Optimización de la separación electroforética 107

Estudio de las variables químicas. 

Las variables químicas que afectan a la separación de manera crítica son dos, el 

pH y la fuerza iónica. El primer paso es elegir el tampón de trabajo más adecuado por 

lo que se procedió al estudio de  dos tampones; borato y fosfato. 

Los resultados obtenidos mostraron que el tampón fosfato (pH=6) era más 

adecuado ya que permitía la separación de las vitaminas por CZE en menor tiempo y 

con mayores eficacias que el tampón borato (pH=9). La principal razón del aumento de 

los tiempos en tampón borato es que estos analitos interaccionaban con el borato 

(formación de complejos), lo que les confería mayor carga negativa retrasándose su 

salida. Esta interacción se apreciaba claramente con la piridoxina (pKa=4.5) ya que en 

medio fosfato salía con el flujo electroosmótico, es decir, estaba en forma neutra, y en 

medio borato salía después de éste. Por consiguiente, el único origen posible de la 

carga  negativa para este  analito era  la que  le aportaba  el complejo con borato 

(electroforegramas no mostrados).   

(i) Estudio del pH. 

Como es bien conocido, el pH es un parámetro de separación muy importante en 

analitos con propiedades ácido‐base. Las movilidades electroforéticas de los analitos 

dependen tanto del tamaño de los iones como de su carga efectiva, ya que son 

proporcionales al grado de disociación que experimentan los analitos en el medio de 

separación. Además, los analitos están sometidos a la acción del flujo electroosmótico 

(EOF) (generado por la superficie cargada del canal) que es directamente proporcional 

al voltaje de separación aplicado y al pH del tampón ya que se genera mayor ionización 

de la superficie del canal y, por tanto, mayor potencial zeta. Por tanto, la movilidad 

aparente del analito será la suma de su movilidad electroforética más la movilidad 

causada por el flujo electroosmótico (µaparente=µelectroforética+µEOF). 

Se estudiaron cuatro valores de pH utilizando un tampón fosfato 10 mM  pH= 5, 

6, 7 y 8. Los electroforegramas correspondientes a estudios de la influencia del pH en 

la separación de los analitos se muestran en la figura 44. Como se observa en dicha 

figura, para todos los valores de pH estudiados se obtuvieron resoluciones a línea 

base. Sin embargo, cuando el pH aumentaba los tiempos de análisis eran más largos y 

la sensibilidad de los picos disminuía, con la excepción del paso de pH=5 a pH=6. A 

estos valores de pH, se obtuvieron tiempos de análisis similares pero se eligió pH=6 

como pH de trabajo ya que las señales obtenidas para este valor eran mayores.       0 50 100 150 200 250 t (s) 10 nA a b c d 1 _{2 3} 1 2 3 1 _{2 3} 1 2 3   Figura 44. Influencia del pH en la separación electroforética. (a) pH=5, (b) pH=6, 

(c) pH=7, (d) pH=8. Picos: (1) Piridoxina 1x10‐4 M, (2) ac. ascórbico 2x10‐4, (3) 

ac.fólico 2x10‐4 M. Condiciones: el resto de condiciones igual que fig.40.   

La separación por CZE se logró porque tanto el ácido ascórbico (pKa =4.04) como 

el fólico (pKa1=1.5, pKa2=4.5) a estos valores de pH están cargados. La vitamina C 

posee una carga negativa y el ácido fólico está doblemente cargado, mientras que la 

piridoxina permanece neutra. Al estar a un pH por encima de los valores de pKa 

correspondientes  tanto  al  ácido  ascórbico  como  al  ácido  fólico,  a  medida  que 

aumentemos el pH, los analitos estarán más cargados (más ionizados) y sus tiempos de 

migración aumentarán, justificándose el menor tiempo de análisis obtenido para pH=6. 

Por  otra  parte,  este  aumento  de  pH  también  provoca  un  aumento  del  flujo 

electroosmótico,  justificándose que a pH=6 se obtuvieran tiempos de análisis similares 

a pH=5.   

(ii) Estudio de la fuerza iónica. 

El estudio de la fuerza iónica se realizó en un intervalo comprendido entre 10 y 

30 mM de concentración de tampón borato variándose en unidades de 10 mM entre 

cada experimento.    100 150 200 t (s) 10 nA a b c 2 3   Figura 45.   Influencia de la fuerza iónica en la separación 

de  ácido ascórbico y fólico. (a) 10 mM, (b)20 mM, (c) 30 

mM. Condiciones: el resto de condiciones como en fig.46. 

Picos: (2) ac. ascórbico 2x10‐4, (3) ac.fólico 2x10‐4M. 

La figura 45 muestra la influencia de la fuerza iónica sobre la separación de los 

analitos al pH optimizado. En esta figura no se ha mostrado el electroforegrama 

completo para poder apreciar con mayor claridad su influencia en la separación de los 

ácidos ascórbico y fólico. En este caso, un aumento de la fuerza iónica resultó ser 

crítico para la separación ya que, aparte de aumentar los tiempos de migración, se 

pasó de una resolución a línea base a 10 mM (fig. 45 a) a una pérdida total de 

resolución a 30 mM detectándose una única señal (fig. 45 c). También es de destacar 

como a 30 mM la corriente eléctrica a través del capilar (electroforética) es tan grande 

que se acopla con la corriente eléctrica de detección dando lugar a un aumento 

notable del ruido. Por tanto, la fuerza iónica elegida para el resto del estudio fue 10 

mM con la cual se obtenía una resolución de 1.2. 

Estudio de las protocolos electrocinéticos de inyección y separación. 

Una vez optimizadas las variables químicas, se realizó la optimización de las 

condiciones electrocinéticas de inyección   y el estudio de la influencia del voltaje de 

separación sobre la separación de los analitos.   

(i) Optimización de las condiciones electrocinéticas de inyección. 

En la inyección electrocinética la cantidad de muestra inyectada depende de dos 

factores, del tiempo de la inyección y del voltaje aplicado durante la misma. Se 

llevaron a cabo diferentes experimentos utilizando tiempos de inyección de 3, 5 y 10 

segundos y voltajes de inyección comprendidos entre 1.0 y 2.0 kV.  

La señal más adecuada (en términos de la sensibilidad obtenida y de la forma 

adoptada por los picos) se obtuvo cuando se emplearon valores de 2.0 kV como 

potencial de inyección y tiempos de inyección de 3 s.   

 (ii) Estudio del voltaje de separación. 

En las condiciones previamente optimizadas de pH (pH=6.0), fuerza iónica (10 

mM) y condiciones de inyección (2.0 kV, 3 s), se estudió la influencia del voltaje de 

separación en un intervalo comprendido entre 2 y  3 kV, en incrementos de 0.5 kV. 

Los electroforegramas obtenidos para la influencia del voltaje de separación 

sobre la separación de los analitos se muestran en la figura 46. Como se observa y era 

de esperar, un aumento en el voltaje de separación se tradujo en menor tiempo de 

análisis, peor resolución y un mayor ruido. 

0 50 100 150 t (s) 10 nA a c b 1 2 3 1 2 3 1 2 3  

Figura 46. Influencia del voltaje de separación en la separación electroforética. 

(a)3 kV, (b) 2.5 kV, (c) 2 kV. Picos: (1) Piridoxina 1x10‐4 M, (2) ac. ascórbico 2x10‐4  M, (3) ac.fólico 2x10‐4 M. Condiciones: el resto de condiciones igual que fig. 40.   

Asimismo, con el fin de obtener una visión cuantitativa de la influencia que 

ejerce el voltaje de separación sobre los analitos, se han calculado los valores de 

resolución entre el pico de ácido ascórbico y el de ácido fólico para cada voltaje 

agrupándose estos valores en la tabla 8. Las condiciones óptimas de separación se 

dieron cuando se tomó una situación de compromiso entre el menor tiempo de 

análisis  posible  y  una  resolución  aceptable.  Estas  condiciones  experimentales  se 

alcanzaron cuando el voltaje de separación utilizado fue de 2 kV.    

Tabla 8. Resoluciones correspondientes a ácido ascórbico y ácido fólico para cada 

voltaje de separación ensayado. 

  V (kV)  3  2.5  2  Rs  0.8  1.1  1.3          111