuantificar los OGM presentes en plantas agrícolas utilizadas como alimentos y piensos. Por otra parte, la determinación de la identidad genética permite la segregación y la trazabilidad (preservación de la identidad) a lo largo de la cadena de distribución de las plantas GM.
Un requisito previo fundamental de la detección de OGM es el conocimiento del tipo de modificación genética, incluida la conformación molecular del gen introducido y los elementos reguladores (promotores y terminadores) que lo flanqueen. Para el análisis es necesario disponer de una cantidad mínima de material de muestra con ADN intacto, incluido el gen diana.
La PCR es una técnica de laboratorio cuya realización exige personal formado y material especializado.
A continuación se indican algunas de las características clave del diagnóstico por PCR:
- Puede ser extremadamente sensible, capaz de detectar la presencia de unos pocos ejemplares (e incluso de un solo ejemplar) de un gen o secuencia diana de interés dentro de todo el material genético de un organismo (genoma). Como resultado de esta elevada sensibilidad, pueden obtenerse falsos positivos con niveles muy bajos de contaminación accidental. Por tanto, ha de extremarse la atención para evitar la contaminación cruzada.
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Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 2
- Exige poco tiempo de elaboración de los reactivos comparando con los ensayos inmunológicos (síntesis de cebador frente a producción de anticuerpos).
- Casi todos los reactivos necesarios están disponibles en el comercio y pueden obtenerse fácilmente de varias fuentes. Sin embargo, hace falta una autorización para utilizar algunos de ellos en actividades de diagnóstico comerciales.
- El análisis de las muestras lleva un día aproximadamente.
- La PCR puede discriminar entre diferentes tipos de modificación genética (también denominados productos transgénicos) si se efectúa adecuadamente. Los métodos de diagnóstico para identificar productos transgénicos específicos necesitan más tiempo de elaboración y actividades de validación.
El enfoque de las proteínas
El método de ensayo de proteínas utiliza anticuerpos específicos de la proteína de interés. La técnica ELISA detecta o mide la cantidad de proteína de interés en una muestra que puede contener otras muchas proteínas diferentes. Utiliza un anticuerpo para ligar la proteína específica, un segundo anticuerpo para amplificar la detección (fase optativa) y un conjugado de anticuerpo con una enzima, cuyo producto genera una reacción coloreada, que es fácil de observar y cuantificar comparando con una curva patrón de la proteína de interés.
Para la ejecución adecuada del ensayo hace falta también personal formado y material especializado.
Entre las características fundamentales de los ensayos con ELISA están las siguientes:
- Menor sensibilidad que la PCR, por lo que es más difícil que aparezcan «falsos positivos» debidos a pequeños niveles de contaminación.
- Elevados costes iniciales para el desarrollo del ensayo y la obtención de anticuerpos y patrones de proteínas.
- Reducidos costes por muestra, una vez elaborados los reactivos.
- No puede discriminar entre diferentes modos y modelos de expresión de diferentes productos transgénicos que expresan características proteínicas similares.
- Los métodos de proteínas exigen un notable tiempo de preparación de los reactivos y del método.
- Los métodos de ensayo de proteínas son prácticos y eficaces cuando se produce una proteína detectable. Sin embargo, es posible que los productos modificados genéticamente se formen solo durante ciertas fases del desarrollo o en determinadas partes de los vegetales, por lo que resultaría poco probable que tales productos fueran detectados sin problemas por la técnica ELISA. Por otra parte, las
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transformaciones industriales desnaturalizan fácilmente las proteínas, lo que plantea dificultades para el uso de métodos ELISA con fracciones de alimentos transformados.
Teniendo todo esto en cuenta, ha de quedar claro que el ELISA y la PCR deben considerarse mutuamente complementarios y no se excluyen entre sí.
Cuadro 2. Comparación resumida de los métodos ELISA y PCR
Método Objeto Duración Facilidad de
utilización
Resultados ELISA Proteínas 2 - 8 horas Moderada; exige
conocimiento de las prácticas de laboratorio; los ensayos son
específicos de especie y de variedad. Confirma una modificación genética específica y permite la cuantificación.
PCR ADN 1 – 3 días Escasa; requiere formación y material especializados.
Muy sensible; tiende a dar falsos positivos; confirma la presencia de ADN GM y permite la cuantificación.
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