El sistema de detección es específico del maíz MON810. Los elementos diana son el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y la región de hsp70 exón1-intrón1, que son respectivamente una secuencia reguladora constitutiva y un gen de una proteína de choque térmico que produce un mayor nivel de transcripción.
Características de los cebadores GM1, GM2, GM3 y GM4
GM1
Secuencia TATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC Longitud 25
Peso molecular (g/mol) 7665,1 Punto de fusión * (G/C) 59,6
GM2
Secuencia TGCCCTATAACACCAACATGTGCTT Longitud 25
Peso molecular (g/mol) 7560.2 Punto de fusión * (G/C) 57.9
GM3
Secuencia ACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC Longitud 25
Peso molecular (g/mol) 7472,2 Punto de fusión * (G/C) 61,2
GM4
Secuencia GCATTCAGAGAAACGTGGCAGTAAC Longitud 25
Peso molecular (g/mol) 7722,9 Punto de fusión * (G/C) 59,6
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Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión 9 Controles
• Control positivo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0,1 % es GM [MON810])
• Control negativo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0 % es GM) • Control sin ADN molde: control negativo de la mezcla maestra, utilizando agua
en vez de ADN.
Preparación de la mezcla maestra 1
Los reactivos necesarios para una serie de 10 muestras (con controles positivos, negativos y sin plantilla) se mezclan siguiendo las instrucciones indicadas en el cuadro 5.
El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de GM1 y GM2 y 2 µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las soluciones se guardan en hielo.
Cuadro 5. Mezcla maestra GM1-GM2
Concentración
final maestra Mezcla para una muestra
Mezcla maestra para 10 muestras
Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl
Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl
MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl
dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl
Oligonucleótido mg1 20 µM 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl Oligonucleótido mg2 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl
TOTAL 48 µl 480 µl
• Preparar un tubo para microcentrífuga de 1,5 ml
• Añadir los reactivos siguiendo el orden indicado en el cuadro 5
• Agitar suavemente la mezcla maestra de GM1 y GM2 por pipeteado y centrifugar brevemente
• Dividir la mezcla maestra en alícuotas de 48 µl en tubos de reacción de PCR de 0,2 ml • Añadir 2 µl de la solución de ADN a dichas alícuotas
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Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión 9
• Colocar los tubos de reacción de PCR en el termociclador
Programa PCR (mg1/mg2) Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial 95 ˚C 3 min Desnaturalización 95 ˚C 45 s Anillamiento Extensión 60 ˚C 72 ˚C 50 s 50 s Número de ciclos 35
Extensión final 72 ˚C 3 min
4 ˚C ∞
Tras la amplificación, las muestras se centrifugan brevemente y se colocan en hielo.
Preparación de la mezcla maestra 2
Los reactivos necesarios para una serie de 10 muestras se mezclan siguiendo las instrucciones indicadas en el cuadro 6. El procedimiento se aplica a una muestra con 49 µl de mezcla maestra de GM3 y GM4 y 1 µl de solución de ADN preamplificado de la primera PCR. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las soluciones se guardan en hielo.
Cuadro 6. Mezcla maestra GM3-GM4
Concentración final Mezcla maestra para una muestra Mezcla maestra para 10 muestras
Agua desionizada esterilizada 33,75 µl 337,5 µl
Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl
MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl
dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl
Oligonucleótido mg3 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido mg4 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl
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Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión 9
• Preparar un tubo para microcentrífuga de 1,5 ml
• Añadir los reactivos siguiendo el orden indicado en el cuadro 6
• Agitar suavemente la mezcla maestra de GM3 y GM4 por pipeteado y centrifugar brevemente
• Dividir la mezcla maestra en alícuotas de 49 µl en tubos de reacción de PCR de 0,2 ml • Añadir 1 µl de la solución de ADN a dichas alícuotas
• Agitar suavemente y centrifugar brevemente
• Colocar los tubos de reacción de PCR en el termociclador
Programa de la PCR anidada (mg3-mg4) Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial 95 ˚C 3 min Desnaturalización 95 ˚C 45 s Anillamiento Extensión 60 ˚C 72 ˚C 50 s 50 s Número de ciclos 40
Extensión final 72 ˚C 3 min
4 ˚C ∞
Tras la amplificación, las muestras se centrifugan brevemente y se colocan en hielo.
Análisis de los productos de la PCR
Tras la amplificación, se analizan los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Se mezclan 8 µl de la solución con 2 µl de tampón de carga, tras lo cual se carga la solución en el gel de agarosa (2,5 %). Se realiza una migración a 100 V durante 1 hora. Se emplean marcadores de tamaño (15 µl de una escalera de 100 pb) en pocillos adyacentes del gel, de forma que pueda determinarse con precisión el tamaño de los amplicones. Completado el ciclo, el ADN del gel puede visualizarse mediante transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel del resultado del ensayo, puede fotografiarse el gel.
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Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión 9 Interpretación de los resultados
Las parejas de cebadores mg1-mg2 y mg3-mg4 se diseñaron para la detección específica de la transformación MON810 mediante PCR anidada, que rinde un fragmento final de PCR anidada de 149 pb. La especificidad viene dada por el hecho de que los cebadores están diseñados en la región que comprende el promotor E-35S y el gen exón/intrón de hsp70. El control positivo amplificará una banda de 189 pb. Los controles negativo y sin plantilla no deben arrojar una banda visible.
Si los controles positivo o negativo no dan los resultados esperados, el análisis por PCR de las muestras seleccionadas no es válido.
Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra presenta una banda de 149 pb, significa que la muestra contiene ADN de maíz MON810.
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