I. Objetivo y plan de trabajo 1
II.1.2. Diseños y principios de los microsistemas de electroforesis capilar con
II.1.2.3. Implementación de la detección electroquímica 22
Un diseño adecuado de detección electroquímica debería asegurarnos, en primer
lugar, un aislamiento eléctrico (desacoplamiento) frente al alto voltaje de separación
(normalmente entre 1‐5 kV) debido a que la corriente asociada con el alto voltaje de
separación es, por lo general, varios órdenes de magnitud superior a la corriente
medida en el detector electroquímico. Asimismo, un diseño adecuado debería permitir
una alta sensibilidad, selectividad (vía potencial aplicado y material del electrodo), un
manejo simple y estabilidad a largo plazo. En la literatura más relevante [17, 18, 20] se
han publicado diferentes diseños, de los cuales los más representativos se comentarán
a continuación.
Teniendo en cuenta la posición relativa entre el canal de separación y el
electrodo de trabajo [20], las configuraciones pueden ser clasificadas como: detección
end‐channel, in‐channel y off‐channel (fig. 4A). En la detección end‐channel el
electrodo es situado justo en la salida del canal de separación. Para la detección in‐
channel, el electrodo es situado directamente en el canal de separación, y la detección
off‐channel implica eliminar el voltaje de separación antes de que este alcance el
detector mediante un desacoplador. A Working electrode Worging electrode Working electrode B End-channel In-channel Off-channel Flow by Flow onto Flow through Working electrode externally mounted Decoupler Working electrode Working electrode Working electrode internally mounted Plate 2 Plate 1 A Working electrode Worging electrode Working electrode B End-channel In-channel Off-channel Flow by Flow onto Flow through Working electrode externally mounted Decoupler Working electrode Working electrode Working electrode internally mounted Plate 2 Plate 1
Figura 4. Configuraciones comunes de los detectores electroquímicos para los microchips de CE, (A)
en función de la posición relativa entre el capilar y el electrodo de trabajo: end‐channel (externo o
interno), in‐channel, y off‐channel [20]; (B) en función de la posición relativa del electrodo con
respecto a la dirección del flujo: flow by (paralelo); flow onto (con la superficie perpendicular a la
dirección del flujo); flow through (con el detector colocado directamente en la salida del canal) [18].
Por otra parte, teniendo en cuenta la posición relativa entre el electrodo de
trabajo y la dirección del flujo [18] (fig. 4B), podemos encontrar tres configuraciones:
flow by, la dirección del flujo es paralela a la superficie del electrodo; flow onto, la
superficie del electrodo es perpendicular a la dirección del flujo; y flow through donde
el electrodo es situado directamente a la salida del canal. Como se observa, en todos
los casos, la característica común es situar el electrodo de trabajo fuera del canal de
separación porque tal disposición produce en buena medida un eficaz aislamiento del
alto voltaje de separación, debido a la caída del potencial a través del capilar, por lo
que las tres configuraciones mencionadas (flow by, flow onto y flow through) deben
ser entendidas como protocolos de detección end‐channel.
A continuación, se describirán los aspectos más importantes de cada una de las
configuraciones mencionadas (end‐channel, in‐channel y off‐channel).
Detección end‐channel
La detección end‐channel implica la alineación del electrodo al final del canal de
separación (ver figura 5). El voltaje de separación tiene una influencia mínima sobre el
potencial aplicado en el detector electroquímico porque la mayor parte del voltaje cae
a través del canal de separación. Sin embargo, el voltaje de separación puede causar
un pequeño pero significativo cambio en el potencial del electrodo de trabajo [18, 20].
Por lo tanto, para determinar el potencial de detección apropiado para un analito
dado, es necesario obtener un voltamperograma hidrodinámico para el compuesto de
interés en las condiciones de separación exactas que serán empleadas [51]. La
principal ventaja de este diseño consiste en que no es necesario ningún desacoplador y
que el microsistema es sencillo y robusto. Sin embargo, la mayor desventaja es una
pérdida de eficacia en la separación y de sensibilidad, debido a la distancia existente
entre el final del canal de separación y el electrodo de trabajo. Esta distancia de
separación es también crucial en el desacoplamiento, influyendo en el ruido de la señal
analítica obtenida.
La configuración end‐channel permite la limpieza del electrodo y el empleo de
electrodos químicamente modificados; sin embargo, estos diseños generalmente
poseen una menor integración de sus componentes en el soporte monolítico y carecen
de la capacidad de incorporar electrodos múltiples.
Detección in‐channel
Las estrategias in‐channel implican situar al electrodo de trabajo directamente
dentro del canal de separación. Los analitos migran sobre el electrodo en el interior del
canal de separación, eliminando el ensanchamiento de banda que a menudo se
observa con alineaciones end‐channel [20], sin embargo, se necesita utilizar un
potenciostato aislado eléctricamente. En este sentido, Martin et al. [52] publicaron un
excelente trabajo, que implica el desarrollo de un potenciostato aislado
eléctricamente, que hizo posible colocar el electrodo de trabajo en el canal de
separación. El compacto sistema potenciostático miniaturizado (4x9x2 cm) mantiene la
promesa de integración del sistema de detección completo en un microchip. En la figura 5 se muestra una comparativa entre la configuración in‐channel frente a la
configuración end‐channel descrita anteriomente. La configuración in‐channel ayudó a
eliminar algunas de las características de la separación negativas encontradas con la
configuración end‐channel, especialmente con respecto al alineamiento del electrodo
de trabajo al final del canal de separación así como con respecto a las eficacias de
separación y sensibilidad. De hecho, esta configuración aumenta la eficacia de la
separación (el número de platos en un factor de 1.3) (fig. 5B) y presenta características
de eficacia parecidas a las encontradas para LIF en términos de altura de plato y
simetría de picos. Sin embargo, mantiene el problema, que ya sucedía con la
configuración end‐channel, del pequeño cambio en el potencial de detección que
genera el voltaje de separación el cual obliga a construir el voltamperograma
hidrodinámico para hallar el potencial óptimo de detección. (A) in in--channelchannel in in--channelchannel end
end--channelchannel
(B)
end
end--channelchannel
(A) in in--channelchannel in in--channelchannel end
end--channelchannel
(B)
end
end--channelchannel
Figura 5. Configuraciones in‐ y end‐channel de un microchip de CE con una célula de ED
integrada propuesta por Martin et al. [52]: (A) diseño del microchip (arriba) y alineamiento
del electrodo utilizado en estos estudios (abajo). (B) Electroforegramas de catecol
utilizando detección in‐channel y detección end‐channel.
Además, existe un trabajo muy interesante en la bibliografía donde se combina,
por primera vez, detección in‐ y end‐channel. Fue desarrollado por el grupo del
profesor Costa [53] y consistió en la fabricación de un detector amperométrico dual de
oro formado por un electrodo de película de oro y un hilo de oro en configuración in‐ y
end‐channel, respectivamente. La ventaja de este sistema es que puede utilizar
diferentes potenciales de detección para la detección in y end‐channel, presentando
mayor selectividad para compuestos que exhiben reacciones redox reversibles, como
es el caso del p‐aminofenol.
Detección Off‐channel
Mediante este tipo de detección se superan los problemas generados tanto por
la detección end‐ como la in‐channel. La disposición del electrodo es similar a la de la
detección in‐channel (fig. 5A), pero el voltaje de separación es aislado de la corriente
amperométrica utilizando un desacoplador. Conceptualmente hablando, el
desacoplador desvía de manera efectiva el voltaje de separación a tierra y se crea una
región de campo libre después del electrodo donde los analitos son eluidos por el EOF
generado antes del desacoplador hacia el detector, de esta manera, se evita las
alteraciones que genera el voltaje de separación sobre el potencial de detección [51].
De manera ilustrativa, se muestra en la figura 6 el diseño propuesta por Wu et al.
[54] donde se describió, por primera vez, el empleo de una técnica de microfabricación
para integrar simultáneamente un detector electroquímico de tres electrodos y un
desacoplador eléctrico de platino con una capa de PDMS tratada con plasma de
oxígeno que contiene un canal de CE para completar un microchip de CE‐ED. La figura 6A muestra claramente todos los componentes de este interesante diseño que
combina las ventajas de la microfabricación con el concepto de desacoplamiento. El
desacoplador se situó delante del detector de tres electrodos para aislar la
interferencia del alto voltaje de separación sobre el potencial de detección.
Experimentalmente, los electroforegramas obtenidos de los analitos dopamina y
catecol demostraron que el desacoplador sobre el que se habían depositado
nanopartículas de platino tiene suficiente capacidad para aislar la interferencia del
campo eléctrico de separación (fig. 6B y 6C). Además, también se puede apreciar el
bajo ruido que se obtiene mediante la configuración off‐channel registrándose valores
inferiores al picoamperio.
(A) (B) (C) (A) (B) (C)
Figura 6. Configuración off‐channel de un microchip de CE con una célula de ED
integrada: (A) célula electroquímica depositada en vidrio (arriba) y microchip de PDMS
(abajo). (B) Electroforegramas correspondientes a dopamina1 mM obtenidos a
diferentes campos eléctricos de separación. (C) Electroforegramas de dopamina (DA)
0.125 μM en el campo eléctrico de 65 V/cm y dopamina 1 mM y catecol 1 mM (CA) en el
campo eléctrico de 75 V/cm [54].
En la mayoría de los diseños in‐channel y off‐channel publicados se utilizan
técnicas de microfabricación para incorporar los distintos electrodos en los chips
facilitando la creación de dispositivos totalmente integrados y portátiles; pero tiene el
inconveniente de requerir el empleo de instrumentación cara y habitación blanca
(clean room) junto con el hecho de que la integración de más de un material
electródico exige mucho esfuerzo.
Asimismo, indicar que para crear verdaderos sistemas lab‐on‐a‐chip, los
componentes electrónicos así como el esquema del circuito microfluidico y de la
detección necesitan ser miniaturizados en un sistema compacto. Una contribución de
varios autores ha presentado una descripción de esta propuesta (miniaturización total)
y, particularmente, ha demostrado algunas de las ventajas únicas de los sistemas
totalmente microfabricados diseñados para CE‐ED [55], ofreciendo una propuesta
multidisciplinar para desarrollar un sistema autónomo y transportable de CE‐ED que
(a) incorpora todos los electrodos necesarios directamente en el microchip, y (b) utiliza
soportes electrónicos miniaturizados diseñados especialmente con el fin de soportar
los diseños de microchips de CE‐ED.