I. Objetivo y plan de trabajo 1
II.2. Parte experimental 77
II.3.1. Propuesta y desarrollo de una ruta analítica para el screening rápido de
II.3.1.4. Evaluación del protocolo de inyección electrocinética: posibilidad
técnica del uso de ambos inyectores en microchip de cruz sencilla.
En la mayoría de los artículos encontrados en la literatura sobre microchips de CE
de cruz sencilla, uno de los reservorios no se utiliza y se denomina reservorio de
desecho de muestra (SW) (ver figura 1 de la sección II.1.2). Sin embargo, dado que la
introducción de la muestra dentro del microsistema se hace, en la mayoría de los
casos, de manera manual, el potencial uso de ambos reservorios inyectores sería muy
útil viéndose multiplicado el rendimiento analítico de estos microchips en un factor de
2.
Para explorar la eficiencia en la inyección de los inyectores presentes en un
microchip comercial de cruz sencilla (inyectores en T) y demostrar sus posibilidades de
trabajar indiscriminada y/o secuencialmente con ambos, se escogió como modelo la
determinación de arbutina extraído de la planta medicinal (Gayuba).
El procedimiento de inyección más sencillo es la aproximación unpinched porque
se puede llevar a cabo con una fuente de alto voltaje con una sola salida, siendo la
utilizada para este estudio. En la figura 37 se puede observar un esquema del diseño
del microchip junto con el protocolo de inyección propuesto que implica el uso de
ambos inyectores o reservorios (SR1 y SR2). Después de las inyecciones largas para
rellenar los brazos inyectores (fig.37 A+B), se aplica un voltaje por un corto espacio de
tiempo sobre cada reservorio de muestra (SR1 y SR2) manteniendo el reservorio de
detección conectado a tierra (inyección). La muestra es introducida dentro del capilar
de separación mediante una inyección electrocinética. A continuación, se aplica el
voltaje sobre el reservorio del tampón electroforético (RB) para llevar a cabo la
separación electroforética (fig.37 C+D).
Figura 37. Diseño del microchip y protocolo electrocinético de inyección
secuencial usando ambos inyectores. Pre‐inyección (2 kV, 20 s) (A+B),
inyección de muestra (2 kV, 10 s) y separación (1.5 kV) (C+D). RB:
tampón electroforético, SR1 y SR2: reservorios de muestra. 97
98
La novedad metodológica de esta estrategia fue extender el protocolo de
inyección unpinched al uso de ambos inyectores y estudiar en profundidad su eficacia y
reproducibilidad. La tabla 7 recoge los valores de parámetros tales como tiempo de
migración, altura y área de pico obtenidos para la determinación de arbutina en
extractos de hierbas medicinales (gayuba). Asimismo, en esta tabla se incluyen los
valores de precisión correspondientes a estos parámetros según se emplee un solo
inyector o los dos inyectores de manera secuencial. La precisión intra‐inyector se
definió como la desviación estándar relativa (RSD) obtenida en análisis repetitivos de
arbutina llevados a cabo con el mismo inyector y la precisión inter‐inyector como la
desviación estándar relativa (RSD) obtenida en el análisis repetitivo de arbutina llevado
a cabo con ambos inyectores. Se obtuvieron unos resultados excelentes con respecto a
los tiempos de migración altura y área de pico con unos valores de RSD menores al 4%
para un solo inyector (intra‐inyector) y menores al 7% para ambos inyectores (inter‐
inyector). Estos experimentos se realizaron usando dos extractos distintos (distinta
concentración de analito) para demostrar que se pueden usar indiscriminadamente
ambos inyectores con independencia de la concentración.
Por tanto, estos resultados indican una buena reproducibilidad entre inyectores
y abren la posibilidad de trabajar indiscriminadamente y/o secuencialmente con
ambos, al menos cuando la muestra que se deposite en cada reservorio sea la misma.
Además, destacar que el protocolo desarrollado en microchip de CE permitió la
monitorización del proceso de optimización de la extracción de arbutina en la muestra
de Gayuba ya que fue posible detectar hasta que se alcanzó un electroforegrama en
blanco lo que permitió registrar la eficacia extractiva en cada paso de la extracción (ver
figura 38). Como se indica en la figura 38, la eficiencia en la extracción fue cercana al
70% para el primer extracto y cercana al 30% para el segundo con independencia del
inyector empleado. Para confirmar estos resultados, los mismos extractos fueron
analizados off‐chip usando voltamperometría diferencial de impulsos (DPV)
obteniéndose rendimientos similares y confirmándose, además, la ausencia de analito
99
Tabla 7. Precisión intra‐ e inter‐inyector obtenida en la determinación de arbutina en extractos de Gayuba usando ambos inyectores (1 y
2).
1Extracto 1 2Extracto 2
3Inyector 1 Inyector 1
Tiempo de migración (s) Altura de pico (nA) Área de pico (C) (x107) Tiempo de migración (s) Altura de pico (nA) Área de pico (C) (x107)
170.1 29.5 2.37 162.8 11.8 0.92 171.4 28.8 2.34 163.4 12.6 0.99 171.6 28.4 2.47 163.2 12.5 0.99 171.3±0.4 (RSD = 0.2%) 28.9±0.5 (RSD = 2%) 2.39±0.07 (RSD = 3%) 163.1±0.3 (RSD = 0.2%) 12.3±0.4 (RSD = 3%) 0.96±0.04 (RSD = 4%) 4Inyector 2 Inyector 2
Tiempo de migración (s) Altura de pico (nA) Área de pico (C) (x107) Tiempo de migración (s) Altura de pico (nA) Área de pico (C) (x107)
171.8 27.6 2.12 164.0 13.0 1.06 171.8 28.3 2.34 164.0 13.3 1.13 171.2 28.2 2.30 162.6 13.7 1.07 171.4±0.4 (RSD = 0.2%) 28.0±0.4 (RSD = 1%) 2.2±0.1 (RSD = 5%) 163.5±0.8 (RSD = 0.5%) 13.3±0.3 (RSD = 2%) 1.09±0.04 (RSD = 4%)
Precisión total para ambos inyectores5 Precisión total para ambos inyectores
Tiempo de migración (s) Altura de pico (nA) Área de pico (C) (x107) Tiempo de migración (s) Altura de pico (nA) Área de pico (C) (x107) 171.4±0.4 (RSD=0.2%) 28.5±0.6 (RSD=2%) 2.3±0.1 (RSD=5%) 163.3±0.6 (RSD=0.4%) 12.8±0.7 (RSD=5%) 1.03±0.07 (RSD=7%)
1 Primer extracto obtenido de la Gayuba en 25 mL.
2
Segundo extracto obtenido en 5mL.
3
Valores del tiempo de migración, altura y área de pico obtenidos para el inyector 1.
4 Valores del tiempo de migración, altura y área de pico obtenidos para el inyector 2.
5
Valores del tiempo de migración, altura y área de pico obtenidos para ambos inyectores.
Figura 38. Eficiencia de la extracción de arbutina en una hierba medicinal
(Gayuba) usando ambos inyectores (1 y 2): electroforegramas y diagramas
obtenidos para (a) primer, (b) segundo y (c) tercer extracto. Condiciones:
tampón borato 60 mM pH=9, voltaje de separación 1.5 kV, inyección a 2 kV
durante 10 s, potencial de detección +1.0 V.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, quedó demostrada la posibilidad
de usar indistinta y/o secuencialmente ambos inyectores lo que nos abrió un abanico
de posibilidades a la hora de diseñar métodos analíticos mediante microchip CE‐ED. Un
ejemplo interesante sobre el uso de ambos inyectores con objetivos distintos, se
detallará en el siguiente apartado de esta Tesis.
0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1 Potencial (V) .1 5 µA a c b 1 1
Figura 39. Voltamperogramas correspondientes a la extracción de arbutina
en una hierba medicinal (Gayuba) obtenidos por DPV (off‐chip). (a) Primer,
(b) segundo y (c) tercer extracto. Picos: (1) Arbutina. Condiciones: tampón
borato 60 mM pH=9, velocidad de barrido 20mV/s, pulso 50 mV.
II.3.2. Determinación de vitaminas hidrosolubles en preparados farmacéuticos