Como ya se ha visto en secciones anteriores, la utilización de la PCR está muy difundida porque se trata de una técnica potente de análisis y preparación. No obstante, dada la naturaleza de este procedimiento, es posible que cantidades traza de ADN contaminante sirvan de ADN molde, lo que provocaría la amplificación de un ácido nucleico distinto del diana (falsos positivos). Así pues, resulta fundamental realizar la amplificación por PCR en un entorno libre de ADN. El riesgo de contaminación se reduce si se dispone de zonas de trabajo físicamente separadas y dotadas de su propio material. El requisito previo más importante para reducir al mínimo la tasa de falsos resultados positivos es el cumplimiento estricto de las normas de descontaminación (descontaminación de ácidos nucleicos, prevención de la formación de aerosoles, etc.). La contaminación de la PCR puede deberse a fuentes diversas, como las siguientes:
• mesas de laboratorio, equipos y pipetas, que pueden estar contaminados con preparados anteriores de ADN, o con fragmentos de restricción purificados; • contaminación cruzada entre muestras;
• productos de amplificaciones anteriores por PCR.
Esta sección recoge algunas recomendaciones, con el fin de definir los requisitos normales para el establecimiento y mantenimiento de un entorno limpio para cualquier sistema de ensayo con PCR, independientemente del número de muestras tratadas (Roth et al., 1997).
Métodos físicos de prevención
Instalaciones de los laboratorios. Para evitar la contaminación, debe disponerse
de zonas de trabajo separadas físicamente de la forma siguiente: 1. Zona de preparación de muestras
Esta sala consiste de una zona en que se efectúan todas las fases previas a la amplificación del ADN molde (p. ej., aislamiento y purificación del ADN).
2. Sala de disposición de la PCR
Esta sala «limpia» se dedica a los procesos de preparación de la PCR en sí (p. ej., mezcla maestra, diluciones de cebadores, etc.).
3. Zona post-PCR
Esta zona se reserva a la amplificación de la secuencia del ADN diana, y a la detección y análisis de los productos de la PCR.
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Por otra parte, han de seguirse las normas generales siguientes:
• Todas las salas deben contener su propio material (batas, guantes, reactivos y suministros).
• Los reactivos y demás material deben etiquetarse con el nombre del contenido y la fecha de preparación.
• Ha de utilizarse un sistema de flujo unidireccional, es decir, nunca se han de trasladar materiales, muestras ni equipos de las zonas post-PCR a lugares pre- PCR.
• Deben utilizarse tubos de reacción para PCR desechables, libres de desoxirribonucleasa y de ribonucleasa.
• Han de utilizarse puntas de pipeta especiales, que impidan la formación de aerosoles, y los juegos de pipetas serán exclusivos (se utilizarán solo para la PCR) y, de preferencia, del tipo de desplazamiento positivo.
• Siempre que sea posible, prepárese la PCR en una campana extractora dotada de luz UV. En la campana extractora hay de poner una microcentrifuga y guantes desechables que se utilizarán exclusivamente para la PCR.
• Las mesas y estantes se lavarán periódicamente con lejía al 10 %, seguida de etanol al 70 %.
Manipulación de las muestras
• Utilícense técnicas estériles y llévense puestos guantes recientes siempre que se trabaje en las zonas antes descritas. Hay que cambiarse de guantes con frecuencia, sobre todo si se sospecha que se han contaminado con soluciones que contengan ADN molde.
• Para preparar los reactivos de la PCR y el ADN molde han de utilizarse siempre materiales de vidrio, de plástico y pipetas nuevos o esterilizados.
• Pasar por autoclave todos los reactivos y soluciones que puedan sufrir este tratamiento sin que se vean afectadas sus propiedades. Por supuesto, no deben pasar por autoclave los cebadores, los dNTP ni la ADN Taq polimerasa.
• Debe disponerse de un conjunto propio de reactivos y soluciones de PCR que solo se utilizarán con este fin, y dichos reactivos se almacenarán en pequeñas cantidades.
• Cuando se pipetea el ADN, ha de evitarse la formación de aerosoles que puedan transportar contaminantes.
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• Siempre han de efectuarse reacciones de control, como por ejemplo un control negativo («sin ADN»), que contenga todos los componentes de la reacción excepto el ADN molde, y un control positivo que se haya utilizado con éxito en PCR anteriores.
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Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 Métodos bioquímicos de prevención
Uracil-ADN glucosilasa. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede
amplificar una sola molécula más de mil millones de veces. Así, es posible amplificar una cantidad incluso minúscula de un contaminante, lo que daría lugar a un falso positivo. Tales contaminantes suelen ser productos de anteriores amplificaciones por PCR (contaminación por arrastre). Por tanto, se han elaborado métodos para evitar esta contaminación.
Una estrategia frecuente es sustituir el dTTP por dUTP durante la amplificación por la PCR, para formar ADN que contenga uracilo (U-ADN) (Longo et al., 1990). El U- ADN contaminante de la muestra se eliminará tratando las mezclas de PCR posteriores con uracil-ADN glucosilasa (UNG) antes de la amplificación por PCR y descomponiendo después los polinucleótidos pirimidínicos a temperatura elevada (95 ºC) en condiciones alcalinas (durante la fase de desnaturalización inicial) (véase la figura 8).
Figura 8. Reacción de la uracil-ADN glucosilasa.
Por supuesto, este método exige que todas las PCR del laboratorio se realicen con dUTP en lugar de con dTTP.
Ha de tenerse en cuenta lo siguiente cuando se utilicen productos de PCR que contengan dU en aplicaciones posteriores:
A=Adenina U=Uracilo G=Guanina Calor ─► pH alcalino Uracil- ADN ─► Glucosilasa
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• los productos de PCR que contienen dU funcionan tan bien como los que contienen dT cuando se utilizan como dianas de hibridación o como ADN moldes para la técnica del didesoxi;
• los productos de PCR que contienen dU pueden clonarse directamente si se transforman en hospedadores bacterianos UNG-;
• un sustrato que contenga dU es digerido fácilmente por ciertas enzimas de restricción comunes (p. ej., EcoR I y BamH I), mientras que otras (p. ej., Hpa I, Hind II, Hind III) presentan una actividad reducida sobre estos sustratos;
• no se recomienda utilizar ADN con dU en estudios sobre la unión a proteínas ni sobre la interacción del ADN con proteínas.
Desoxirribonucleasa I, exonucleasa III. Otros métodos bioquímicos se basan en el
tratamiento del ADN contaminado con desoxirribonucleasa I, exonucleasa III o con una enzima de restricción que contenga una secuencia de reconocimiento dentro del ADN diana. Sin embargo, dadas las condiciones desfavorables en que debe efectuarse la reacción, estas enzimas presentan el inconveniente de reducir la eficacia de la amplificación por PCR.
Preparación de la mezcla para la PCR (mezcla maestra)
Los reactivos fundamentales para la PCR son agua, el tampón de reacción, una ADN polimerasa termoestable, cebadores oligonucleotídicos, desoxinucleótidos (dNTP) y ADN molde (diana), así como iones de magnesio (Mg2+). En general, todos
los reactivos (excepto el ADN molde) se mezclan en un solo tubo, con un volumen suficiente según el número de reacciones que se vaya a realizar (mezcla maestra). La mezcla maestra se reparte a continuación en alícuotas en varios tubos y se añade el ADN molde. El uso de una solución maestra reduce el riesgo de contaminación y mejora el rendimiento de la PCR por los motivos siguientes:
• se garantiza una calidad uniforme de la solución respecto a todos los reactivos para una serie de análisis;
• disminuye el riesgo de contaminación de la solución original y de las resultantes; • pueden pipetearse volúmenes mayores;
• hay menos etapas de pipeteado, con lo que se ahorra tiempo.
El éxito en la amplificación de la región de interés depende de la cantidad y de la calidad del ADN molde. La cantidad de ADN molde necesaria es función de la complejidad de la muestra de ADN. Teniendo en cuenta que el tamaño del genoma
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nuclear varía según los organismos, la concentración de ADN debe mantenerse constante (generalmente 10 ng/µl). El cuadro 3 muestra una comparación del tamaño del genoma de varias especies vegetales utilizadas con frecuencia en la transformación vegetal, así como el número correspondiente de ejemplares de genoma en una cantidad definida de ADN.
Cuadro 3. Comparación del tamaño del genoma de varias especies vegetales y
número correspondiente de ejemplares de genoma en una cantidad definida de ADN.
Muestra Tamaño del genoma Ejemplares de genoma en 1 µg ADN Ejemplares de genoma en 1 ng ADN Maíz 5 x 109 pb 1,85 x 105 185 Soja 1,55 x 109 pb 5,98 x 105 598 Tabaco 3,8 x 109 pb 2,43 x 105 245 Arroz 4 x 108 pb 2,31 x 106 2310
Por ejemplo, en un plásmido de 4 kb con un inserto de 1 kb, la diana de interés es el 25 % del ADN aportado. A la inversa, un gen de 1 kb en el genoma del maíz (5 x 109
pb) representa alrededor del 0,00002 % del ADN aportado. Hace falta aproximadamente un millón de veces más ADN del genoma del maíz para mantener el mismo número de ejemplares de la diana por reacción. Para optimizar los resultados, deben utilizarse > 104 ejemplares de la secuencia diana como ADN molde inicial para obtener una señal al cabo de 25 o 30 ciclos. Aunque en la práctica es posible amplificar menos de 10 ejemplares de una secuencia diana, en este caso podría ser necesario un número mayor de ciclos de PCR para detectar una señal por electroforesis en gel. Los protocolos generales aplicados habitualmente consideran un número de ciclos entre 30 y 40. Debe vigilarse un aumento del número de ciclos, ya que entonces podría incrementarse la amplificación inespecífica.
Controles
Como se señalaba en la sección anterior, se encuentran fuentes posibles de contaminación por todo el laboratorio. Tanto las muestras como el personal de laboratorio, el sistema de aire acondicionado, el equipo y los reactivos pueden ser
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fuente de contaminación. Entre los agentes contaminantes pueden citarse los siguientes:
1. contaminación por arrastre de ADN diana amplificado en PCR anteriores;
2. contaminación cruzada entre muestras, lo que supone la transferencia de ADN diana de una muestra a otra;
3. ADN genómico de preparados de muestras anteriores;
4. degradación de productos por reacciones de descontaminación.
Mientras que las tres primeras formas de contaminación producen falsos positivos, el último tipo produce falsos negativos. Esta forma de contaminación, observada en primer lugar por Niederhauser y colaboradores en 1994, provoca la inhibición de las PCR (Niederhauser et al., 1994). De hecho, la descontaminación con el método UNG favorece la formación de complejos con los cebadores.
Para obtener resultados fiables, con las PCR siempre hay que utilizar controles tanto positivos como negativos. El cuadro 4 indica algunos de los controles más utilizados para garantizar el resultado de los procedimientos de amplificación de ácido nucleico.
Cuadro 4. Controles que deben introducirse en los ensayos con PCR.
Control Método
Contaminación de los reactivos con el ADN diana
Control negativo de la PCR sin ADN molde (solo mezcla maestra)
Especificidad de la reacción Controles para detectar productos secundarios e inespecíficos
Desarrollo y sensibilidad de la reacción
Controles positivos y negativos para verificar que se cumplen las condiciones y
rendimientos buscados
Integridad de la mezcla de PCR PCR con control positivo de ADN
Controles positivos
Hay que comprobar mediante controles positivos la eficacia de la extracción y amplificación del ADN. Lo ideal es dar límites de detección en equivalentes genómicos, lo que permitiría la producción de controles de sensibilidad definidos, con pequeños números de ejemplares. Como norma, debe disponerse de un
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preparado de referencia que contenga una concentración conocida del ADN diana estudiado.
Controles negativos
Puede darse contaminación (arrastre de productos amplificados o ácidos nucleicos) durante el aislamiento y la purificación del ADN diana, así como durante la preparación de la mezcla de reacción para la amplificación. Por tanto, es necesario introducir un control negativo con la mezcla de reacción para la amplificación.
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