UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
ATOMIZACIÓN DE EXTRACTO ANTOCIÁNICO DE FLORES DE MASTUERZO (Tropaeolum majus L.) PARA SU USO EN
SALCHICHAS TIPO FRANKFURT
TESIS
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE:
INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
PRESENTADO POR LOS BACHILLERES:
AGUILAR QUISPE, LUIS ANTHONY CARCAUSTO CAMPOS, KAREM
HUANCAYO-PERÚ 2017
i JURADO EXAMINADOR
Dr. Hermes Amadeo Rosales Papa Presidente
Dra. Clara Raquel Espinoza Silva Jurado
Dra. Mary Porras Osorio Jurado
M. Sc. Luis Artica Mallqui Jurado
Ing. Wagner Vasquez Orihuela Secretario
ii
ASESORA
Dra. CLARA RAQUEL ESPINOZA SILVA
iii DEDICATORIA
A Dios por guiar cada uno de mis pasos, a mis padres Jorge y Lidia por su amor y apoyo incondicional, siempre guiándome por el buen camino brindándome un consejo y su confianza, a mis hermanas Milagros y Rocio por lograr siempre una sonrisa en los momentos más difíciles, a mi inseparable compañera Karem por su amor incondicional y demostrarme que todo se puede en esta vida si nos lo proponemos, es así que decidimos emprender este proyecto de investigación que con mucho sacrificio se ha culminado, quiero finalizar agradeciendo a cada uno de mis amigos y maestros de la F.A.I.I.A por estar al pendiente del proyecto.
Luis Anthony Aguilar Quispe
A Dios por darme la vida, por guiar cada día mis pasos, por ayudarme a superar dificultades y por permitirme culminar una de mis metas como el presente trabajo; a mis padres Elias y Victoria por siempre brindarme su apoyo incondicional, por darme formación académica, valores y por su amor; a mis abuelitos por siempre ofrecerme sus consejos y experiencias; a mi inseparable compañero, cómplice y más que un amigo con quién un día decidimos tomar juntos un reto de culminar con este proyecto, gracias amor por todo y más por tu paciencia; a toda mi familia y amigos quienes calaron un pedacito de mi corazón con su amistad.
Karem Carcausto Campos
iv AGRADECIMIENTOS
A Dios por darnos vida y por presentarnos la gran oportunidad para haberse realizado el presente trabajo, habiéndonos ofrecido tanto apoyo por medio de muchas personas, por habernos permitido nunca rendirnos ante las dificultades presentadas y por darnos sabiduría, inteligencia y fortaleza.
A nuestros queridos padres que siempre estuvieron a nuestro lado en todo momento dándonos fuerzas, ánimos y alentándonos, quienes nos dieron la oportunidad de tener una educación en el trascurso de nuestras vidas, sobre todo por ser ejemplos de vida.
A nuestros hermanos por ser parte de nuestras vidas y por representar la unidad familiar, con quienes hemos compartido desde nuestra niñez.
A la Dra. Clara Raquel Espinoza Silva, por el asesoramiento, orientación, apoyo y por brindarnos su amistad para el logro de este trabajo de investigación. Gracias Ingeniera Clarita por creer en nosotros, y por brindarnos todas las facilidades que nos fueron otorgadas en el laboratorio de la estación experimental El Mantaro (Jauja-Junín), por darnos la oportunidad de crecer profesionalmente y aprender cosas nuevas.
A la Ing. Yesenia María Ugarte Melendez por facilitarnos el laboratorio de Control de calidad y por su amistad en los momentos complicados y de dificultades.
A los jurados por su tiempo y dedicación empleados al revisar el presente trabajo de investigación.
A todos nuestros docentes, por brindarnos sus conocimientos y experiencia profesional.
A nuestros amigos por confiar, creer en nosotros y por brindarnos su amistad en la etapa universitaria, un trayecto hermoso que nunca olvidaremos.
A todas las personas que de alguna manera u otra colaboraron con la culminación de nuestra tesis.
A nuestra Alma Mater “Universidad Nacional del Centro del Perú”, a la cual llevaremos siempre en nuestros corazones.
v RESUMEN
La atomización de un extracto antociánico concentrado a partir de los pétalos anaranjados de flores de mastuerzo (Tropaeolum majus L.) para su uso como sustitución de nitrito de sodio en salchichas tipo Frankfurt, se realizó determinando el contenido de antocianina monomérica (mg de pelargonidina-3-glucosido/100 g de muestra), en los pétalos anaranjados de mastuerzo (Tropaeolum majus L.) en estado fresco con 94,82 mg/100 g y seco con 771,22 mg/100 g, en extracto concentrado con 186,94 mg/100 mL, en extracto atomizado de 464,16 a 1100,43 mg/100 g mostrando diferencia significativa (p<0,05) en los tratamientos con maltodextrina al 9 %, 16 % y 23
% y temperatura de aire de entrada a 110 °C, 130 °C y 150°C , en salchichas tipo Frankfurt después de escaldado de 0,09 a 0,55 mg/100 g mostrando diferencia significativa (p<0,05) en la sustitución en mg de nitrito de sodio al 100 %, 75 % y 50 % por mg de antocianina del extracto atomizado que ofreció mayor antocianina monomérica y capacidad antioxidante. Respecto a la capacidad antioxidante (µmol equivalente trolox/g de muestra), se determinó en los pétalos en estado fresco con 96,96 µmol/g y seco con 158,89 µmol/g, en extracto concentrado con 9,88 µmol/mL, en extracto atomizado de 816,31 a 1570,72 µmol/g mostrando diferencia significativa (p<0,05) en los tratamientos con maltodextrina y temperatura de aire de entrada, en salchichas tipo Frankfurt después de escaldado de 9,25 a 20,30 µmol/g evidenciando diferencia significativa (p<0,05) en las tres sustituciones de nitrito de sodio comparado a una muestra testigo sin adición de extracto atomizado.
Palabras clave: Atomización, antocianina, mastuerzo, salchicha.
vi ÍNDICE
DEDICATORIA ... iii
AGRADECIMIENTOS ... iv
RESUMEN ... v
ÍNDICE ... vi
ÍNDICE DE TABLAS ... xi
ÍNDICE DE FIGURAS ... xiii
I. INTRODUCCIÓN ... 1
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ... 3
2.1. Mastuerzo (Tropaeolum majus L.) ... 3
2.1.1. Clasificación taxonómica del mastuerzo ... 4
2.1.2. Composición química del mastuerzo ... 4
2.1.3. Partes importantes del mastuerzo ... 5
2.1.4. Aplicaciones del mastuerzo ... 5
2.1.5. Químico proximal de los pétalos anaranjados de mastuerzo ... 5
2.1.6. Características fisicoquímicas de los pétalos anaranjados de mastuerzo ... 6
2.2. Principios fitoquímicos del mastuerzo ... 7
2.2.1. Compuestos fenólicos ... 7
2.2.2. Flavonoides ... 8
2.2.3. Antocianinas ... 8
2.2.4. Factores que afectan la estabilidad de las antocianinas ... 11
2.2.5. Determinación de antocianina monomérica por el método pH diferencial ... 16
2.2.6. Capacidad antioxidante... 16
2.2.7. Determinación de la actividad antioxidante mediante espectrofotometría UV-Vis y radical DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) ... 18
2.3. Tamizaje fitoquímico del mastuerzo ... 18
2.4. Estrés oxidativo y radicales libres ... 19
2.4.1. Estrés oxidativo ... 19
2.4.2. Radicales libres ... 20
2.4.3. Mecanismo de oxidación inducido por radicales libres ... 21
2.5. Extracción ... 22
2.5.1. Extracción sólido-líquido (lixiviación) ... 22
2.5.2. Factores en el lixiviado ... 23
vii 2.5.3. Separación de compuestos inestables mediante PVPP
(polivinilpolipirrolidona) ... 26
2.5.4. Concentración al vacío ... 28
2.6. Microencapsulación ... 30
2.6.1. Agente encapsulante ... 30
2.6.2. Maltodextrina ... 31
2.6.3. Secado por aspersión o atomización (Mini Spray Dryer B-290) ... 32
2.6.4. Antocianinas y capacidad antioxidante en polvo atomizado ... 36
2.7. Pigmentos naturales ... 37
2.8. Embutidos ... 38
2.8.1. Embutidos escaldado ... 38
2.8.2. Requisitos específicos para la elaboración de embutidos escaldados.. 38
2.8.3. Salchicha tipo Frankfurt ... 39
2.8.4. Requisitos de composición ... 39
2.8.5. Funciones de los insumos usados en embutidos ... 39
2.8.6. Nitritos y nitratos... 41
2.8.7. Formación de metamioglobina... 46
2.8.8. Formación de metahemoglobina ... 46
2.8.9. Formación de nitrosaminas ... 47
2.8.10. Botulismo ... 48
2.8.11. Rancidez oxidativa ... 48
2.8.12. Investigaciones sobre la carne roja y productos procesados ... 49
2.8.13. Actividad de captación de radicales en productos cárnicos ... 49
2.9. Espacio de Color Lab ... 50
2.9.1. CIE Lab ... 50
2.9.2. Diferencia de color ... 51
2.9.3. Tolerancia de color ... 51
2.10. Análisis sensorial ... 51
2.10.1. Contraste de Kolmogorov-Smirnov-Lilliefors... 52
2.10.2. Prueba de Kruskal-Wallis ... 52
III. MATERIALES Y MÉTODOS ... 53
3.1. Lugar de investigación ... 53
3.2. Materia prima ... 53
3.2.1. Unidad experimental ... 53
3.2.2. Procedencia ... 53
viii
3.3. Materiales, insumos, equipos, instrumentos y reactivos ... 54
3.3.1. Materiales ... 54
3.3.2. Insumos ... 55
3.3.3. Equipos e instrumentos... 55
3.3.4. Reactivos ... 56
3.4. Metodología ... 57
3.4.1. Métodos para la obtención del extracto antociánico y extracto atomizado ... 57
3.4.2. Preparación de las salchichas tipo Frankfurt... 63
3.4.3. Cuantificación de antocianinas monoméricas ... 70
3.4.4. Determinación de capacidad antioxidante por DPPH• (TEAC)... 72
3.4.5. Caracterización de los pétalos anaranjados de mastuerzo ... 74
3.4.6. Caracterización del extracto concentrado ... 74
3.4.7. Caracterización del extracto atomizado ... 74
3.4.8. Determinación granulométrica en los pétalos secos de mastuerzo ... 75
3.4.9. Análisis químico proximal y fisicoquímico (AOAC, 1994) de las salchichas tipo Frankfurt ... 75
3.4.10. Análisis microbiológico de las salchichas tipo Frankfurt ... 76
3.4.11. Determinación de color en los extractos atomizados y salchichas tipo Frankfurt ... 78
3.4.12. Análisis sensorial de las salchichas tipo Frankfurt ... 79
3.5. Diseño experimental ... 80
3.5.1. Diseño experimental (DCA) para los extractos atomizados... 80
3.5.2. Diseño experimental (DCA) para las salchichas tipo Frankfurt ... 80
3.6. Análisis estadístico ... 81
3.6.1. Modelo aditivo lineal para los extractos atomizados: ... 81
3.6.2. Modelo aditivo lineal para las salchichas tipo Frankfurt: ... 82
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES ... 83
4.1. Caracterización de los pétalos y extracto concentrado de flores anaranjadas de mastuerzo ... 83
4.1.1. Características fisicoquímicas de los pétalos anaranjados de mastuerzo ... 83
4.1.2. Antocianinas monoméricas de los pétalos anaranjados de mastuerzo fresco y seco ... 84
ix 4.1.3. Capacidad antioxidante de los pétalos anaranjados de mastuerzo fresco
y seco ... 86
4.1.4. Caracterización del extracto concentrado ... 88
4.2. Resultados y caracterización del extracto atomizado ... 90
4.2.1. Antocianina monomérica del extracto atomizado ... 90
4.2.2. Capacidad antioxidante (TEAC) del extracto atomizado. ... 92
4.2.3. Humedad en extracto atomizado ... 95
4.2.4. Solubilidad del extracto atomizado ... 97
4.2.5. Higroscopicidad del extracto atomizado ... 99
4.2.6. Densidad aparente del extracto atomizado ... 100
4.2.7. Colorimetría del extracto atomizado ... 102
4.3. Resultados y caracterización de la salchicha tipo Frankfurt... 104
4.3.1. Antocianina monomérica de la salchicha tipo Frankfurt ... 104
4.3.2. Capacidad antioxidante en salchicha tipo Frankfurt... 106
4.3.3. Colorimetría y diferencia (ΔE*) de las salchichas tipo Frankfurt antes de escaldado (Ae) y después de escaldado (De) ... 108
4.3.4. Caracterización fisicoquímica de la salchicha tipo Frankfurt ... 111
4.3.5. Análisis químico proximal de las salchichas tipo Frankfurt ... 112
4.3.6. Análisis microbiológico de las salchichas tipo Frankfurt ... 112
4.3.7. Análisis sensorial por la escala hedónica ... 114
V. CONCLUSIONES ... 117
VI. RECOMENDACIONES ... 118
VII. BIBLIOGRAFÍA ... 119
VIII. ANEXOS ... 133
8.1. Preparación de tampón cloruro de potasio 0,025 M; pH 1.0 y tampón acetato de sodio 0,4 M; pH 4.5 ... 133
8.2. Preparación del radical DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) 0,1 mM ... 133
8.3. Preparación de la curva de calibración trolox (Ácido-6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico) con el radical DPPH• ... 134
8.4. Cuantificación de antocianinas en diferentes solventes después de 24 horas de maceración en refrigeración a 4 °C ... 137
8.5. Balance de materia, rendimiento y coeficiente técnico para la obtención del extracto antociánico ... 137
8.6. Rendimiento del proceso de atomización del extracto antociánico ... 138
x 8.7. Balance de materia, rendimiento y coeficiente técnico para la obtención
salchicha tipo Frankfurt ... 138
8.8. Encuesta para prueba sensorial ... 139
8.9. NTS N° 071-Minsa/Digesa-v.01. ... 140
8.10. Requisitos de composición para la salchicha tipo Frankfurt ... 140
8.11. Ficha técnica de la sal de cura ... 141
8.12. Datos Técnicos del mini Spray Dryer B-290 ... 142
8.13. Determinación del módulo de finura de los pétalos molidos de mastuerzo 142 8.14. Fotografías de la investigación ... 143
xi ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación taxonómica del mastuerzo (Tropaeolum majus Linnaeus). ... 4
Tabla 2. Principales componentes químicos de Tropaeolum majus L. ... 4
Tabla 3. Químico proximal de los pétalos anaranjados frescos de mastuerzo. ... 6
Tabla 4. Características fisicoquímicas de los pétalos anaranjadas del mastuerzo (Tropaeolum majus L.) ... 6
Tabla 5. Antocianinas en algunas matrices alimenticias en base húmeda. ... 8
Tabla 6. Sustituyentes de las antocianinas. ... 9
Tabla 7. Capacidad antioxidante en algunas matrices alimenticias. ... 17
Tabla 8. Tamizaje fitoquímico de extractos de mastuerzo (Tropaeolum majus L.) ... 19
Tabla 9. Dosis máximas de PVPP (polivinilpolipirrolidona) en algunos alimentos. ... 27
Tabla 10. Lista de disolventes y sus parámetros. ... 29
Tabla 11. Características de algunos materiales encapsulantes usados en la microencapsulación de aditivos alimenticios. ... 30
Tabla 12. Variación de las propiedades funcionales de las maltodextrinas y los jarabes en función al contenido de dextrosa equivalente (DE). ... 32
Tabla 13. Contenido de antocianinas y capacidad antioxidante en atomización de muestras por spray drying, los cuales mostraron mejores resultados. ... 36
Tabla 14. Clasificación de los colorantes naturales según su naturaleza química. ... 37
Tabla 15. Requisitos mínimos y máximos en embutidos escaldados. ... 38
Tabla 16. Requisitos de composición para la salchicha tipo Frankfurt. ... 39
Tabla 17. Extracto de la Directiva (2006) del Parlamento Europeo en relación con el nitrito y nitrato de productos cárnicos. ... 45
Tabla 18. Formulación de las salchicha tipo Frankfurt con diferentes sustituciones de extracto atomizado. ... 64
Tabla 19. Cantidad de nitrito de sodio por extracto atomizado de mastuerzo en base a 100 g de carne de cerdo para las diferentes sustituciones. ... 67
Tabla 20. Dilución de las muestras para análisis, con los respectivos tampones. ... 71
Tabla 21. Características fisicoquímicas de los pétalos anaranjados de mastuerzo fresco. ... 83
Tabla 22. Antocianina monomérica de los pétalos anaranjados de mastuerzo fresco y seco. ... 84
Tabla 23. TEAC de los pétalos anaranjados de mastuerzo fresco y seco. ... 86
Tabla 24. Características del extracto antociánico concentrado. ... 88
Tabla 25. Contenido de antocianinas monomérica del extracto atomizado. ... 90
xii
Tabla 26. TEAC del extracto atomizado. ... 93
Tabla 27. Porcentaje de humedad del extracto atomizado. ... 95
Tabla 28. Porcentaje de solubilidad del extracto atomizado. ... 97
Tabla 29. Porcentaje de higroscopicidad del extracto atomizado. ... 99
Tabla 30. Porcentaje de densidad aparente del extracto atomizado. ... 101
Tabla 31. Valores L* a* y b* de los diferentes extractos atomizados. ... 102
Tabla 32. Contenido de antocianina monomérica en las diferentes sustituciones y testigo de salchichas tipo Frankfurt. ... 104
Tabla 33. TEAC de las salchichas tipo Frankfurt. ... 106
Tabla 34. Colorimetría de la salchicha. ... 109
Tabla 35. Resultados fisicoquímicos de la salchicha tipo Frankfurt. ... 111
Tabla 36. Resultados del análisis químico proximal de la salchicha tipo Frankfurt. ... 112
Tabla 37. Resultados de los análisis microbiológicos al día 1, 7 y 15. ... 113
Tabla 38. Resultados prueba de normalidad. ... 115
Tabla 39. Resultados de la Prueba de Kruskal Wallis con variable de agrupación de las sustituciones. ... 115
Tabla 40. Rangos de Kruskal Wallis para la evaluación de color, olor, sabor y textura. ... 116
Tabla 41. Diferentes concentraciones de trolox. ... 134
Tabla 42. Datos de la curva de calibración trolox. ... 135
Tabla 43. Contenido de antocianinas en diferentes solventes. ... 137
Tabla 44. Balance de materia y rendimiento para la obtención del extracto antociánico. ... 137
Tabla 45. Rendimiento de los extractos atomizados. ... 138
Tabla 46. Balance de materia y rendimiento en la elaboración de las salchichas tipo Frankfurt (muestra testigo). ... 138
Tabla 47. Rendimiento y coeficiente técnico en las diferentes sustituciones de nitrito de sodio por extracto atomizado de las salchichas tipo Frankfurt. ... 139
Tabla 48. Módulo de finura para los pétalos molidos de mastuerzo. ... 142
xiii ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Planta de mastuerzo (Tropaeolum majus L.) ... 3
Figura 2. Estructura básica de las antocianinas. ... 8
Figura 3. Estructura del grupo flavilo... 9
Figura 4. Ruta general de biosíntesis de las antocianinas. ... 10
Figura 5. Estructura predominante de antocianina a diferentes niveles de pH... 11
Figura 6. Las cuatro estructuras de antocianinas presentes en disolución ácida acuosa a temperatura ambiente. ... 12
Figura 7. Mecanismo de degradación de la antocianidina 3,5-diglicósido y de la antocianidina 3-diglucósido. R3’, R5' = OH, -H, -OCH3 o -OGL; GL = grupo glucosilo. ... 13
Figura 8. Formación de complejo a través de interacción intermolecular. ... 15
Figura 9. Características espectrales de antocianinas purificadas de rábano (acilados derivados pelargonidina-3-sophoroside-5-glucósido) en pH 1,0 y pH 4,5. .... 16
Figura 10. Estabilización de un radical libre por donación de un átomo de hidrogeno. 17 Figura 11. Estabilización de un radical libre por transferencia electrónica. ... 17
Figura 12. Estructura del DPPH• antes y después de la reacción con el antioxidante. 18 Figura 13. Célula invadida por los radicales libres (RL). ... 20
Figura 14. Antioxidante cediendo un electrón al radical libre (RL). ... 20
Figura 15. Iniciación de la peroxidación lipídica por el radical R•. ... 21
Figura 16. Ataque de radical peroxilo a un ácido graso. ... 22
Figura 17. PVPP (polivinilpolipirrolidona). ... 26
Figura 18. Esquema de las partes principales en el sistema del rotavapor. ... 28
Figura 19. Estructura de la maltodextrina. ... 31
Figura 20. Evolución de la temperatura de la gota durante el secado. ... 33
Figura 21. Principio de funcionamiento del atomizador B-290. ... 34
Figura 22. Principio de funcionamiento para la muestra de alimentación y dispersión. 34 Figura 23. Parámetros de los procesos del mini secador BÜCHI B-290. ... 35
Figura 24. Secuencia de reacciones para obtener nitrosilhemocromo. ... 43
Figura 25. Reacciones de oxidación y reducción de la mioglobina. ... 46
Figura 26. Medición del color de una manzana. ... 50
Figura 27. Diferencia total de color entre las tres coordenadas. ... 51
Figura 28. (a) flor de mastuerzo, (b) pétalos de mastuerzo. ... 53
Figura 29. (a) y (b) terreno con flores de mastuerzo. ... 54
xiv Figura 30. Diagrama de flujo para la obtención de extracto antociánico y extracto
atomizado. ... 57
Figura 31. Pétalos secos de mastuerzo en bolsas de polipropileno. ... 58
Figura 32. Frascos con la mezcla I (pétalos triturados y solución etanol-agua) en refrigeración. ... 59
Figura 33. Extracto antociánico en el matraz de evaporación. ... 60
Figura 34. Frascos contenidos con extracto antociánico... 61
Figura 35. Envase con maltodextrina 10 DE. ... 61
Figura 36. Obtención del extracto atomizado en el proceso de atomización. ... 62
Figura 37. Frascos contenidos con extracto atomizado de los diferentes tratamientos. ... 62
Figura 38. Diagrama de flujo para la obtención de las salchichas tipo Frankfurt. ... 63
Figura 39. Obtención de carne molida por la moledora. ... 65
Figura 40. Mezclado de insumos en la cutter para la salchicha tipo Frankfurt. ... 65
Figura 41. Paquetes de salchichas de las diferentes sustituciones en la refrigeradora. ... 67
Figura 42. Diagrama de flujo del extracto acuoso de la salchicha tipo Frankfurt. ... 68
Figura 43. Separación de grasa en la salchicha tipo Frankfurt. ... 69
Figura 44. (a) y (b) filtrado del extracto acuoso de la salchicha tipo Frankfurt. ... 69
Figura 45. (a)Tampón cloruro de potasio y (b) tampón acetato de sodio. ... 70
Figura 46. Celdas de cuarzo conteniendo DPPH• y trolox (100–1000 µM). ... 72
Figura 47. Diluciones de muestra de salchicha. ... 77
Figura 48. Placas PetrifilmTM inoculadas e incubadas con muestras de salchichas tipo Frankfurt. ... 78
Figura 49. Colorímetro Konica Minolta. ... 78
Figura 50. Aplicación del análisis sensorial. ... 79
Figura 51. Diseño experimental para los extractos atomizados. ... 80
Figura 52. Diseño experimental para las salchichas tipo Frankfurt. ... 80
Figura 53. Comparación de medias por el contenido de antocianina monomérica entre pétalos anaranjados de mastuerzo en base seca. ... 85
Figura 54. Comparación de medias de la capacidad antioxidante entre pétalos anaranjados de mastuerzo fresco y seco en base seca. ... 87
Figura 55. Comparación de medias del contenido de antocianinas de los 9 tratamientos de extracto atomizado. ... 91
xv Figura 56. Comparación de medias de capacidad antioxidante de los 9 tratamientos de
extracto atomizado. ... 94
Figura 57. Comparación de medias del porcentaje de humedad de los 9 tratamientos de extracto atomizado. ... 96
Figura 58. Comparación de medias del porcentaje de solubilidad de los 9 tratamientos de extracto atomizado. ... 98
Figura 59. Comparación de medias del porcentaje de higroscopicidad de los 9 tratamientos de extracto atomizado. ... 100
Figura 60. Comparación de medias de densidad aparente de los 9 tratamientos de extracto atomizado. ... 101
Figura 61. Comparación de medias de los valores L* a* y b* de los extractos atomizados. ... 103
Figura 62. Comparación de medias de antocianinas entre las diferentes sustituciones y testigo de las salchichas tipo Frankfurt. ... 105
Figura 63. Comparación de medias de la capacidad antioxidante de la salchicha testigo y las sustituciones S1, S2 y S3. ... 107
Figura 64. Solución de trabajo DPPH•. ... 133
Figura 65. Preparación de las diferentes concentraciones de trolox (100-1000 µM). 134 Figura 66. Curva de calibración trolox... 135
Figura 67. Medición de la absorbancia de las diferentes concentraciones de trolox en el espectrofotómetro... 136
Figura 68. Variación de color producto de la reacción entre el DPPH• con las diferentes concentraciones de trolox. ... 136
Figura 69. Ficha de evaluación sensorial. ... 139
Figura 70. Norma técnica peruana N° 071... 140
Figura 71. Requisitos de composición de salchicha. ... 140
Figura 72. Ficha técnica curasal. ... 141
Figura 73. Datos técnicos del mini Spray Dryer B-290. ... 142
Figura 74. Recolección de flores de mastuerzo en la estación experimental El Mantaro. ... 143
Figura 75. Secado de los pétalos de mastuerzo. ... 143
Figura 76. Triturado y acondicionamiento para la obtención del extracto antociánico de los pétalos secos de mastuerzo. ... 143
Figura 77. Determinación granulométrica de los pétalos triturados de mastuerzo seco. ... 144
xvi Figura 78. Solución de extracción en contacto con los pétalos triturados de mastuerzo.
... 144
Figura 79. Centrifugado y filtrado para la obtención del extracto antociánico. ... 145
Figura 80. Concentración del extracto antociánico. ... 145
Figura 81. Retención de compuestos inestables con PVPP (polivinilpolipirrolidona). 146 Figura 82. Secado por atomización del extracto antociánico. ... 146
Figura 83. Determinación de humedad en los extractos atomizados. ... 146
Figura 84. Determinación de solubilidad en los extractos atomizados. ... 147
Figura 85. Determinación de higroscopicidad en los extractos atomizados. ... 147
Figura 86. Determinación del contenido de antocianina monomérica en los extractos atomizados. ... 147
Figura 87. Determinación de la capacidad antioxidante en los extractos atomizados. ... 148
Figura 88. Preparación y empacado al vacío de las salchichas tipo Frankfurt. ... 149
Figura 89. Salchichas tipo Frankfurt en refrigeración. ... 150
Figura 90. Determinación microbiológica en las salchichas tipo Frankfurt. ... 150
Figura 91. Colorimetría en las salchichas tipo Frankfurt antes y después de escaldado. ... 151
Figura 92. Caracterización en las salchichas tipo Frankfurt. ... 151
1 I. INTRODUCCIÓN
La investigación consiste en obtener un extracto antociánico atomizado, a partir de los pétalos anaranjados de las flores de mastuerzo (Tropaeolum majus L.), cuyo uso es aplicado como sustitución de nitrito de sodio en salchichas tipo Frankfurt; los pétalos son provenientes de la estación experimental El Mantaro (provincia: Jauja-Junín-Perú), ubicado a una altitud de 3200 m.s.n.m.
Los pétalos una vez separados de las flores fueron secados a temperatura ambiente (15-18 °C) y en condiciones de oscuridad, posteriormente fueron sometidos a un proceso de extracción (lixiviación) con solución etanol:agua (1:1) acidificado con ácido cítrico al 0,03 % (p/v) durante 24 horas en condiciones de frio a 4 °C, luego centrifugado a 4000 rpm por 15 minutos, en seguida se separó el extracto del bagazo por medio de filtrado y concentrado en rotavapor a 40 °C y 250 mbar. El extracto concentrado fue separado de componentes inestables aplicando PVPP (polivinilpolipirrolidona), a continuación se mezcló con maltodextrina (10 DE) como encapsulante al 9 %, 16 % y 23 % de concentración (p/p) y atomizado a temperaturas de aire de entrada 110 °C, 130
°C y 150 °C. Al ser obtenidos los extractos atomizados estos fueron evaluados por su contenido de antocianinas por el método pH diferencial (Giusti y Wrolstad, 2001) y capacidad antioxidante por el método DPPH• (Brand-Williams et al. (1995) con modificaciones por Kim et al. (2002)), siendo el tratamiento a Tr1 (9 % y 110 °C) con mayor contenido de antocianina y capacidad antioxidante de entre los nueve tratamientos. Se aplicó éste extracto atomizado en la elaboración de salchichas tipo Frankfurt, sustituyendo el nitrito de sodio al 100 %, 75 % y 50 % por extracto atomizado, luego se volvió a evaluar el contenido de antocianinas y capacidad antioxidante en el producto salchicha después de escaldado.
Este trabajo de investigación se desarrolló en gran medida porque actualmente existe la tendencia por el consumo de productos naturales (Siva, 2007) que pueden incorporarse a los productos cárnicos procesados como alternativa de reemplazo de aditivos sintéticos inhibiendo la oxidación, actuando como antioxidantes para así minimizar el deterioro ocasionado por oxidación lipídica (Halliwell y Chirico, 1993). Los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación ofrecerán a los industrializadores de embutidos cárnicos una alternativa saludable para los consumidores.
2 A razón de lo señalado se planteó los siguientes objetivos:
Objetivo general:
Obtener extracto atomizado a partir de los pétalos anaranjados de mastuerzo (Tropaeolum majus L.) como alternativa de sustitución de nitrito de sodio en salchichas tipo Frankfurt.
Objetivos específicos:
Evaluar el contenido de antocianina monomérica y capacidad antioxidante en los extractos atomizados.
Determinar el contenido de humedad, solubilidad, higroscopicidad, densidad aparente y color en los extractos atomizados.
Evaluar el contenido de antocianina monomérica y capacidad antioxidante en salchichas tipo Frankfurt.
Determinar las propiedades sensoriales, carga microbiana y color en las salchichas tipo Frankfurt.
3 II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Mastuerzo (Tropaeolum majus L.)
Mastuerzo (Tropaeolum majus L.) es una planta de crecimiento rápido, originaria de las montañas de los andes de América del Sur, donde crece todo el año. Esta planta es conocida por sus propiedades ornamentales y también porque sus hojas y flores son comestibles y se utilizan en ensaladas, en los que imparten un sabor picante debido a la presencia de glucosinolatos. Las flores son generalmente de color amarillo, rojo o anaranjado, este último es el más común (Jens y Birger, 1993 citado en Garzón & Wrolstad, 2009).
La planta se ha utilizado en la medicina herbal andino como desinfectante, cicatrizante de heridas, antibiótico, expectorante para aliviar las condiciones de pecho y antiescorbuto. La actividad contra el cáncer se ha atribuido a los extractos de la planta y en un estudio reciente, las flores y las hojas de Tropaeolum majus L. fueron reportados como excelentes fuentes alimenticias de luteína (Niizu y Rodríguez, 2005).
Figura 1. Planta de mastuerzo (Tropaeolum majus L.)
Fuente: Curtis, 1787.
4 2.1.1. Clasificación taxonómica del mastuerzo
La clasificación taxonómica del mastuerzo fue realizada por el sueco Carl Von Linneo, el cual menciona que la planta es originaria del Perú.
Tabla 1. Clasificación taxonómica del mastuerzo (Tropaeolum majus Linnaeus).
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Sub clase: Rosidae Orden: Brassicales Familia: Tropaeolaceae Género: Tropaeolum
Especie: Tropaeolum majus L.
Fuente: Linneo, 1753.
2.1.2. Composición química del mastuerzo
Ghedira y Goetz (2013), mencionan la lista de componentes químicos que contiene el mastuerzo, ésta se presentada en la tabla 2.
Tabla 2. Principales componentes químicos de Tropaeolum majus L.
Componente Componentes químicos Glucosinolatos Glucotropaeoline
Flavonoides Quercetina, kaempferol, isoquercitrina.
Antocianidinas Delfinidina, cianidina, pelargonidina, pelargonidina-3-soforosa
Ácidos fenólicos
Ácido: p-hidroxibenzoico, p- hidroxifenilacético, vinílico, gentisico, protocatequico, siríngico, p-cumárico, ferúlico, caféico, Sinápico, clorogénico, quínico
Polisacáridos Xiloglucano, restos de β-D galactosa Pigmentos Carotenoides, luteína, zeaxantina Fracción volátil Isocianato de bencilo, tiocarbonato de
S-dietilo
Enzimas Mirosinasa (hidroliza en tiocianatos, isocianatos y nitrilos)
Vitaminas Vitamina C
Fuente: Ghedira y Goetz, 2013.
5 Los glucosinolatos son inocuos, pero cuando la planta está siendo devorada por un animal o digerida por un rumiante, enzimas como la mirosinasa (que se encuentra separada físicamente de los glucosinolatos) entra en contacto con estos compuestos, generando glucosa, ácido sulfúrico y compuestos volátiles (Burow et al., 2007).
2.1.3. Partes importantes del mastuerzo
Nanzi (1999) describe las partes importantes del mastuerzo:
Hojas: orbiculares, peltadas, con el limbo entero o ligeramente lobulado, de 4 a 10 cm de diámetro, verde-glaucas; pecíolos largos y enrollados en espiral.
Flores: solitarias amarillas, anaranjadas o rojizas, de 3 a 4 cm de diámetro; cáliz amarillento, más corto que la corola y prolongado hacia atrás en un espolón de 2 a 3 cm de largo.
Pétalos: enteros, unguiculados, los tres inferiores más angosto y con las uñas laciniadas.
Fruto: subcarnoso, de 1 a 1,5 cm de diámetro, depreso globoso y con tres ángulos redondeados.
2.1.4. Aplicaciones del mastuerzo
El mastuerzo se utiliza como tratamiento para las vías respiratorias superiores, enfermedades del tracto urinario, externamente en dermatología, cosmetología para el tratamiento de enfermedades de la piel, uñas y cabello (caspa con picor y descamación), quemaduras solares, quemaduras superficiales, dermatitis del pañal (Bazylko et al., 2013) y en la gastronomía (Lara et al., 2013). Además, la hierba puede ser una materia prima para la producción de productos nutracéuticos. Igualmente, son no tóxicos para los seres humanos, lo que permite la etapa de la eliminación completa de disolvente posiblemente tóxico (Bazylko et al., 2013).
2.1.5. Químico proximal de los pétalos anaranjados de mastuerzo
En la tabla 3 se indica la cantidad en porcentaje del químico proximal de los pétalos anaranjados de mastuerzo en estado fresco recolectados en el departamento de Junín.
6 Tabla 3. Químico proximal de los pétalos anaranjados frescos de
mastuerzo.
Componente Contenido (%)
a b
Humedad 91,83 91,10
Ceniza 0,60 0,81
Proteína 1,31 1,41
Grasa 0,02 0,03
Fibra 1,03 1,07
Carbohidratos 5,21 5,58
Fuente: a Veliz, 2006, b Choque y Corilla, 2015.
2.1.6. Características fisicoquímicas de los pétalos anaranjados de mastuerzo
En la tabla 4 se señala la lista de características fisicoquímicas de los pétalos anaranjados del mastuerzo, reportados en Brasil y Perú.
Tabla 4. Características fisicoquímicas de los pétalos anaranjadas del mastuerzo (Tropaeolum majus L.)
Características Pétalo anaranjado
de mastuerzo
Vitamina C (mg/100 g) 59,17
pH 5,73
5,68 a Acidez titulable (% de ác. cítrico) 1,14 1,15 a
Sólidos solubles 5,83
5,80 a Azúcares reductores (g glucosa/100 g) 30,45 Azúcares no reductores (g
sacarosa/100 g)
10,47 Carotenoides totales (μg/100 g) 291,94 Antocianinas totales (mg/100 g) 78,36
80,32 a Flavonoides totales (mg/100 g) 134,76
Fuente: Souto et al., 2012, a Choque y Corilla, 2015.
7 2.2. Principios fitoquímicos del mastuerzo
2.2.1. Compuestos fenólicos
Químicamente los compuestos fenólicos se definen como aquellos compuestos orgánicos, formado con uno o más anillos aromáticos y que por lo menos un anillo tenga un grupo hidroxilo (Martínez de Toda, 2016).
Los compuestos fenólicos forman un grupo de unos 10000 compuestos químicamente heterogéneos (Taiz y Zeiger, 2006). Existen dos grandes grupos: los ácidos fenólicos (benzoico y cinámicos) y los flavonoides (flavonoides, antocianinas y taninos) (Badui, 2006).
Los fenoles juegan un papel importante en la defensa de las plantas frente a los herbívoros o patógenos, en la función de soporte mecánico, en la atracción de polinizadores, en la absorción de rayos UV (Taiz y Zeiger, 2006).
Según Gimeno (2004) la estructura química de los compuestos fenólicos se dividen en 2 grandes grupos:
No flavonoides
Entre ellos hay dos subgrupos:
Fenoles no carboxílicos: C6, C6-C1, C6-C3.
Ácidos fenólicos: derivados del ácido benzoico C6-C1 y derivados del ácido cinámico C6-C3.
Flavonoides (C6-C3-C6)
Formados por 2 grupos bencénicos unidos por un puente tricarbonado o anillo heterocíclico. Subgrupos:
Antocianos.
Flaconas, flavononas, flavanoles y flavanonoles.
Flavanoles, taninos condensados y lignanos.
8 2.2.2. Flavonoides
Los flavonoides son compuestos fenólicos, cuya estructura básica es el aglucón que está formado por dos anillos bencénicos (A y B) y uno heterocíclico con oxígeno (C) formando un núcleo fenil-2-benzopirona (Robbins, 2003 citado por Paladino, 2008).
Figura 2. Estructura básica de las antocianinas.
Fuente: Badui, 2006.
2.2.3. Antocianinas
Las antocianinas (del griego anthos, flor y kyanos, azul) se consideran una subclase de compuestos vegetales no nitrogenados perteneciente a los flavonoides. Producen colores rojo, anaranjado, azul y púrpura principalmente en frutas y flores (Badui, 2006).
Tabla 5. Antocianinas en algunas matrices alimenticias en base húmeda.
Matriz fresca Nombre científico Estándar mg/100 g Arándano rojo Vaccinium parvifolium cy-3-glu 34,000 a Uva de vid Vitis vinifera cy-3-glu 30 a 750 b Fresa Fragaria anannassa pgd-3-glu 71,800 c Oca púrpura Oxalis tuberosum cy-3-glu 15,120 d Pétalos de
mastuerzo anaranjado
Tropaeolum majus L
pgd-3-glu cy-3-glu
-
72,000 e 80,320 f 78,360 g Salchicha con 0.3 %
de extracto de cereza
Prunusavium L cy-3-glu 0,456 h
Fuente: a Moyer et al., 2002. b Bridle y Timberlake, 1996. c Fan y Wrolstad, 2005. d Gamarra, 2011. e Garzón y Wrolstad, 2009. f Choque y Corilla, 2015. g Souto et al., 2012. h Isaza, Gil, López, Ochoa y Restrepo, 2012.
9 a. Estructura química
Las antocianinas son glucósidos de las antocianidinas (pelargonidina, delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina y malvidina), es decir es la unión por medio de un enlace glucosídico de una antocianidina que es el aglucón, cuya estructura básica es el ion flavilio, con una fracción de azúcar o azúcares como la glucosa, ramnosa, galactosa, xilosa y arabinosa y, ocasionalmente, gentiobiosa, rutinosa y Soforosa (Badui, 2006; Wong, 1995).
Las antocianinas están compuestos por dos anillos aromáticos A y B unidos por una cadena de 3 carbonos (Garzón, 2008).
Figura 3. Estructura del grupo flavilo.
Fuente: Badui, 2006.
Variaciones estructurales del anillo B resultan en seis antocianidinas conocidas:
Tabla 6. Sustituyentes de las antocianinas.
Aglicona Sustituyentes λmáx (nm)
Espectro visible
R1 R2
Pelargonidina H H 494 (naranja)
Cianidina OH H 506 (naranja-rojo)
Delfinidina OH OH 508 (azul-rojo)
Peonidina OCH3 H 506 (naranja-rojo)
Petunidina OCH3 OH 508 (azul-rojo)
Malvinidina OCH3 OCH3 510 (azul-rojo)
Fuente: Durst y Wrolstad, 2001.
10 b. Mecanismo general de biosíntesis de las antocianinas
El mecanismo de biosíntesis de las antocianinas ocurre cuando el anillo A de las antocianinas se sintetiza por la ruta del ácido malónico con la condensación de tres moléculas de malonil-CoA, mientras que el anillo B se sintetiza por la ruta de ácido shikímico (Garzón, 2008).
Figura 4. Ruta general de biosíntesis de las antocianinas.
Fuente: Delgado, Jiménez y Paredes, 2000.
El ácido shikímico da paso a la fenilalanina que por acción de una fenilalanina amonia liasa (PAL), y después de una pérdida de NH3 se convierte en ácido p-coumárico. El p-coumaril-CoA luego participa en una reacción de condensación con las tres moléculas de malonil-CoA para formar una chalcona de 15 carbonos, reacción propiciada por una
11 chalcona sintetasa. Este compuesto intermedio de 15 carbonos es transformado en una flavanona en una reacción catalizada por una chalcona isomerasa. Finalmente, la flavanona es transformada en la correspondiente antocianidina por una reacción de hidroxilación en el carbono 3 seguida por una deshidratación (figura 4). La molécula de antocianidina se estabiliza por glicosilación del heterociclo; reacción en la que interviene una glicosil transferasa y posterior posibles reacciones de metilación de los hidroxilos seguidas de acilaciones (Garzón, 2008).
2.2.4. Factores que afectan la estabilidad de las antocianinas
La estabilidad de las antocianinas está bien marcada por su estructura química, pH, concentración, temperatura, presencia de oxígeno con ácido ascórbico, y actividad de agua.
a. Efecto del pH
El pH y la acidez tienen efecto protector sobre las antocianinas, ya que en soluciones a pH bajo la antocianina adquiere una forma más estable conocido como ión oxonio o catión flavilio (AH+), manifestado por un color rojo intenso (Hutchings, 1999).
Figura 5. Estructura predominante de antocianina a diferentes niveles de pH.
Fuente: Giusti y Wrolstad, 2001.
12 En condiciones alcalinas, ocurre la perdida de protón y adición de agua en la posición 2, consecuentemente se da lugar un equilibrio entre la pseudobase carbinol o hemicetal (B) y la molécula chalcona (C) de cadena abierta. A valores de pH superiores a siete se presentan las formas quinoidales (A, A-) de color púrpura que se degradan rápidamente por oxidación con el aire (Hutchings, 1999).
Según Fennema (2000). En las soluciones acuosas, inclusive los alimentos, las antocianinas pueden existir en 4 formas estructurales, dependiendo del pH (figura 6): la base quinonoidal azul (A), el catión flavilio rojo (AH+), la base pseudocarbinol incolora (B), y la chalcona incolora (C).
Figura 6. Las cuatro estructuras de antocianinas presentes en disolución ácida acuosa a temperatura ambiente.
Fuente: Fennema, 2000.
A pH entre 4 y 6, pH característico de las frutas y hortalizas frescas o procesadas, se observa una mezcla en equilibrio de las formas catión flavilio, bases quinodales y carbinol, como así también de la forma chalcona (Moldovan et al., 2012).
13 b. Efecto de la temperatura
La estabilidad térmica de las antocianinas respecto al efecto de la temperatura queda determinado por la conformación y características estructurales. El mecanismo preciso para la degradación de la antocianina no se ha esclarecido totalmente. Se han sugerido tres rutas.
El cumarín 3,5-diglicósido es el producto común de la degradación de las antocianidinas (cianidina, peonidina, delfinidina, petunidina y malvidina) 3,5-diglicósido (Elbe y Schwartz, 2000).
Figura 7. Mecanismo de degradación de la antocianidina 3,5-diglicósido y de la antocianidina 3-diglucósido. R3’, R5' = OH, -H, -OCH3 o -OGL; GL = grupo glucosilo.
Fuente: Jackman y Smilh, 1992.
En la ruta (a) (figura 7), el catión flavilio primero se transforma en la base quinonoidal, después en diversos intermediarios y finalmente en el derivado cumarínico y un compuesto correspondiente al anillo B. En la ruta (b) (figura 7), el catión flavilio primero se transforma en la base carbinol incolora, después en chalcona y finalmente en productos de degradación pardos. La ruta (c) (figura 7) es similar, excepto en que los productos de degradación de la chalcona se intercalan primero. Estos tres mecanismos propuestos sugieren que la degradación térmica de las antocianinas depende del tipo de antocianina participante y de la temperatura de degradación (Fennema, 2000).
14 El calor desplaza el equilibrio hacia la chalcona y la reacción inversa es más lenta que la reacción directa (Markakis, 1982).
(A) Quinonoide (azul)
↔
(AH+) Flavilio
(rojo)
↔
(B) Base carbinol (incolora)
↔
(C) Chalcona (Incolora)
Por efecto del calor (a temperaturas por encima de los 60ºC) las antocianinas se degradan según una cinética de primer orden (la concentración de antocianinas, disminuye exponencialmente y, de manera simultánea, la concentración de productos aumenta exponencialmente) (Fenema, 2000).
c. Oxígeno y ácido ascórbico
El ácido ascórbico y las antocianinas desaparecen simultáneamente de los zumos de frutas, se cree que la degradación de la antocianina inducida por ácido ascórbico resulta indirectamente de la formación de peróxido de hidrógeno durante la oxidación del ácido ascórbico (Jackman y Smilh, 1992).El rompimiento por H202 del anillo de pirilio por ataque nucleofílico sobre la posición C-2 de la antocianina produce ésteres incoloros y derivados de cumarina. Estos productos de degradación pueden a su vez degradarse o polimerizarse y finalmente conducir a un precipitado pardo (Fennema, 2000).
El efecto positivo de la eliminación de oxígeno para retener el color de las antocianinas se ha demostrado mediante vacío o por flujo de nitrógeno (kallio et al., 1986).
d. Azúcares y sus productos de degradación
Los azúcares a altas concentraciones, como ocurre en las conservas de frutas, estabilizan las antocianinas. Los azúcares o sus productos presentes en concentraciones bajas pueden a veces acelerar la degradación de las antocianinas. La velocidad de degradación de la antocianina sigue la velocidad de degradación del azúcar a furfural. El furfural, que se deriva de las aldopentosas, y el hidroximetilfurfural, que es un derivado de la cetohexosas, resultan de la reacción de Maillard o de la oxidación del ácido ascórbico. Estos compuestos se condensan
15 fácilmente con las antocianinas, formando compuestos pardos (Elbe y Schwartz, 2000).
e. Luz
Las antocianinas son generalmente inestables expuestos a la luz UV o luz visible, siendo algunas más afectadas que otras. Las antocianinas que poseen el OH en C-5 sustituido son más propensos a descomposición (Look, 1997).
f. Copigmentación
Las antocianinas forman complejos débiles con proteínas, taninos, polisacáridos y otros flavonoides. Aunque la mayoría de estos compuestos por sí mismos no son coloreados, aumentan el color de las antocianinas por producir desplazamiento batocrómico (longitud de onda larga en el espectro visible con tendencia a rojo intenso). Estos complejos también tienden a ser más estables durante el procesado y el almacenamiento (Fennema, 2000). La disposición solapada de las dos moléculas (antocianina y copigmento) (figura 8), previene el ataque nucleofílico de moléculas de agua en la posición 2 del catión flavilio, evitando la formación de la pseudobase no coloreada (Rein, 2005).
Figura 8. Formación de complejo a través de interacción intermolecular.
Fuente: Rein, 2005.
g. Enzimas
Las principales enzimas que degradan las antocianinas son las antocianasas (glicosidasas y polifenoloxidasas). Se ha atribuido que dosis bajas de SO2 (30 ppm) inhiben las antocinasas y la estabilidad del color con la presencia de Na2SO3 (Labuza, 1982).
16 2.2.5. Determinación de antocianina monomérica por el método pH
diferencial
Giusti y Wrolstad (2001), indican en su primer protocolo básico de medición de antocianinas por espectrofotometría UV-Visible, que los pigmentos de antocianina sufren transformaciones estructurales reversibles con un cambio en el pH que se manifiestan a diferentes espectros de absorbancia (figura 5). Donde la forma del color oxonio predomina a pH 1,0 y la forma incolora del hemicetal a pH 4,5 (figura 9). El método pH-diferencial se basa en esta reacción, y permite la precisa y rápida medición de las antocianinas totales, incluso en la presencia de pigmentos degradados, polimerizados y otros compuestos que interfieren (Giusti y Wrolstad, 2001).
Figura 9. Características espectrales de antocianinas purificadas de rábano (acilados derivados pelargonidina-3-sophoroside-5- glucósido) en pH 1,0 y pH 4,5.
Fuente: Giusti y Wrolstad, 2001.
2.2.6. Capacidad antioxidante
Youngson (2004) menciona que la actividad antioxidante es la capacidad de los compuestos fenólicos (antocianinas) de reaccionar con especies reactivas de oxígeno. Una especie reactiva de oxigeno es cualquier átomo o molécula con electrones desapareados que son capaces de atacar a proteínas, carbohidratos, grasas y ADN del cuerpo, ejerciendo un efecto oxidativo que daña las células. Entre ellos se menciona a los radicales (ion superóxido O2ˑˉ radical hidroxilo ˑOH, alcoxilo ROˑ, peroxilo ROOˑ y óxido
17 de nitrógeno NOˑ) y no radicales (peróxido de hidrógeno H2O2, oxigeno singulete ˑO2 y peroxinitrito ONOOˉ).
Tabla 7. Capacidad antioxidante en algunas matrices alimenticias.
Matriz fresca Nombre científico
DPPH• TEAC (µmol/gBH)
30 min Arándano rojo Vaccinium parvifolium 92,900 a
Fresa Fragaria anannassa 121,600 a
Pétalos de Mastuerzo
anaranjado Tropaeolum majus L 91,870 b
Salchicha ahumada adicionado con 0.3 % de extracto de cereza
Prunus avium L 1,007 c
Nota: DPPH• = 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo; TEAC = Capacidad antioxidante equivalente trolox.
Fuente: a Katsube et al. 2003., b Garzón y Wrolstad, 2009., c Isaza et al., 2012.
a. Mecanismos de acción
El antioxidante AH (compuesto fenólico) interfiere por medio de una reacción redox donando un átomo (figura 10) o un electrón (figura 11) de hidrogeno a la especie radicalaria (radical peroxilo, ROO•), de este modo se detiene la reacción en cadena (peroxidación lipídica) y consecuentemente la formación de un radical derivado del antioxidante (A•), que puede ser inerte, estable o poco reactivo (Cadenas, 1997).
Figura 10. Estabilización de un radical libre por donación de un átomo de hidrogeno.
Fuente: Santiago, 2007.
Figura 11. Estabilización de un radical libre por transferencia electrónica.
Fuente: Santiago, 2007.
ROO• + AH → ROOH + A•
ROO• + AH → ROO - + AH + AH + + H2O ↔ A• + H3O + ROO - + H3O + ↔ ROOH + H2OH2O
18 2.2.7. Determinación de la actividad antioxidante mediante espectrofotometría UV-Vis y radical DPPH• (2,2-difenil-1- picrilhidrazilo)
Este método fue propuesto por Blois en el año1958, en el cual se demostró por primera vez la capacidad del radical libre DPPH• para aceptar un átomo de hidrógeno (H+) proveniente de una molécula de cisteína. El método, desarrollado por Brand-Williams et al. (1995), se basa en la reducción de la absorbancia medida a 515 nm del radical DPPH•, por antioxidantes. Con modificaciones el método descrito por Kim et al. (2002), se basa en la medida en espectrofotómetro (λ=517 nm) de la mezcla cuidadosamente homogenizada del radical DPPH• con la muestra o patrón la cual se mantiene en oscuridad por 30 minutos. En algunos casos por 20 minutos (Chen et al., 1999). El radical tiene una coloración púrpura (figura 12) que se pierde progresivamente cuando se añade la muestra conteniendo sustancias antioxidantes (Basile et al., 2004).
2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (radical libre) Morado
2,2-difenil-1-picrilhidrazina (no radical) Amarillo
Figura 12. Estructura del DPPH• antes y después de la reacción con el antioxidante.
Fuente: Alam, Bristi y Rafiquzzaman, 2012.
2.3. Tamizaje fitoquímico del mastuerzo
El tamizaje fitoquímico tiene como propósito aislar e identificar los diversos compuestos que biosintetiza la planta, los cuales pueden tener o no actividad, o más bien causar toxicidad. El tamizaje fitoquímico de la planta de mastuerzo recolectada a una altitud de 2 750 m.s.n.m., con temperatura de 17 °C y en época de invierno en las provincias de Ecuador, reportó valores cualitativos mostrados en la tabla 8. Los solventes empleados: éter dietílico, alcohol al 96 % y agua
19 destilada, los cuales extrajeron metabolitos afines de polaridad similar:
compuestos lipofílicos, compuestos de polaridad intermedia y compuestos hidrofílicos respectivamente (Cabezas, 2014).
Tabla 8. Tamizaje fitoquímico de extractos de mastuerzo (Tropaeolum majus L.)
Metabolito Ensayo Extracto
etéreo
Extracto alcohólico
Extracto acuoso
Alcaloides
Dragendorff (-) (+) (-)
Wagner (-) (+) (+)
Mayer (-) (+)
Triterpenos y Esteroides
Lieberman-
Buchard (+++) (+)
Flavonoides Shinoda (+) (+)
Taninos y Fenoles Cloruro férrico (+++) (+++)
Saponinas Espuma (-) (-)
Azúcares
reductores Fehling (+++) (+)
Compuestos
grasos Sudan III (-)
Quinonas Borntrager (++)
Cumarinas Baljet (-) (-) (+)
Flavonoides Antocianidinas (+)
Catequinas Catequinas (-)
Resinas Resinas (-)
Mucílagos Mucílagos (-)
P. amargos P. amargos (-)
Nota: (-) = Sin evidencia; (+) = Baja evidencia; (++) = Evidencia considerable; (+++) = Alta evidencia.
Fuente: Cabeza, 2014.
2.4. Estrés oxidativo y radicales libres 2.4.1. Estrés oxidativo
El estrés oxidativo se puede definir como un desequilibrio en las células debido a un aumento en los radicales libres y/o una disminución en los antioxidantes. Con el tiempo, este desajuste en el equilibrio entre los radicales libres y los antioxidantes puede dañar los tejidos (Tetteh, 2012).
20 Puede decirse entonces que el estrés oxidativo es el efecto adverso que se produce en la sangre y los tejidos de los seres vivos cuando existe un incremento de la degradación de sus biomoléculas (proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y otros) causado por radicales libres de oxígeno (Lima, 2004).
Figura 13. Célula invadida por los radicales libres (RL).
Fuente: Rajme, 2014.
2.4.2. Radicales libres
Los radicales libres (RL) o modernamente llamados especies reactivas de oxígeno (ERO) son átomos o moléculas que contienen uno o más electrones no pareados en el orbital más externo, lo que produce una gran reactividad en dicha estructura. Esto da lugar a que estos RL intervengan con gran eficacia y rapidez en un sinnúmero de procesos bioquímicos a nivel celular. Normalmente las ERO son metabolitos fisiológicos (compuestos generalmente orgánicos), pero en ciertas condiciones o estados propios de la actividad del hombre en relación con su medio, la producción de estos compuestos puede incrementarse en forma considerable, rompiéndose entonces el equilibrio que debe existir entre estos y sus rivales o contrapartes los antioxidantes corporales (Lima, 2004).
Figura 14. Antioxidante cediendo un electrón al radical libre (RL).
Fuente: Hamann, 2015.
21 La mitocondria es el principal productor de ERO, ya que la respiración celular se verifica específicamente a este nivel. Como se sabe el 90% del total del oxígeno inhalado se consume en la mitocondria y alrededor del 2
% del oxígeno reducido se transforma en el radical superóxido (O2·). Otra fuente de este radical son los fagocitos activados que producen el superóxido como mecanismo protector frente a agentes u organismos extraños. Por otros mecanismos el superóxido se transforma en el radical hidroxilo (OH·), que es aún más reactivo que el anterior (Lima, 2004).
2.4.3. Mecanismo de oxidación inducido por radicales libres
Los ácidos grasos poliinsaturados presente en las membranas celulares son principalmente oxidados por los radicales libres, por medio de tres etapas, iniciación, propagación y terminación (Halliwell y Chirico, 1993).
a. Iniciación
Se da inicio la oxidación cuando el ácido graso pierde un átomo de hidrogeno por efecto de un radical libre, provocando así un radical lipídico R•. El radical lipídico se reorganiza molecularmente y reacciona rápidamente con el oxígeno, formando un radical peroxilo ROO•
(Halliwell, 1994).
Figura 15. Iniciación de la peroxidación lipídica por el radical R•.
Fuente: Boots, 2008.
b. Propagación
El radical peroxilo sustrae un átomo de hidrogeno de un segundo ácido graso dando lugar un hidroperóxido lipídico, y así sucesivamente se repite por el paso continuo de un electrón desapareado de molécula a otra (Halliwell, 1994).
22 Figura 16. Ataque de radical peroxilo a un ácido graso.
Fuente: Boots, 2008.
c. Terminación
La reacción en cadena finalizará en alguna de las condiciones, (1) consumo de moléculas reactivas (ác. grasos, O2), (2) formación de radical poco reactivo y (3) reacción de dos radicales formando un par no radical (Halliwell, 1994). Las proteínas son dañadas por radicales libres (OH•, RO•) y especies reactivas de nitrógeno (NO•), produciendo peroxidación, cambios en la estructura terciaria, fragmentación de aminoácidos y degradación de las mismas (Davies y Delsignoret, 1986).
El ADN es fuertemente atacado por el radical hidroxilo (OH•), dañando las bases de las cadenas del ADN, pérdida de purina, daño de la desoxirribosa, empalme entre proteína y ADN y ataque en el sistema de reparación del ADN (Dizdaroglu et al., 2002).
2.5. Extracción
La extracción es una operación unitaria de transferencia de materia, basada en la disolución de uno o varios de los componentes de una mezcla (líquida o sólida) en un disolvente selectivo. Aprovecha, por tanto, la diferencia de solubilidades de los componentes de la mezcla en el disolvente añadido. (Marcilla, 1998).
2.5.1. Extracción sólido-líquido (lixiviación)
Para separar el soluto deseado o eliminar un soluto indeseable de la fase sólida, ésta se pone en contacto con una fase líquida. Ambas fases entran en contacto íntimo y el soluto o los solutos se difunden desde el sólido a la fase líquida, este proceso se llama lixiviación líquido-sólido o simplemente, lixiviación (Geankoplis, 1998).La lixiviación es considerada una operación unitaria. (Treybal, 1980).
23 2.5.2. Factores en el lixiviado
Las condiciones de extracción, tales como, tamaño de sólido, relación sólido-líquido, temperatura, tiempo, tipo de disolvente, concentración de disolvente y agitación del disolvente influyen en la estabilidad de las antocianinas, así como también en la concentración de antocianinas extraídas (Bridgers et al., 2010 citado en Zapata et al., 2014).
a. Tamaño de sólido
Al triturar o moler los cuerpos vegetales lo suficientemente pequeños para liberar el contenido de las células, se acelera la acción de lixiviación (Treybal, 1980). Para lixiviar productos farmacéuticos de hojas, tallos y raíces, el secado del material antes de la extracción ayuda a romper las paredes celulares. De esta manera, el disolvente ataca directamente al soluto (Geankoplis, 1998).
b. Relación sólido-líquido
Es necesario encontrar una relación adecuada entre el disolvente y la materia prima a ser extraída. Una proporción alta da lugar a extractos demasiados diluidos y si es muy baja no habrá buena difusión. El equilibrio se alcanza cuando el soluto se disuelve totalmente y la concentración de la solución que se forma es uniforme (Medina, 2012).
Zapata (2014), utilizó una proporción de 1:3 (materia prima/solvente) para la extracción de antocianinas a partir del arándano fresco. Si hay desproporción con mayor cantidad de solvente, podría ocasionarse que más moléculas de etanol presentes en el medio, podrían actuar como nucleófilo atacando al catión flavilio y generando estructuras de antocianinas más inestables.
c. Temperatura
Generalmente la lixiviación se realiza a temperaturas elevadas, éstas producen mayor solubilidad del soluto en el disolvente; la viscosidad del líquido es menor y mayor la difusividad; incrementando la rapidez de lixiviación (Treybal, 1980). Siendo las desventajas de una extracción en caliente el no lograr extraer totalmente la esencia del producto, empleo de equipos más sofisticados que permitan el control de la temperatura, elevando así el consumo energético (López, 2008).
24 En el caso de algunos productos naturales como las remolachas a temperaturas muy elevadas pueden producir la lixiviación de cantidades excesivas de solutos indeseables o de deterioro químico del sólido (Treybal, 1980).
La utilización del frío en la extracción (lixiviación) es necesaria para preservar los compuestos termolábiles y evitar la degradación del pigmento vegetal (Vanina, 2008). Sin embargo se necesitan periodos de tiempo mucho más extensos para lograr una extracción adecuada;
una de las ventajas es la utilización de equipos simples, requiriendo las mínimas cantidades energéticas (López, 2008).
Una temperatura de extracción por encima de 36,6 °C hace que se degraden las antocianinas, posiblemente debido a que el efecto del calor produce la pérdida del azúcar glicosilante en la posición 3 de la molécula y apertura de anillo, con la consecuente producción de chalconas incoloras (Zapata, 2014).
d. Tiempo
El tiempo de extracción está en función inversa a los factores de temperatura y agitación. Pero generalmente se da el tiempo suficiente, como para lograr un buen contacto del sólido con el solvente (Medina, 2012), a su vez el tiempo de extracción es determinante a la hora de obtener un mayor rendimiento (Arranz, 2010).
Se han reportado tiempos de extracción desde 1 minuto a 24 horas teniendo en cuenta que largos periodos de extracción pueden producir oxidaciones, que se minimizan añadiendo agentes reductores (Arranz, 2010).
e. Tipo de disolvente
Un buen disolvente debe ser selectivo y su viscosidad suficientemente baja para que pueda circular libremente. La concentración del soluto aumentará y la relación de extracción disminuirá progresivamente, debido a que la gradiente de concentración se va reduciendo; y porque la solución se hace más viscosa (Medina, 2012).
El carácter polar de la molécula de antocianina permite su solubilidad en variados solventes (Zapata et al., 2014) entre ellos: acetona, agua,
25 etilen glicol, glicol de propileno, metil etil cetona, iso propanol, metanol y etanol. Los dos últimos son superiores al resto de solventes mencionados, siendo el metanol acidificado más común; este sistema permite destruir las membranas, se disuelve de manera simultánea las antocianinas y los estabiliza (Naczk & Shahidi, 2004). Como las antocianinas son estables a pH ácidos es necesario incluir ácidos orgánicos e inorgánicos. Entre los ácidos orgánicos al ácido cítrico, porque es menos corrosivo que el HCl y por sus quelatos metálicos que posee, los cuales pueden tener efecto protector durante el secado por atomización (Main et al., 1978 citado en Medina, 2012).
El disolvente de extracción apropiado para obtener colorante a partir de pigmentos naturales es el etanol ya que presenta varias ventajas: no tóxico, económico y su capacidad de extracción es buena como la del solvente generalmente utilizado (metanol), la inclusión de agua ayuda a la extracción de más antocianinas hidrofílicas y, el ácido clorhídrico estabiliza el pigmento bajando el pH a un nivel donde la absorbancia de las antocianinas es máxima (Fuentes, 2005).
Zapata (2014) señala para la extracción de antocianinas a partir de arándanos frescos, donde la adecuada concentración utilizada para acidificar el disolvente (etanol/agua) es ácido cítrico al 1 %, mientras Menéndez y Torres (2008), para la extracción de antocianinas a partir de la flor de Jamaica y Mortiño experimentaron la extracción a diferentes purezas de etanol y a diferentes concentraciones de ácido cítrico, siendo correcta a 90° de pureza y a 0,03% de ácido cítrico.
f. Concentración de disolvente
La concentración del disolvente es importante para soluciones acuosas, debido a la saturación y a la existencia de reacciones químicas, sin embargo es de poca importancia cuando la extracción es controlada por difusión (López, 2008).
La utilización de un solo disolvente principal puede no tener un poder disolvente muy fuerte como para disgregar toda una concentración de solutos, por eso se le agregan disolventes latentes (como un alcohol), concluyendo de que el incremento del poder disolvente se debe al grupo OH (Licea, 1986). Zapata (2014) utilizó como disolvente etanol/agua
