El gen diana es el gen cryIA(b), que protege la planta de insectos como el piral del maíz.
Características de los cebadores CRYIA1, CRYIA2, CRYIA3 y CRYIA4
CRYIA1
Secuencia CGGCCCCGAGTTCACCTT Longitud 18
Peso molecular (g/mol) 5394,6 Punto de fusión * (G/C) 59,5
CRYIA2
Secuencia CTGCTGGGGATGATGTTGTTG Longitud 21
Peso molecular (g/mol) 6519,2 Punto de fusión * (G/C) 57,6
CRYIA3
Secuencia CCGCACCCTGAGCAGCAC Longitud 18
Peso molecular (g/mol) 5397,6 Punto de fusión * (G/C) 61,7
CRYIA4
Secuencia GGTGGCACGTTGTTGTTCTGA Longitud 21
Peso molecular (g/mol) 6479,2 Punto de fusión * (G/C) 57,6
*Suponiendo que la [Na+] sea de 50 mM.
Controles
• Control positivo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0,1% es GM [Bt-176])
• Control negativo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0 % es GM) • Control sin ADN molde: control negativo de la mezcla maestra, utilizando agua
en vez de ADN.
Preparación de la mezcla maestra 1
Los reactivos necesarios para una serie de 10 muestras (con controles positivos, negativos y sin plantilla) se mezclan siguiendo las instrucciones indicadas en el cuadro 7. El
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Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión 9
procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de CRYIA1 y CRYIA2 y 2 µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las soluciones se guardan en hielo.
Cuadro 7. Mezcla maestra CRYIA1-CRYIA2
Concentración final
Mezcla maestra para una muestra
Mezcla maestra para 10 muestras
Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl
Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl
MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl
dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl
Oligonucleótido CRYIA1 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido CRYIA2 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl
ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl
TOTAL 48 µl 480 µl
• Preparar un tubo para microcentrífuga de 1,5 ml
• Añadir los reactivos siguiendo el orden indicado en el cuadro 5
• Agitar suavemente la mezcla maestra de CRYIA1 y CRYIA2 por pipeteado y centrifugar brevemente
• Dividir la mezcla maestra en alícuotas de 48 µl en tubos de reacción de PCR de 0,2 ml • Añadir 2 µl de la solución de ADN a dichas alícuotas
• Agitar suavemente y centrifugar brevemente
• Colocar los tubos de reacción de PCR en el termociclador.
Programa PCR (CRYIA1-CRYIA2)
Temperatura Tiempo
Desnaturalización inicial 95 ˚C 3 min
Desnaturalización 95 ˚C 40 s Anillamiento Extensión 60 ˚C 72 ˚C 40 s 40 s Número de ciclos 25
Extensión final 72 ˚C 3 min
4 ˚C ∞
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Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión 9 Preparación de la mezcla maestra 2
Los reactivos necesarios para una serie de 10 muestras se mezclan siguiendo las instrucciones indicadas en el cuadro 8.
El procedimiento se aplica a una muestra con 49 µl de mezcla maestra de CRYIA3 y CRYIA4 y 1 µl de solución de ADN preamplificado de la primera PCR. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las soluciones se guardan en hielo.
Cuadro 8. Mezcla maestra CRYIA3-CRYIA4
Concentración final Mezcla maestra para una muestra Mezcla maestra para 10 muestras
Agua desionizada esterilizada 33,75 µl 337,5 µl
Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl
MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl
dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl
Oligonucleótido CRYIA3 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido CRYIA4 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl
TOTAL 49 µl 490 µl
• Preparar un tubo para microcentrífuga de 1,5 ml
• Añadir los reactivos siguiendo el orden indicado en el cuadro 6
• Agitar suavemente la mezcla maestra de CRYIA3 y CRYIA4 por pipeteado y centrifugar brevemente
• Dividir la mezcla maestra en alícuotas de 49 µl en tubos de reacción de PCR de 0,2 ml • Añadir 1 µl de la solución de ADN a dichas alícuotas
• Agitar suavemente y centrifugar brevemente
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Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión 9 Programa de la PCR anidada (CRYIA3/CRYIA4)
Temperatura Tiempo
Desnaturalización inicial 95 ˚C 3 min
Desnaturalización 95 ˚C 40 s Anillamiento Extensión 60 ˚C 72 ˚C 40 s 40 s Número de ciclos 35
Extensión final 72 ˚C 3 min
4 ˚C ∞
Tras la amplificación, las muestras se centrifugan brevemente y se colocan en hielo.
Análisis de los productos de la PCR
Tras la amplificación, se analizan los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Se mezclan 8 µl de la solución con 2 µl de tampón de carga, tras lo cual se carga la solución en el gel de agarosa (2,5 %). Se realiza una migración a 100 V durante 1 hora. Se someten a electroforesis marcadores de tamaño (15 µl de una escalera de 100 pb) en pocillos adyacentes del gel, de forma que pueda determinarse con precisión el tamaño de los amplicones. Completado el ciclo, el ADN del gel puede visualizarse mediante transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel del resultado del ensayo, puede fotografiarse el gel.
Interpretación de los resultados
Las parejas de cebadores CRYIA1-CRYIA2 y CRYIA3-CRYIA4 se diseñaron para la detección específica del gen sintético cryIA(b) mediante PCR anidada, que rinde un fragmento final de PCR anidada de 149 pb. Este gen está presente en la línea del maíz Bt- 176 y en otras líneas (p. ej., la línea del maíz Bt-11).
El control positivo amplificará una banda de 189 pb.
Los controles negativo y sin plantilla no deben arrojar una banda visible.
Si los controles positivo o negativo no dan los resultados esperados, el análisis por PCR de las muestras seleccionadas no es válido.
Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra presenta una banda de 189 pb, significa que la muestra contiene ADN de maíz Bt-176.
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