I. Objetivo y plan de trabajo 1
II.1.2. Diseños y principios de los microsistemas de electroforesis capilar con
II.1.2.5. Modos de detección 31
De los tres modos generales de detección electroquímica (amperometría,
potenciometría y conductimetría), la amperometría es el más usado en microchips de
CE. Más recientemente, ha sido investigada la conductimetría, siendo utilizada en
menor medida aunque actualmente ocupa un papel muy importante, mientras que la
potenciometría prácticamente no se ha utilizado.
Amperometría/voltamperometría
En amperometría se mide la corriente que resulta al aplicar un potencial
constante al electrodo de trabajo. Es la técnica electroquímica más extensamente
utilizada para CE convencional y su implementación como sistema de detección en
microchips ha sido llevada a cabo por distintos grupos de investigación. A
continuación, sólo se describirán los avances más importantes de detección
amperométrica en microchips de CE‐ED, omitiéndose obviamente todos aquellos que
emplean amperometría convencional como modo de detección.
H.Y. Chen et al. [84, 85], utilizando una configuración in‐channel, desarrollaron
una estrategia de detección que permitió determinar especies no electroactivas
mediante una amperometría indirecta, ampliándose así el abanico de analitos
potencialmente detectables mediante este modo de detección. Esta estrategia
consistió en aprovechar los cambios del potencial efectivo del electrodo de trabajo,
provocados por el acoplamiento entre el campo eléctrico de separación y el potencial
de dicho electrodo. El acoplamiento se altera al variar la conductividad del medio lo
que ocurre al paso de los analitos no electroactivos a través del electrodo (más
concretamente, entre el electrodo de trabajo y el cátodo del campo eléctrico
electroforético). Dicha alteración genera un aumento o un descenso del potencial
efectivo del electrodo. La diferencia entre los dos trabajos mencionados anteriormente
[84, 85] radica en la manera de aprovechar la alteración del potencial efectivo. En el
primer trabajo [84], detectan cationes por electroforesis de polaridad directa
utilizando un potencial de trabajo reductor para monitorizar la reducción del oxígeno
disuelto en el tampón de separación. Al pasar los cationes por el electrodo provocan
un aumento o descenso del potencial efectivo que genera un pico (positivo o negativo)
al variar la cantidad de oxígeno que se reduce. Con esta estrategia detectaron también
cuatro aminoácidos no electroactivos [86]. De manera análoga, en el segundo trabajo
[85] se detectaron aniones por polaridad invertida utilizando un potencial de oxidación
alto dentro de la barrera de oxidación del sistema.
Se ha investigado la aplicación de detección amperométrica de pulsos (PAD) en
un microchip híbrido PDMS/vidrio con un electrodo de trabajo de platino para la
detección electroquímica de glucosa, maltosa y xilosa [87]. La amperometría de pulsos
mantiene la actividad del electrodo mediante una secuencia triple de pulsos que
incluye los potenciales de detección, de limpieza del electrodo y de reactivación del
mismo. La limpieza de la superficie del electrodo por oxidación de los productos de la
reacción, fijados por adsorción, tiene lugar a un potencial suficientemente positivo
mientras que la regeneración de la superficie del electrodo tiene lugar a un potencial
negativo. La detección amperométrica de pulsos también ha permitido la separación y
la detección en microchip de CE de carbohidratos no derivatizados, aminoácidos y
antibióticos que contienen azufre [88, 89]. También ha sido utilizada para seguir la
degradación de ácidos fenólicos de plantas acuáticas [90], así como para determinar
contaminantes fenólicos en agua [91].
Por otra parte, Herbert et al. [92] han aportado una interesante contribución
utilizando voltamperometría sinusoidal (SV) en microchips. Asimismo, han llevado a
cabo una comparación entre la amperometría a potencial constante y la SV usando
plataformas de microchips encontrando que la SV era más sensible (nM) que la
amperometría a potencial constante (μM) para los neurotransmisores estudiados
(dopamina, isoproterenol, y L‐dopa) [93]. También ha sido descrito la aplicación de la
SV utilizando un electrodo de película de carbono pirolizado fotorresistente [82].
Aunque la utilidad de la detección amperométrica en microchips de CE ha sido
ampliamente demostrada, los microchips también se pueden entender como
plataformas ideales para realizar análisis voltamperométricos a nivel de la microescala
[94]. Se trata de la introducción de protocolos voltamperométricos para la
detección/caracterización electroquímica después de transportar el analito, usando los
microchips de EC como “sistema de inyección/preparación de la
muestra/manipulación de líquidos”. Esta propuesta es ventajosa con respecto a la
voltamperometría en nanoviales, la cual carece de preparación de muestra y
manipulación de fluidos. Pero la característica más atractiva es que este acoplamiento
realza el poder de los dispositivos de microchips al añadir una nueva dimensión de la
información analítica y establece esquemas de detección altamente sensibles.
Conductimetría
El acoplamiento de la detección conductimétrica en microchips de EC fue
descrito después que el de la amperometrica [19, 95‐105]. La detección
conductimétrica es menos sensible que la amperométrica pero es una técnica de
detección universal que se ha aplicado en microchips de CE tanto en el modo galvánico
(un par de electrodos se coloca en el canal de separación para medir la impedancia del
líquido) [95, 96] como en el modo sin contacto (contactless, no hay ningún contacto
entre el par de electrodos y la disolución del canal de separación) [97‐105]. La
detección sin contacto presenta tres ventajas sobre la galvánica: (i) el circuito
electrónico se desacopla del alto voltaje aplicado para la separación (no hay ningún
acoplamiento directo entre los componentes electrónicos y el líquido en el canal), (ii)
se previene la formación de burbujas en los electrodos metálicos, y (iii) se previene la
modificación electroquímica o degradación de la superficie del electrodo. Ambos
modos de detección (sin contacto y galvánico) integrados en un microcanal requieren
una conexión física con los componentes electrónicos situados dentro o incluso fuera
del microdispositivo.
Las figuras 7 y 8 muestran diseños seleccionados como representativos de
ambos modos de detección, galvánico y sin contacto, respectivamente. En ambas
estrategias, la microfabricación desempeña un papel importante en la integración de
los detectores de conductividad.
Dentro del modo galvánico, Van der Berg y colaboradores [95] han desarrollado
chips de vidrio para electroforesis capilar en zona libre y han demostrado la posibilidad
de detectar iones inorgánicos y ácidos fumárico, málico y cítrico (fig. 7). Soper y
colaboradores [96] han diseñado un dispositivo de PMMA con electrodos de hilo de
platino integrados y han mostrado la separación y detección sensible de aminoácidos,
proteínas y fragmentos de ADN con un detector convencional de conductividad
utilizando electroforesis capilar en zona libre (CZE) y cromatografía electrocinética
micelar (MEKC), respectivamente.
Por otra parte, Guijt et al. [97] llevaron a cabo una de los primeras y más
interesantes aportaciones que utilizan detectores de conductividad sin contacto. En
este trabajo, se presentó y evaluó un detector conductimétrico sin contacto integrado
dentro de un microcanal de CE. Se realizó la medida de la conductividad con un
sistema de cuatro electrodos usando dos electrodos externos y dos internos. Se
obtuvo el acoplamiento capacitivo con el líquido dentro del canal cubriendo los
electrodos con una capa fina de un dieléctrico, carburo de silicio. Pumera et al. [100]
han propuesto un nuevo diseño sin contacto colocando los electrodos sobre la
superficie externa del microchip en lugar de incrustarlos en el microdispositivo. Esta
propuesta permite una simplificación significativa del proceso de fabricación y supone
una de las más importantes alternativas de la conductividad sin contacto en microchips
(fig. 8). El nuevo detector conductimétrico se basa en la colocación de dos electrodos
de película de aluminio en el lado externo de un microchip de PMMA y en medir la
impedancia de la disolución en el canal de separación. (A) (B) a b (A) (B) a b
Figura 7. Configuración de un microchip de electroforesis con detección conductimétrica galvánica
integrada. (A) Descripción esquemática de la disposición experimental. (B) Electroforegramas de la
separación de iones metálicos alcalinos en un canal de 6 cm (a), y en un canal de 3 cm (b) [95].
Más recientemente, el mismo grupo ha investigado la extensión del concepto a
una detección dual conductimétrica/amperométrica usando un microchip de vidrio
para la detección de compuestos nitroaromáticos y explosivos [101]. El microsistema
implicó la combinación de un detector conductimétrico sin contacto con un detector
amperométrico end‐channel. Este acoplamiento se hizo usando un único canal de
separación y permitió mejorar la caracterización de iones (cationes pequeños) y
especies electroactivas (explosivos nitroaromáticos), así como la confirmación de la
identidad de los picos. El mismo grupo ha descrito la detección conductimétrica sin
contacto para monitorizar aminas alifáticas en disolventes que absorbían en el UV
(dimetilformamida, dimetilacetamida, dimetil sulfóxido, carbonato de propileno),
revelando la conveniencia de este detector en medios no acuosos [102].
1 2 3 4 1 2 3 4 5 (A) (B) a b 1 2 3 4 1 2 3 4 5 (A) (B) a b
Figura 8. Configuración de un microchip de electroforesis con detección conductimétrica sin contacto
(contactless) integrada. (A) Microchip (parte superior). Vista ampliada del detector (parte inferior). (B)
Electroforegramas que muestran la separación de cationes (a) y aniones (b). (a) Mezcla que contiene
450 μM de potasio (1), 800 μM de bario (2), 650 μM de sodio (3) y 550 μM de litio (4). (b) Mezcla de
cloruro (1), sulfato (2), fluoruro (3), acetato (4) y fosfato (5), 800 μM (1‐3) y 1600 μM (4,5) [100].
El grupo de Wang [103] también ha desarrollado un nuevo e ingenioso detector
móvil de conductividad sin contacto. Este sistema permite posicionar el detector en
diferentes puntos a lo largo del canal de separación mediante el deslizamiento del
soporte del electrodo. Este ingenioso diseño permite la conmutación rápida entre la
determinación de analitos totales (solutos no resueltos) y determinación de cada uno
de ellos (analitos separados), en base a situar el detector en el principio o en el final
del canal de separación, respectivamente. Una construcción similar con pequeñas
diferencias con respecto a la longitud del electrodo fue diseñada por Chen et al. [106]. Tanyanyiwa y Hauser [104] han aportado un excelente trabajo que trata sobre el
acoplamiento entre el alto voltaje y la detección conductimétrica sin contacto en
microdispositivos electroforéticos planos. Estos autores demostraron que la mejor
sensibilidad se obtenía situando los electrodos en depresiones de tal manera que se
puedan acoplar al canal de separación (límites de detección para iones pequeños K+,
Na+ y Mg2+, 0.49, 0.41 y 0.35 μM, respectivamente). En este trabajo se describió
también la detección de metales pesados como Mn2+, Zn2+ y Cr3+. La naturaleza
universal del nuevo diseño fue ilustrada mediante la detección de ácidos láctico y
cítrico, los cuales son de interés en el campo alimentario, y con la detección de tres
antiinflamatorios. Con este mismo sistema se exploró la determinación de distintas
especies bioquímicas (aminoácidos, péptidos, proteínas, inmunoglobulina y DNA) y los
resultados fueron satisfactorios (LOD del orden μM) [107].
También se ha propuesto un sofisticado diseño de detección conductimétrica sin
contacto para microdispositivos de CE utilizando cuatro electrodos [105]. Esta nueva
configuración mejoró el funcionamiento analítico del sistema de detección clásico de
dos electrodos. La nueva configuración fue ilustrada con iones inorgánicos (K+, Na+ y
Li+) y con seis ácidos orgánicos.
Bai et al. [108] han propuesto detección conductimétrica pasiva aplicada a
microchips de CE. El voltaje de separación se utilizó para generar una diferencia de
potencial entre dos electrodos situados a lo largo del canal. Para electroforesis de
corriente constante, la señal generada es proporcional a la resistencia de la disolución
pasando entre los electrodos. Este principio directamente toma la ventaja del campo
de separación y la señal se mide usando un voltímetro de alta impedancia. El concepto
ha sido demostrado mediante la separación de tres iones alcalinos en un microchip
polimérico.
Finalmente, Fu et al. [109] han propuesto un diseño de un microchip de CE‐ED en
el cual utilizan un detector conductimétrico sin contacto con electrodos semicirculares
de oro y lo han aplicado para la detección de cationes metálicos en aguas minerales,
bebidas energéticas y vino tinto.