Optimización de la separación y detección de los analitos 89

El desarrollo de un método para la determinación de analitos en un microsistema 

analítico para electroforesis capilar con detección electroquímica exige un estudio 

profundo  de  todas  las  variables  involucradas  en  el  mismo.  Existen  variables 

relacionadas propiamente con el diseño, tales como la distancia y el alineamiento del 

electrodo con respecto a la salida de canal de separación, variables de naturaleza 

electroforética tales como el voltaje de separación y el tiempo y voltaje de inyección 

(protocolo de inyección unpinched), y otras variables relacionadas propiamente con la 

detección electroquímica como son el tipo de electrodo y el potencial de detección.  

El acoplamiento del microchip para EC con el electrodo de trabajo requiere la 

optimización de la distancia existente entre el canal de separación y el electrodo así 

como de un perfecto alineamiento entre ambos. Esta distancia debe de adquirir un 

valor tal que evite, por una parte, el acoplamiento entre la corriente electroforética y 

la corriente amperométrica de detección y, por otra, una pérdida de eficacia y por 

consiguiente una pérdida de sensibilidad. En efecto,  al  disminuir la distancia  de 

separación aumenta la eficacia pero también el ruido de la detección dado que el 

acoplamiento es mayor.  

En primer lugar, se optimizaron las variables químicas, es decir, el pH y la fuerza 

iónica del medio electroforético. El tampón elegido fue borato ya que forma complejos 

cargados negativamente con los grupos hidroxilo presentes en los flavonoides y otras 

estructuras fenólicas favoreciendo las separaciones por electroforesis capilar en zona 

(CZE) [183].  La influencia del pH se evaluó entre 8.5 y 9.5 siendo 9.0 el valor de pH más 

adecuado  (electroforegramas no mostrados). 

 La figura 34 A muestra la influencia de la fuerza iónica sobre la separación 

electroforética cuando la concentración del tampón borato pH=9 varía entre 30 mM y 

60 mM en incrementos de 10 mM. Como era de esperar, cuando la fuerza iónica se 

incrementó, los tiempos de migración también lo hicieron y la resolución entre picos 

mejoró. Se obtuvo una resolución aceptable (Rs=1.2) cuando la concentración del 

tampón borato fue 60 mM por lo que fue elegida como valor óptimo. La influencia del 

voltaje de separación también fue estudiada. En la figura 34 B se pueden observar los 

electroforegramas obtenidos cuando el voltaje de separación se incrementó desde 1.0 

a 2.5 kV en incrementos de 0.5 kV. Al aumentarse el voltaje de separación, los tiempos 

de migración disminuyeron produciéndose una pérdida de resolución. Finalmente, se 

eligió 1.5 kV como voltaje óptimo de separación ya que se conseguía una completa y 

rápida separación (180 s) con una adecuada resolución (Rs=1.2).  

Por otra parte, la máxima sensibilidad sin pérdida de resolución entre picos se 

obtuvo realizando  la  inyección  de muestra  a 2  kV  durante  10  s  (resultados no 

mostrados) por lo que se escogieron estos valores como los óptimos. 

Como  se ha expuesto  anteriormente, la  distancia entre  la salida  del  canal 

electroforético y la superficie del electrodo de trabajo es crucial en la configuración  end‐channel porque afecta notablemente a la eficiencia y sensibilidad del análisis. La 

figura 34 C muestra la influencia de la distancia entre la salida del canal y el electrodo 

sobre la sensibilidad, la eficiencia y la resolución en la separación. El control de la 

distancia canal/electrodo se realizó situando una, dos o tres láminas de celofán entre 

ambos actuando como separadores lo que permitió obtener distancias de separación 

de 60, 120 y 180 µm, respectivamente.    

Figura 34. (A) Influencia de la fuerza iónica sobre la separación electroforética: (a) 30 mM, (b) 40 mM, 

(c) 50 mM, and (d) 60 mM. Condiciones: tampón borato pH 9, voltaje de separación 1.5 kV, inyección a 2 

kV durante 10 s, potencial de detección +1.0V. (B) Influencia del voltaje de separación sobre la 

separación: (a) 1 kV, (b) 1.5 kV, (c) 2 kV, (d) 2.5 kV. Condiciones: tampón borato 60mM pH 9, inyección a 

2 kV durante 10 s, potencial de detección +1.0V. (C) Influencia de la distancia de separación entre el 

detector y la salida del canal electroforético: (a) 60 µm, (b) 120 µm, and (c) 180 µm. Condiciones: 

tampón borato 60mM pH 9, voltaje de separación 1.5 kV, inyección a 2 kV durante 10 s, potencial de 

detección +1.0V. Picos: (1) hidroquinona 200 ppm y (2) arbutina 200 ppm.   

Como se observa en la figura 34 C (a‐c), cuando la distancia se incrementa, la 

eficiencia de la separación y la señal analítica disminuyen. De hecho, el número de 

platos se reduce de 1804 a 679 para hidroquinona y de 1834 a 520 para arbutina 

cuando  la  distancia  canal/electrodo  pasa  de  60  a  180  µm,  respectivamente.  En 

contraposición, al reducir la distancia se aumenta el ruido de fondo (comparar fig.34 C  a y c) hasta tal punto que cuando no se coloca ningún separador se genera un enorme 

ruido que impide ver las señales (electroforegrama no mostrado). El origen de este 

ruido es el acoplamiento entre el campo eléctrico de separación y el potencial de 

detección. Además, el uso del espaciador no es sólo para evitar este efecto sino para 

tener un perfecto control de la distancia entre la salida del canal y el electrodo y, de 

este  modo,  obtener  resultados  reproducibles.  En  consecuencia,  se  eligió  como 

distancia óptima 60 µm ya que se obtuvo la mejor eficacia y sensibilidad. 

Aunque la influencia del voltaje de separación es mínima sobre el potencial 

aplicado sobre el detector electroquímico ya que la mayoría del voltaje se pierde a lo 

largo del canal de separación, este voltaje puede causar un pequeño pero significativo 

cambio en el potencial aplicado sobre el electrodo de trabajo. Por tanto, es necesario 

obtener el voltamperograma hidrodinámico (HDV) para los compuestos de interés bajo 

las condiciones electroforéticas escogidas (ver figura 35). Se seleccionó +1.0 V como el 

mejor potencial de detección porque presentaba la mejor relación señal/ruido para la 

detección simultánea de ambos analitos (hidroquinona y arbutina).    0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 Inte ns id a d ( n A ) Potencial (V)

Figura 35. Voltamperograma hidrodinámico correspondiente a hidroquinona (♦) y 

arbutina (■). Condiciones: como en figura 34C.