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Efecto del cloruro de hidroxilamina en la producción de bioinsecticida de Bacillus thuringiensis H 14 var Israelensis en conciones de laboratorio

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Academic year: 2020

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POSTGRADO. SG RA. DO. UNIDAD DE POSTGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS. CA. DE. PO. Efecto del cloruro de hidroxilamina en la producción de bioinsecticida de Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis en condiciones de laboratorio. IO TE. TESIS PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE MAESTRO EN CIENCIAS CON MENCION EN. BIOTECNOLOGÍA AGROINDUSTRIAL Y AMBIENTAL. BLGO. JUAN JAVIER PEDRO HUAMAN. BI. BL. AUTOR:. ASESOR:. DR. WILLIAN GENARO BLAS CERDAN TRUJILLO - PERÚ 2019. Nº de Registro:. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. SG RA. DO. Jurado Dictaminador. Dr. José Antonio Saldaña Jiménez. IO TE. CA. DE. PO. PRESIDENTE. Dra. Gina Genara Zavaleta Espejo. BI. BL. SECRETARIO. Dr. Willian Genaro Blas Cerdán MIEMBRO. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) SG RA. . DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A Dios, por ser esa fuerza invisible que nos protege, fortalece y llena de esperanzas y energías renovadas cada día.. PO. A mis amados padres Flavia y Juan, por ser la fuerza e inspiración sin la cual no hubiera alcanzado esta meta.. DE. A mis hermanos Sofía y Jesús, por su apoyo incondicional. A todos aquellos que han estado presentes en cada momento de mi. . BI. BL. IO TE. CA. vida brindándome su ayuda, familiares y amigos. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DO. AGRADECIMIENTOS. SG RA. Al asesor de mi tesis, Dr. Willian Genaro Blas Cerdán; por su valioso apoyo y orientación brindado en la realización del presente estudio. Gracias por su. de una manera desinteresada.. PO. paciencia, por compartir sus conocimientos, experiencias y toda la ayuda brindada. DE. A la Dra. Gina Zavaleta Espejo y el Dr. José Antonio Saldaña Jiménez, por. CA. todo su apoyo en el desarrollo de la fase experimental de este trabajo, sin su apoyo y guía no se podría haber llegado a obtener los resultados que se muestran en esta. IO TE. investigación.. BL. A mis estimados alumnos, por haberme escuchado y apoyado en la. BI. realización del presente estudio.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. cumplimiento. a. las. disposiciones. contenidas. SG RA. Dando. DO. Señores Miembros del Jurado:. en. el. Reglamento de la Escuela de Postgrado de la Universidad Nacional de. PO. Trujillo, tengo a bien poner a vuestra consideración y criterio la Tesis titulada:. DE. “Efecto del cloruro de hidroxilamina en la producción de bioinsecticida. CA. de Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis en condiciones de laboratorio” con la finalidad de obtener el Grado de Maestro en Ciencias. BI. BL. IO TE. con mención en Biotecnología Agroindustrial y Ambiental.. El Autor.. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE GENERAL INTRODUCCIÓN ____________________________________________________________ 1 Problema __________________________________________________________________ 9. 1.2.. Hipótesis __________________________________________________________________ 9. 1.3.. Justificación de la Investigación ______________________________________________ 9. 1.4.. Objetivos _________________________________________________________________ 11. DO. 1.1.. MATERIAL Y MÉTODOS _____________________________________________________ 12 Objeto de Estudio: _________________________________________________________ 12. 2.2.. Instrumentación: __________________________________________________________ 13. 2.3.. Métodos y Técnicas ________________________________________________________ 13. SG RA. 2.1.. RESULTADOS ______________________________________________________________ 18. PO. DISCUSIÓN ______________________________________________________________________ 25 CONCLUSIONES ____________________________________________________________ 32. DE. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Y ELECTRÓNICAS __________________________ 33 ANEXO 1 ___________________________________________________________________ 40 ANEXO 2 ___________________________________________________________________ 41. CA. ANEXO 3 ___________________________________________________________________ 42 ANEXO 4 ___________________________________________________________________ 43. IO TE. ANEXO 5 ___________________________________________________________________ 44 ANEXO 6 ___________________________________________________________________ 45 ANEXO 7 ___________________________________________________________________ 46. BL. ANEXO 8 ___________________________________________________________________ 47 ANEXO 9 ___________________________________________________________________ 48. BI. ANEXO 10 __________________________________________________________________ 49 ANEXO 11 __________________________________________________________________ 50 ANEXO 12 __________________________________________________________________ 51 ANEXO 13 __________________________________________________________________ 52 ANEXO 14 __________________________________________________________________ 53 ANEXO 15 __________________________________________________________________ 54 ANEXO 16 __________________________________________________________________ 55 ANEXO 17 __________________________________________________________________ 56 v. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ANEXO 18 __________________________________________________________________ 57 ANEXO 19 __________________________________________________________________ 58 ANEXO 23 __________________________________________________________________ 62 ANEXO 24 __________________________________________________________________ 63. BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. ANEXO 25 __________________________________________________________________ 64. vi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE DE TABLAS. Tabla Nº1. Rendimiento (gr./L) de Bacillus thuringiensis var. Israelensis, expuestas a 4 tratamientos con cloruro de hidroxilamina (0, 10, 20, 30 ppm.) evaluado a las 48 horas. DO. con 3 repeticiones cada uno. __________________________________________________ 22. SG RA. Tabla Nº2. Análisis de varianza para rendimiento (gr./L) de Bacillus thuringiensis var. Israelensis, expuestas a 4 tratamientos con cloruro de hidroxilamina (0, 10, 20, 30 ppm.) evaluado a las 48 horas. ______________________________________________________ 23 Tabla Nº3. Comparación de promedios aplicando la prueba Tukey para rendimiento. PO. (gr./L) de Bacillus thuringiensis var. Israelensis, expuestas a 4 tratamientos con cloruro de hidroxilamina (0, 10, 20, 30 ppm.) evaluado a las 48 horas. ________________________ 24. DE. Tabla Nº4. Diseño experimental del proyecto. __________________________________ 42. CA. Tabla N°5. Componentes del medio de cultivo base propuesto por Abarca et. al, 1992.46 Tabla Nº6. Base de datos de pH del crecimiento de Bacillus thuringiensis var. Israelensis,. IO TE. expuestas a 4 tratamientos con cloruro de hidroxilamina (0, 10, 20, 30 ppm.) evaluado cada 8 horas durante 48 horas. _________________________________________________ 63 Tabla N°7. Base de datos de crecimiento (UFC/ml) de Bacillus thuringiensis var.. BL. Israelensis, expuestas a 4 tratamientos con cloruro de hidroxilamina (0, 10, 20, 30 ppm.). BI. evaluado cada 8 horas durante 48 horas. ________________________________________ 64. vii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. pH del crecimiento de Bacillus thuringiensis var. Israelensis, expuestas a 4 tratamientos con cloruro de hidroxilamina (0, 10, 20, 30 ppm.) evaluado cada 8 horas. DO. durante 48 horas. ____________________________________________________________ 20 Figura 2. Curva de crecimiento de Bacillus thuringiensis var. Israelensis, expuestas a 4. SG RA. tratamientos con cloruro de hidroxilamina (0, 10, 20, 30 ppm.) evaluado cada 8 horas durante 48 horas. ____________________________________________________________ 21 Figura 3. Mecanismo de acción de Bacillus thuringiensis en lepidópteros _____________ 40. PO. Figura 4. Cepa de Bacillus thuringiensis H-14 Var. Israelensis ______________________ 41 Figura 5. Diseño de exposición al mutágeno cloruro de hidroxilamina_______________ 43. DE. Figura 6. Diseño de construcción del Biorreactor Tanque Agitado y Aireado _________ 44 Figura 7. Biorreactor Tanque Agitado y Aireado, nótese el sistema de calentamiento y de. CA. aireación para lograr las condiciones óptimas del proceso. _________________________ 45. IO TE. Figura 8. Preparación de Medios Fermentativos. _________________________________ 47 Figura 9. Matraces con medio y diferentes concentraciones de cloruro de hidroxilamina 48 Figura 10. Dispensado de placas con el mutágeno cloruro de hidroxilamina. _________ 49. BL. Figura 11. Preparación del inóculo para el bioproceso _____________________________ 50. BI. Figura 12. Carga de los reactivos en el biorreactor. ________________________________ 51 Figura 13. Muestras tomadas durante el bioproceso cada 8 horas. ___________________ 52 Figura 14. Procesamiento de las muestras tomadas durante el bioproceso cada 8 horas. 53 Figura 15. Campo real de Bacillus thuringiensis var. Israelensis con tinción Gram ______ 54 Figura 16. Campo real Bacillus thuringiensis var. Israelensis con esporas de color verde y cristales de color rojo mediante la coloración Verde de malaquita modificado ________ 55 Figura 17. Producto total del bioproceso después de 72 horas de incubación. _________ 56 viii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 18. División del producto total del bioproceso en recipientes de plástico color ámbar para su posterior centrifugación. _________________________________________ 57 Figura 19. Centrifugación del producto del bioproceso ____________________________ 58 Figura 20. Disposición del producto centrifugado para su posterior secado. __________ 59 Figura 21. Producto final del bioproceso. ________________________________________ 60 Figura 22. Colonias de Bacillus thuringiensis H-14 Var. Israelensis después de 72 horas de. DO. incubación a 35°C ____________________________________________________________ 61 Figura 23. Gráfico de cajas y bigotes del promedio de rendimiento de Bacillus thuringiensis. BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. SG RA. var. Israelensis expuesto a 0, 10, 20 y 30 ppm. de cloruro de hidroxilamina. __________ 62. ix. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN El objetivo general es evaluar el efecto del cloruro de hidroxilamina en la producción de bioinsecticida de Bacillus thuringiensis var. israelensis en condiciones de laboratorio. Se utilizó un testigo y tres concentraciones. DO. del mutágeno con 10 ppm, 20 ppm y 30 ppm con 3 repeticiones para cada. SG RA. uno en un diseño experimental completamente al azar. La producción de biomasa se realizó en biorreactores tipo tanque cilíndrico aireado y agitado, las fermentaciones se llevaron a cabo por 48 horas a temperatura de 30°C, pH inicial de 7,0 el cual disminuyo hasta un valor final de 6,0 y. PO. un inóculo microbiano de 109 UFC/ml. La curva de crecimiento se estimó por recuento en placa, obteniéndose los valores más altos para el. DE. tratamiento de 20 ppm. del mutágeno. Se determinó que la producción de bioinsecticida más alta se logró con el tratamiento de 20 ppm. la que se. CA. cuantificó en gramos de peso seco por litro (2.10 g/L); no existiendo relación directa entre la producción de bioinsecticida y la concentración. IO TE. del mutágeno.. Palabras clave: cloruro de hidroxilamina, mutante, bioinsecticida,. BI. BL. producción, Bacillus thuringiensis.. x. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT The main purpouse is to evaluate the effect of hydroxylamine chloride in the bioinsecticide production of Bacillus thuringiensis var. under. laboratory. conditions.. A. control. and. three. DO. israelensis. concentrations of the mutagen were used with 10 ppm, 20 ppm and 30. SG RA. ppm with 3 replicates for each in a completely randomized experimental design. The production of biomass was carried out in aerated and agitated cylindrical tank type bioreactors, the fermentations were carried out for 48 hours at a temperature of 30 ° C, initial pH of 7.0 which decreased to a. PO. final value of 6.0 and a microbial inoculum of 109 CFU / ml. The growth curve was estimated by plate count, obtaining the highest values for the. DE. treatment of 20 ppm. of the mutagen. It was determined that the highest bioinsecticide production was achieved with the 20 ppm treatment. which. CA. was quantified in grams of dry weight per liter (2.10 g / L); There is no. IO TE. direct relationship between the production of bioinsecticide and the concentration of the mutagen. Keywords: hydroxylamine chloride, mutant, bioinsecticide, production,. BI. BL. Bacillus thuringiensis.. xi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INTRODUCCIÓN La contaminación del medio ambiente a través de los años se ha ido incrementando de manera exponencial en diversas partes del mundo, de. DO. manera natural y antrópica. Uno de estos problemas es la contaminación por residuos químicos de los insecticidas con efecto residual, que son. SG RA. utilizados como controladores para vectores como Anopheles sp. que transmiten la Malaria o Paludismo. Esta enfermedad tiene mayor impacto. PO. en las regiones de África, sureste asiático y América (Chavez y Garboza, 2018).. DE. Este vector generalmente se controla usando larvicidas químicos que. CA. contienen ingredientes activos como organoclorados, organofosfatos,. IO TE. carbamatos y piretroides. Estos insecticidas son tóxicos para los humanos y el medio ambiente, eliminan a los enemigos naturales y, cuando se usan indiscriminadamente, pueden seleccionar la resistencia en las poblaciones. BL. de mosquitos objetivo. Dadas estas desventajas, existe una clara necesidad. BI. de investigar métodos más efectivos y ecológicamente seguros para el control de estos vectores (Lobo, Soares-da-Silva, Silva, Tadei, Polanczyk & Pinheiro, 2018). Hasta el momento el uso del larvicida temephos y cipermetrinas para adultos de Aedes aegypti han tenido buenos resultados; sin embargo, se ha. 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. informado casos de resistencia. El uso de este compuesto en varios países también se ha reducido debido a problemas medioambientales y de seguridad (Carvalho et al., 2018). Ante ello, una posible alternativa para solucionar el problema de resistencia es el control biológico, definido como el uso de un organismo natural o modificado genéticamente cuyos. SG RA. Jiménez, Blas-Roeder & Meléndez-Rodríguez, 2017). DO. productos reducen sus efectos (Blas-Cerdán, Zavaleta-Espejo, Saldaña-. El control biológico es una de las opciones que se han estado utilizando desde hace varias décadas, esta actividad utiliza organismos naturales y/o. PO. modificados genéticamente o bien sus partes o productos con actividad. DE. insecticida para reducir el efecto de las plagas. Una gestión integrada de vectores dirigida a la etapa acuática del mosquito puede complementar las. CA. estrategias para la prevención y el control de estas enfermedades (Zribi. IO TE. Zghal et al., 2018). La biotecnología mediante el uso de algunos microorganismos ha permitido desarrollar productos como los insecticidas. BL. biológicos. Estos productos son de gran importancia para el ser humano y. BI. el entorno que lo rodea (Pineda y Vélez, 2018). El género de Bacillus sp, agrupa Bacillus rectos Gram positivos, formadores de esporas muy resistentes a condiciones adversas, que tienen flagelos peritricos y son aerobios o anaerobios facultativos y catalasa positivo. Su esporulación no se reprime por la presencia de aire. Son bacterias muy ubicuas en la naturaleza, con gran variedad de nichos ecológicos, lo que 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. refleja la gran heterogeneidad del género. La mayoría de las especies son saprofitas y están ampliamente difundidas en el suelo, agua y plantas. Algunas son capaces de sobrevivir y crecer en condiciones extremas de temperatura, pH y salinidad. Por esta razón a veces se aísla de ambientes tan diferentes como el suelo del ártico, fuentes termales o sedimentos. DO. marinos (Chavez y Garboza, 2018).. SG RA. Bacillus thuringiensis (Bti) es una bacteria Gram positiva aeróbica formadora de esporas perteneciente a la familia Bacillaceae, grupo Bacillus cereus. Es una bacteria ambiental y ubicua, puede ser aislada de muestras. PO. de suelo, agua, insectos muertos y tejidos necróticos en mamíferos. Se han. DE. identificado 72 grupos antigénicos o serotipos dentro de las cepas de Bt aisladas. Produce varias proteínas con efecto entomopatógeno específico. CA. en sus fases vegetativa y de esporulación. Fue descubierto por primera vez. IO TE. en Japón por Shigetane Ishiwata en el año 1901, nombrándole Bacillus sotto, posteriormente fue aislado nuevamente en Turingia, Alemania por. BL. Ernest Berliner en el año 1911 que le denominó como Bacillus thuringiensis, nombre que mantiene hasta la actualidad (Morales Nasimba, 2018).. BI. Las células de Bacillus thuringiensis al ser sometidas a una tinción Gram y observadas bajo el microscopio, se muestran de color morado (Gram positivas) con una forma bacilar o de vara alargada y miden de 3 a 5 µm de largo por 1 a 1,2 µm de ancho. Las colonias de Bt son de color blanco o crema, generalmente presentan una textura mate o granular, tienen una. 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. forma redonda con bordes regulares o irregulares y muestran una ligera elevación (Pineda y Vélez, 2018). Bacillus thuringiensis (Bt) es formadora de esporas y su proceso de esporulación se caracteriza por producir cristales paraesporales de origen proteico con propiedades insecticidas. El comité de nomenclatura de. DO. toxinas de Bt define a las toxinas cry como d-endotoxinas que tienen. SG RA. similitud de secuencia primaria con las toxinas cry reportadas y que presentan actividad pesticida o tóxica (Velásquez, Rojas y Cerón, 2018). Las estructuras terciarias de nueve toxinas cry determinadas a través de la. PO. cristalografía de rayos X hasta la fecha contienen tres dominios. DE. conservados con funciones específicas e implicadas en la estabilidad estructural de la proteína. El dominio I es un conjunto de 7–8 hélices α. CA. involucradas en la formación de poros, el dominio II es un prisma β con. IO TE. regiones de bucles expuestas involucradas en la unión al receptor y el dominio III es un sándwich β y tiene influencia en la unión al receptor. BL. (Mauricio et al., 2018).. BI. La familia de genes que codifican estas toxinas es la familia de los genes cry se han reportado alrededor de 304 tales genes de proteínas de tipo holotipo. Estos genes de proteínas cristalinas insecticidas son la principal fuente para el desarrollo de plantas transgénicas resistentes a los insectos (Doolotkeldieva, Leclerque, Bobusheva & Schuster, 2018).. 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Recientemente, la tecnología de secuenciación de próxima generación se ha utilizado para el descubrimiento de nuevos genes de la toxina cry. De diferentes cepas, más de 800 genes cry pertenecientes a 75 clases han sido clonados hasta el momento. Además de las toxinas cry completas, B. thuringiensis también alberga genes de toxinas parciales con dominios. DO. conservados (Sajid et al., 2018). Se han propuesto diferentes modelos que. SG RA. explican su modo de acción. En el modelo de unión secuencial de toxinas cry a receptores, el Cyt1Aa tiene un papel central porque tiene la capacidad de actuar como receptor para las toxinas cry, como se demostró. PO. para Cry11Aa y Cry4Ba (Carvalho et al., 2018).. DE. El mecanismo de acción de Bt en las plagas consta de cinco pasos (Anexo 1). 1) La ingestión de la bacteria: la larva del insecto se alimenta e ingiere. CA. la bacteria o las esporas de la misma que contiene el cuerpo de inclusión. IO TE. paraesporal. 2) Solubilización de los cristales u otras toxinas: las toxinas se solubilizan en fracciones tóxicas o protoxinas por acción de las proteasas. BL. del intestino medio, el cual tiene un pH alcalino de 9 a 12 que es de gran. BI. influencia para su activación. 3)Activación de las proteínas: las protoxinas son activadas gracias a enzimas digestivas en el intestino medio y se unen a receptores específicos en las microvellosidades del intestino del insecto. En este caso, las aminopeptidasas, proteína tipo cadherina (CADR) y la fosfatasa alcalina, actúan como proteínas receptoras para Bt. 4 y 5) Unión a receptores específicos y vacuolización del citoplasma: las toxinas cry u. 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. otras toxinas, atraviesan la membrana peritrófica uniéndose a receptores específicos en las membranas apicales de las células intestinales, lo que provoca la apertura o formación de poros. Seguidamente ocurre la vacuolización del citoplasma por desequilibrio osmótico entre los ambientes intracelular y extracelular y finalmente la disrupción celular.. DO. Esto destruye las microvellosidades, haciendo que el insecto pare de. La. esporulación. es. una. SG RA. alimentarse, produciendo su muerte (Pineda y Vélez, 2018). respuesta. a. determinadas. condiciones. nutricionales y ambientales, las fuentes de carbono y nitrógeno son muy. PO. importantes en la producción de biomasa de Bt, así como la del cristal. DE. biocida; la falta o disminución de las concentraciones de estas fuentes, son las causas principales del inicio de la esporulación, así, se puede producir. IO TE. 2010).. CA. bioinsecticida a partir de fuentes carbonadas y nitrogenadas (Zavaleta E.,. Desde 1950, una de las estrategias más exitosas para controlar el vector del. BL. dengue se basa en el uso de Bacillus thuringiensis var. Bacterias israelensis. BI. (Bti), cuyo efecto biolarvicida es específico para el control de especies de la familia Culicidae, incluido A. aegypti. En Colombia, Bti está disponible y se comercializa como "VectoBac 200G ™", y contiene Bti serotipo H-14 como ingrediente bioactivo (Gómez-Vargas, Valencia-Jiménez, Correa-Londoño & Jaramillo-Yepes, 2018).. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Debido a esto producir dicha bacteria en gran escala es muy importante, para la producción de Bacillus thuringiensis se debe realizar la selección y conservación del microorganismo como primer paso ya que esto garantiza un buen proceso y producto (bioinsecticida). En segundo lugar, se debe realizar inóculos por medio de cultivos líquidos que deben estar en. DO. constante agitación durante la fermentación. Lo más importante al. SG RA. momento de producir Bt y sus toxinas proteicas son los requerimientos nutricionales del microorganismo: el balance carbono-nitrógeno y el balance de las sales como hierro, magnesio, manganeso, entre otros. En. PO. cuanto a los requerimientos de operación, Bacillus thuringiensis necesita. DE. condiciones óptimas para la producción de la proteína. Condiciones como temperatura, pH, suministro de oxígeno y agitación, son algunas de las. CA. condiciones principales para este microorganismo. Sin embargo, los. IO TE. requerimientos cambian dependiendo de la variedad de Bt con el que se trabaja y la producción a gran escala presenta algunos inconvenientes de. BL. espacio y costo porque su rendimiento en biomasa no es muy alto (Pineda y Vélez, 2018). Consecuentemente, es necesario proponer estrategias para. BI. mejorar el rendimiento de producción de dicho bioinsecticida. Determinados agentes ambientales, físicos o químicos pueden alterar la estructura molecular del ADN, provocando una mayor frecuencia de mutaciones, a los mismos que se les denomina mutágenos o agentes mutagénicos. Dentro de los mutagénicos químicos se encuentran el 5-. 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Bromouracilo, etil metano sulfonato (EMS), ácido nitroso, cloruro de hidroxilamina, naranja de acridina, entre otros, pudiéndose agruparse en varias categorías como: análogo de bases, hidroxílantes, desaminantes, alquilantes e intercalares (Blas et al., 2017). El cloruro de hidroxilamina, es un compuesto que se utiliza mayormente. DO. en química analítica, agente reductor fuerte, síntesis de productos. SG RA. orgánicos, para la síntesis de: oximas. Dicho compuesto aplicado a concentraciones variadas, ha permitido la obtención de mutantes bacterianos con diferentes propósitos, tal como se reporta para los bacilos. PO. Gram positivos: Bacillus subtilis, B. thuringiensis, B. licheniformes, B.. DE. polymyxya; y Bacilos Gram negativos como E. coli. El cloruro de hidroxilamina reacciona uniéndose covalentemente al DNA, provocando. CA. la pérdida de la estructura helicoidal, ruptura de cadena, desacoplamiento. IO TE. de la doble hélice e induce mutaciones por transición GC-AT (Klug et al., 2013; Polo, 1999; Passarge, 2004; Perunov et. al, 1984; Griffith et al., 2002).. BL. Debido a la importancia de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis (Bti) en la de. bioinsecticida,. cuyos. genes. se. encuentran. muy. BI. producción. emparentados entre sí, y conociendo el efecto genotóxico del cloruro de hidroxilamina, y al no existir trabajos relacionados en nuestro país, se ha creído conveniente desarrollar una nueva estrategia que permita incrementar la producción del bioinsecticida por Bti, con la finalidad de establecer el efecto del cloruro de hidroxilamina sobre la producción del. 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. bioinsecticida, y determinar la concentración que permita una mayor producción del bioinsecticida Bti.. 1.1. Problema ¿Cuál será el efecto del cloruro de hidroxilamina a 0, 10, 20 y 30 ppm. en la. DO. producción (g/L.) de bioinsecticida de Bacillus thuringiensis H-14 var.. SG RA. israelensis después de 48 horas de fermentación en condiciones de laboratorio?. PO. 1.2. Hipótesis. La concentración de 20 ppm. de cloruro de hidroxilamina tendrá el más. DE. alto valor de producción (g./L.) del bioinsecticida de Bacillus thuringiensis. IO TE. de laboratorio.. CA. H-14 var. israelensis después de 48 horas de fermentación en condiciones. 1.3. Justificación de la Investigación. BL. El control biológico refiere a la utilización de entomopatógenos como una. BI. alternativa de menor impacto ecológico para el manejo del vector del dengue. Entre los entomopatógenos más destacados se encuentra Bt caracterizado por la producción de cristales paraesporales compuestos por proteínas con actividad antilepidóptera, anticoleóptera y antidíptera; recientemente se han identificado cepas con efectos controladores sobre. 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. fitopatógenos del grupo de los dípteros, lepidópteros entre otros (Díaz, Márquez y Fernández-Larrea, 1996). En vista que las investigaciones de procesos biotecnológicos de fermentación y producción de Bti en cantidades industriales se han realizado en países como: España, México, Argentina entre otros, lo. DO. convierte en un recurso potencial promisorio que permitiría el desarrollo. problemática. planteada. por. la. SG RA. de la economía en Perú. Adicionalmente, representa a una respuesta a la aparición. de. diversas. amenazas. epidemiológicas, como es el caso del dengue, debido a que ha aumentado. PO. el área de distribución geográfica, debido probablemente a los cambios de. DE. temperatura asociados al cambio climático, resaltando la importancia del uso de nuevas alternativas para el control del vector que propaga dicha. CA. enfermedad. Dentro de esta tendencia, el uso de bioinsecticidas como el. IO TE. Bti, es una de las mejores soluciones y es amigable con el medio ambiente. Debido a estas razones, se plantea la investigación que tiene como objetivo. BL. evaluar el efecto del cloruro de hidroxilamina en la producción de. BI. bioinsecticida de B. thuringiensis var. israelensis en condiciones de laboratorio.. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.4. Objetivos 1.4.1. General Determinar el efecto del cloruro de hidroxilamina sobre la. israelensis en condiciones de laboratorio.. SG RA. 1.4.2. Específicos. DO. producción de bioinsecticida de Bacillus thuringiensis H-14 var.. Determinar las curvas de crecimiento de Bacillus thuringiensis H-14. PO. var. israelensis expuestas a cloruro de hidroxilamina en condiciones de laboratorio.. H-14. var.. israelensis. expuestas. a. cloruro. de. CA. thuringiensis. DE. Determinar los valores de pH del proceso de crecimiento de Bacillus. hidroxilamina en condiciones de laboratorio después de 48 horas de. BI. BL. IO TE. fermentación.. 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1. Objeto de Estudio: La producción de bioinsecticida de Bacillus thuringiensis var.. SG RA. 2.1.1. Material Biológico:. DO. israelensis (Bti) expuesto al cloruro de hidroxilamina.. Cepa de Bacillus thuringiensis var. israelensis, que fue proporcionada. PO. por la Dra. Gina Genara Zavaleta Espejo (ANEXO 2).. DE. 2.1.2. Agente mutagénico:. IO TE. Blas Cerdán.. CA. Cloruro de Hidroxilamina sólido proporcionado por el Dr. Willian. 2.1.3. Población. BL. Las colonias de cepas de Bti que participaron en los experimentos. BI. cultivados in vitro.. 2.1.4. Tamaño Muestral El tamaño muestral fue calculado en base a los tratamientos y el número de repeticiones. En este experimento, como está explicado a detalle en la siguiente sección, se empleó 4 tratamientos y constó de. 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. tres repeticiones por tratamiento, dando un total de 12 unidades muestrales.. 2.2. Instrumentación: La producción de bioinsecticida de Bacillus thuringiensis var.. DO. Israelensis se evaluó considerando los siguientes indicadores: Curva de crecimiento bacteriano. . Producción de bioinsecticida expresado en gramos por litro. . pH del proceso. PO. SG RA. . CA. 2.3.1. Métodos:. DE. 2.3. Métodos y Técnicas. IO TE. 2.3.1.1. Tipo de Estudio Por su naturaleza, el presente estudio desarrollado es de tipo explicativo, porque se aboca al estudio del efecto de la variable. BL. independiente sobre la variable dependiente.. BI. 2.3.1.2. Diseño de Investigación. Se realizó un estudio experimental tipo experimento puro, puesto que se posee el grupo control además de los tratamientos.. 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Las variables son la concentración del cloruro de hidroxilamina que se aplicó en el medio de cultivo de Bti para inducir las mutaciones y la producción de bioinsecticida de Bacillus thuringiensis H-14 var. israelensis después de haberse expuesto. DO. al cloruro de hidroxilamina.. 2.3.2.1.. SG RA. 2.3.2. Técnicas Diseño Experimental:. PO. Se utilizó un diseño experimental completamente aleatorizado, donde cada concentración es un tratamiento y cada tratamiento. Procedimiento. CA. 2.3.2.2.. DE. se repitió tres veces (ANEXO 3).. IO TE. A. Diseño de exposición del Bti al mutágeno Se eligieron cuatro concentraciones incluyendo al control: 0. BL. ppm., 10 ppm., 20 ppm., 30 ppm. de cloruro de. BI. hidroxilamina; luego se procedió a realizar la siembra en placa a 37°C por 48 horas, se siguió un diseño experimental completamente aleatorizado (ANEXO 4).. B. Diseño de los Biorreactores Se diseñaron y construyeron cuatro biorreactores tipo Tanque Cilíndrico Aireado Agitado (TCAA) de dos litros de. 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. capacidad, con un volumen de trabajo de 1,4 L y flujos de aire de 0,5 vvm a 220 rpm de agitación. Para ello se empleó acero inoxidable, con tapas herméticas acondicionadas con orificios de salida de CO2; la entrada de aire se realizó por la parte inferior de los tanques, y se colocó llaves para la. DO. toma de las muestras (ANEXO 5 y 6). Los biorreactores. SG RA. fueron esterilizados con luz UV por media hora, y el aire insuflado se esterilizó por burbujeo en una solución de NaCl al 30% (Mendoza y Robles, 2000).. PO. C. Preparación del medio fermentativo y de recuento. DE. Para la obtención del bioinsecticida se tomó como referencia un medio de producción a gran escala (Abarca et. CA. al., 1992), el medio fermentativo se esterilizó en autoclave a. IO TE. 121°C / 15 min. a 1 atm. de presión (ANEXO 7). También, se preparó placas con Agar Nysma para el recuento que se. BL. realizó durante el bioproceso (ANEXO 8, 9 y 10).. BI. D. Estandarización del inóculo Se obtuvo una suspensión densa de Bti mutante en solución salina fisiológica al 0,9% para cada tratamiento, a partir de ellas se hicieron diluciones hasta obtener una concentración de 109 UFC/ml. (ANEXO 11) (Pescoran, 1998).. 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. E. Inoculación de Bti mutante en los biorreactores Se agregó 170 ml. de la suspensión bacteriana del inóculo a cada uno de los biorreactores conteniendo 1230 ml. de medio fermentativo, según los tratamientos considerados. DO. (ppm.), la inoculación se llevó a cabo en agitación y. (30+1°C) (ANEXO 12).. F. Registro de datos. SG RA. aireación constante con un pH 7.0 a temperatura regulada. PO. El bioproceso duró 48 horas, durante la fermentación se. DE. realizó muestreos cada 8 horas, incluyendo el tiempo cero, se tomaron 5 ml. de medio fermentativo para evaluar pH,. CA. recuento de células por el método de recuento en placa. IO TE. (ANEXO 13 y 14). Se realizaron coloraciones con verde de malaquita. modificado. y. Gram. para. el. control. BI. BL. microbiológico (ANEXO 15 y 16) (Parry et al., 1988).. G. Obtención del bioinsecticida Una vez terminado el tiempo de fermentación, se centrifugó el medio fermentativo de los diferentes biorreactores a 3500 rpm. por 30 minutos, eliminándose el sobrenadante (ANEXO 17, 18 y 19). El precipitado se deshidrató a 40 ºC 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. (ANEXO 20) por 7 días, la biomasa seca fue triturada y pesada. Se consideró como formulación insecticida al contenido total de esporas, cristales proteicos y residuos celulares, cuantificándose en gramos de peso seco por litro (ANEXO 21).. DO. H. Análisis Estadístico. SG RA. Con los datos obtenidos se realizaron los cálculos para determinar la existencia de diferencias significativas entre los tratamientos con respecto al peso seco del bioinsecticida. PO. y las concentraciones del agente mutagénico (Sokal, 1980).. DE. Se utilizó el software libre R para determinar la curva de. BI. BL. IO TE. CA. crecimiento logarítmico, con una PE=0.05.. 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESULTADOS En la figura 1, se observa los valores de pH de las muestras de cada biorreactor con Bacillus thuringiensis var. Israelensis, expuestas a 4 tratamientos con cloruro de hidroxilamina (0, 10, 20, 30 ppm.), para. DO. controlar el bioproceso se realizó muestreos secuenciales cada 8 horas. SG RA. desde el inicio de la producción. El pH se mantuvo prácticamente constante con una ligera disminución de su valor inicial. En la figura 2, se observa la curva de crecimiento de las colonias de. PO. Bacillus thuringiensis var. Israelensis, mostrando el desarrollo en. DE. UFC/ml. de los 4 tratamientos con cloruro de hidroxilamina (0, 10, 20, 30 ppm.), donde se puede notar que el tratamiento de 20ppm. de. CA. cloruro de hidroxilamina es el que presente los valores más altos de. IO TE. crecimiento y el Tratamiento de 10 ppm. posee los valores más bajos. La Tabla 1, muestra los valores de rendimiento en gramos por litro. BL. de Bacillus thuringiensis var. Israelensis expuestos a los 4 diferentes tratamientos con cloruro de hidroxilamina a las 48 horas de. BI. crecimiento. Se puede observar que los valores más altos de producción (2.05, 2.17 y 2.09) corresponden al tratamiento con 20 ppm. de cloruro de hidroxilamina, mientras que los valores más bajos de producción (0.99, 0.8 y 1) corresponden al tratamiento con 10 ppm. de cloruro de hidroxilamina.. 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Para determinar la existencia de diferencias significativas entre los promedios de producción de los tratamientos, se aplicó el Análisis de Varianza Simple para un Diseño Experimental Completamente Aleatorizado con un nivel de confianza de 95% (Tabla 2). El Análisis de varianza reporto diferencias significativas entre las medias de los. DO. tratamientos (p < 0.05); por lo tanto, aplicamos una prueba de mayor. SG RA. rigurosidad para poder identificar grupos homogéneos entre los tratamientos. La prueba de comparación de medias de Tukey (Tabla 3) con un nivel de confianza de 95% indica que las medias de los 4. PO. tratamientos presentan diferencias entre si y no existe ningún grupo. BI. BL. IO TE. CA. DE. homogéneo.. 19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. pH 8 7. DO. 6. SG RA. pH. 5 4 3. PO. 2. 0 8H. 16 H. 24 H. 32 H. 40 H. 48 H. Tiempo T1. T2. T3. T4. IO TE. CA. 0H. DE. 1. Figura 1. pH del crecimiento de Bacillus thuringiensis var. Israelensis,. BL. expuestas a 4 tratamientos con cloruro de hidroxilamina (0, 10, 20, 30. BI. ppm.) evaluado cada 8 horas durante 48 horas. Leyenda: T1 = 0 ppm., T2 = 10 ppm., T3 = 20 ppm., T4 = 30 ppm. de cloruro de hidroxilamina. 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Curva de crecimiento de Bti. DO. 1.40E+11 1.20E+11. SG RA. 1.00E+11 8.00E+10 6.00E+10. PO. 4.00E+10 2.00E+10. DE. 0.00E+00 0H. 8H. 16H. T2. 32H T3. 40H. 48H. T4. CA. T1. 24H. var.. IO TE. Figura 2. Curva de crecimiento de Bacillus thuringiensis. Israelensis, expuestas a 4 tratamientos con cloruro de hidroxilamina. BL. (0, 10, 20, 30 ppm.) evaluado cada 8 horas durante 48 horas. Leyenda: T1 = 0 ppm., T2 = 10 ppm., T3 = 20 ppm., T4 = 30 ppm. de. BI. cloruro de hidroxilamina. 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla Nº1. Rendimiento (gr./L) de Bacillus thuringiensis var. Israelensis, expuestas a 4 tratamientos con cloruro de hidroxilamina (0, 10, 20, 30. 2. 3. SG RA. 1. DO. ppm.) evaluado a las 48 horas con 3 repeticiones cada uno.. 1.19. 1.26. 1.22. T2. 0.99. 0.8. 1. T3. 2.05. T4. 1.51. 2.17. 2.09. 1.45. 1.6. IO TE. CA. DE. PO. T1. Leyenda: T1 = 0 ppm., T2 = 10 ppm., T3 = 20 ppm., T4 = 30 ppm. de. BL. cloruro de hidroxilamina. BI. 1 = Primera repetición, 2 = Segunda repetición y 3 = Tercera repetición.. 22. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla Nº2. Análisis de varianza para rendimiento (gr./L) de Bacillus thuringiensis var. Israelensis, expuestas a 4 tratamientos con cloruro de. Fuente. Suma de Cuadrados. Gl. SG RA. DO. hidroxilamina (0, 10, 20, 30 ppm.) evaluado a las 48 horas.. Cuadrado. Razón-F. Valor-P. 128.97. 0.0000. Intra grupos. 0.0467333. Total (Corr.). 2.30689. 3. DE. 2.26016. 8. 0.753386 0.00584167. 11. IO TE. CA. Entre grupos. PO. Medio. BL. P.E: 0.05. BI. Leyenda: T1 = 0 ppm., T2 = 10 ppm., T3 = 20 ppm., T4 = 30 ppm. de cloruro de hidroxilamina. 23. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla Nº3. Comparación de promedios aplicando la prueba Tukey para rendimiento (gr./L) de Bacillus thuringiensis var. Israelensis, expuestas a 4 tratamientos con cloruro de hidroxilamina (0, 10, 20, 30 ppm.) evaluado a. Casos. Media. Grupos Homogéneos. 0.93 X. T2. 3. T1. PO. Tratamientos. SG RA. DO. las 48 horas.. 1.22333. 3. 1.52. 3. 2.10333. DE. T4. 3. CA. T3. X X X. IO TE. P.E: 0.05. BL. Leyenda: T1 = 0 ppm., T2 = 10 ppm., T3 = 20 ppm., T4 = 30 ppm. de. BI. cloruro de hidroxilamina “X”: indica una diferencia significativa. 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DISCUSIÓN Bacillus. thuringiensis. (Bt). son. bacterias. entomopatógenas. ampliamente utilizadas como insecticidas biológicos para el control de plagas. agrícolas. y. poblaciones. de. insectos. portadoras. de. DO. enfermedades (Gomez et al., 2018). Esta característica nos lleva a tratar. SG RA. de mejorar la producción de dicho bioinsecticida para usarlo en el control biológico de plagas. B. thuringiensis es un organismo que se reproduce rápidamente y puede dar origen en poco tiempo a grandes. PO. poblaciones, sin embargo, experimenta fenómenos de mutación al. DE. azar. Dichas mutaciones pueden conllevar a la alteración del genoma y en ocasiones también del fenotipo que son las características. thuringiensis. IO TE. Bacillus. CA. externas del organismo (Zavaleta, 2010).. microorganismo. que. se. H-14 puede. var.. Israelensis. cultivar. en. (Bti). es. fermentadores. un o. BL. biorreactores de tanque aireado y agitado que son eficientes ya que. BI. permiten una producción con menos contaminación, mejor calidad y alta transferencia de oxigeno (Zavaleta E., 2010). La optimización de los parámetros de cultivo, así como la composición del medio, no solo podría mejorar el nivel de producción de delta-endotoxinas de B. thuringiensis, sino que también dar lugar a. 25. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. importantes ventajas para la economía global del proceso (Zribi Zghal et al., 2018). Se realizaron estudios a nivel de laboratorio, se demostró las características morfológicas de las colonias de Bacillus thuringiensis var. Israelensis, las cuales presentan bordes irregulares, opacas de color. DO. cremoso, rugosas y sobrelevantadas, algunas de las colonias expuestas. SG RA. a cloruro de hidroxilamina por 72 horas mostraron las siguientes características fenotípicas: las colonias son de forma circular con prolongaciones protuberantes, pero siguen manteniendo su color. PO. cremoso y aspecto rugoso (ANEXO 22). Esto corrobora lo sustentado. DE. por el trabajo de Zavaleta (2010) que encontró las mismas características en algunas de las colonias expuestas a cloruro de. CA. hidroxilamina (Zavaleta, 2010).. IO TE. Es necesario tener en cuenta que los cambios fenotípicos observados pueden deberse a la acción del agente mutagénico. BL. utilizado: cloruro de hidroxilamina el cual es un agente intercalante poderoso capaz de causar mutaciones de tipo transición GC – AT. BI. (Klug et al., 2013; Polo, 1999 y Griffith et al., 2002) debiéndose a su acción específica a la hidroxilación del grupo amino ubicado en el carbono 4 de la citosina formándose N-4 hidroxicitosina la cual tiene un comportamiento similar a la timina, lo que va a determinar su nuevo apareamiento con la adenina, dicho apareamiento es incorrecto. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. porque en la secuencia correcto debería aparearse con la guanina (Zavaleta, 2010). Después de las replicaciones de ADN que ocurren antes de cada división celular, el cambio en el genotipo se hace notorio y evidente en el fenotipo. El número de unidades formadores de colonias (UFC) de Bacillus. DO. thuringiensis var. Israelensis observados con intervalos de 8 horas. SG RA. mostro variaciones entre 4 tratamientos con cloruro de hidroxilamina (0, 10, 20 y 30 ppm.), donde se puede notar que el tratamiento de 20ppm. de cloruro de hidroxilamina es el que presente los valores más. PO. altos de crecimiento y el tratamiento de 10 ppm. posee los valores más. DE. bajos. A la vez se observa que el tratamiento con 0 ppm. tuvo un mayor crecimiento que el de 10 ppm. y el de 30 ppm. tuvo un. CA. crecimiento todavía mayor que este último. En resumen, el. IO TE. crecimiento de los 4 tratamientos, ordenado de menor a mayor es el siguiente: 10 ppm. < 0 ppm. < 30 ppm. < 20 ppm. De este resultado se. BL. puede inferir que el cloruro de hidroxilamina presenta un efecto negativo en el crecimiento fuerte a 10 ppm. y 30 ppm., siendo 20 ppm.. BI. la dosis que estimula en mayor medida el crecimiento de colonias de Bti, esto concuerda con lo encontrado por Zavaleta (2010) con cloruro de hidroxilamina en la misma bacteria. Adicionalmente, durante los ensayos de laboratorio, se probó una concentración mayor a 30 ppm resulto en una inhibición completa del crecimiento. Esto nos. 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. demuestra que el cloruro de hidroxilamina sobre el crecimiento de B. thuringiensis es inhibidor-estimulador-inhibidor completo, debido a esto se debe de usar una dosis única de mutágeno si se desea aumentar al máximo la producción del bioinsecticida. El máximo rendimiento de producción del bioinsecticida de Bti al. DO. final del bioproceso se logró a una concentración de 20 ppm de cloruro. SG RA. de hidroxilamina, con un peso seco promedio de 2.05, 2.17 y 2.09 g/L en sus tres repeticiones (Tabla 1). Este resultado es mayor al conseguido por Abarca et al quien halló una producción final de 1,78 y. PO. 1,40 g/L de peso seco entre 24 y 48 horas de fermentación; sin. (Blas et al., 2017).. DE. embargo, estos valores podrían incrementarse después de las 56 horas. CA. Los resultados conseguidos en el presente trabajo se encuentran por. IO TE. debajo de la producción del bioinsecticida de Bti obtenida por Blas et al. (2015), quien reporta 2.78 g/L de peso seco promedio. Esto se. BL. puede deber a algunas dificultades o limitaciones que tuvieron lugar durante el bioproceso, así como al uso de un medio base y no. BI. suplementado con alguna fuente de proteínas adicional lo que si ocurrió en la otra investigación. Los resultados distintos en la producción del bioinsecticida de Bti mutante indicado con sus promedios fueron confirmados por el análisis de varianza (Tabla 2). Consecuentemente, se hizo necesario. 28. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. aplicar un método más riguroso, específico y exacto, la prueba de comparación de medias de Tukey (Tabla 3), para determinar entre que tratamientos existen tales diferencias (Sokal 1980, 510-612). Es necesario precisar que el proceso de fermentación de Bti se lleva a cabo en condiciones óptimas a un pH de 7,0 y a una temperatura de. DO. 30°C (Blas et al., 2015); y el presente bioproceso ocurrió a un pH inicial. SG RA. de 7,0, disminuyendo a partir de las 8 horas para llegar a un valor ligeramente ácido de 6.0 a las 48 horas (Figura 1); esto se puede deber a la producción de proteínas por la bacteria que causaron la variación. PO. del valor de pH tornándolo más ácido.. DE. La producción del bioinsecticida por Bacillus thuringiensis H-14 var. israelensis (Bti), requiere de un medio adecuado para el crecimiento,. CA. esporulación y la formación de la δ – endotoxina, además de conocer. IO TE. los requerimientos nutricionales principalmente de carbono y nitrógeno (Robles, 1995).. BL. El objetivo de la presente investigación es mejorar la producción del bioinsecticida por Bti, por ello se consideró emplear diferentes. BI. concentraciones del mutágeno cloruro de hidroxilamina para inducir mutaciones en las bacterias y usar un medio base de fermentación, debido a esto los cambios observados en el rendimiento se deberían únicamente al mutágeno.. 29. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Existen otras variables que se deben considerar en la producción del bioinsecticida Bti, como son la velocidad de agitación y el suministro de oxígeno, para evitar la acumulación de calor e inhibición o reducción de la calidad de la proteína biocida (Blas et al., 2017). Se sugiere que la fuente de aireación en el medio es esencial. DO. para la esporulación; y la ausencia o disminución de oxígeno solo. SG RA. produce un crecimiento vegetativo.. Por lo tanto, se utilizó un biorreactor tipo tanque cilíndrico aireado y agitado (ANEXO 5 y 6), que permite una alta transferencia de. PO. oxígeno y en consecuencia un crecimiento ideal de Bti en el medio. DE. fermentativo (Zavaleta E., 2010). La producción de Bti mutante en la presente investigación se encuentra sobre las halladas en otras. CA. investigaciones. Por otro lado, las colonias de Bti mutante presentan. IO TE. poca estabilidad y los resultados hallados no son altamente reproducibles, por lo tanto, lograr la estabilidad del mutante es una. BL. finalidad a cumplir (Blas et al., 2017). Existe la necesidad de incrementar el ratio de investigaciones. BI. relacionadas a los resultados del presente ensayo, con el objetivo de aprovechar mejor los genes de B. thuringiensis H-14 var. israelensis en la obtención de bioinsecticidas y a su vez mejorar el rango de acción de las proteínas biocidas contra distintos organismos plaga; utilizando técnicas inducidas de mutación al azar (Blas et al., 2015).. 30. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se debe potenciar y masificar la utilización del bioinsecticida Bti, como un producto con desarrollo sustentable por ser biodegradable, efectivo, seguro y con limitados impactos ambientales; por lo cual se debe iniciar algunas estrategias que permitan implementar normas y. BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. políticas para la implementación de su uso.. 31. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. CONCLUSIONES. . La concentración de 20 ppm. de cloruro de hidroxilamina. DO. tuvo el más alto valor de rendimiento (2.10g/L) de. SG RA. producción de bioinsecticida. Por lo tanto, se determinó que no existe una relación directa entre la producción y la concentración del mutágeno.. Las curvas de crecimiento de Bacillus thuringiensis H-14 var. presentaron. diferencias. significativas,. DE. israelensis. PO. . coincidentemente la curva de crecimiento de 20 ppm. de. Los valores de pH del bioproceso fueron disminuyendo. IO TE. . CA. cloruro de hidroxilamina presento los valores más altos.. levemente partiendo de un valor inicial de 7 hasta un pH. BI. BL. final de 6.. 32. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(45) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Y ELECTRÓNICAS . Abarca, C., A. Martínez, M. Caro y R. Quintero. (1992). Optimización. . SG RA. Aisawai. Universidad: Ciencia y Tecnología.. DO. del proceso de fermentación para producir Bacillus thuringiensis var.. Blas-Cerdán, W; Zavaleta-Espejo, G; Saldaña-Jiménez, J; PedroHuamán, J; Lezama-Ascencio, P. & Tuesta-Collantes, L. (2015).. PO. Obtención de Bacillus thuringiensis H-14 var. israelensis mutante y producción de bioinsecticida por fermentación con sanguaza. Revista Pakamuros,. 2(2),. DE. Científica. 29–38.. Recuperado. de. 0/pdf%0D. Blas-Cerdán, W., Zavaleta-Espejo, G., Saldaña-Jiménez, J., Blas-. IO TE. . CA. https://www.unj.edu.pe/ojs/index.php/pakamuros/article/view/4. Roeder, W., & Meléndez-Rodríguez, D. (2017). Efecto biocida de. BL. Bacillus thuringiensis H-14 var. israelensis mutante sobre larvas III de. BI. Aedes aegypti bajo condiciones de laboratorio, 37(2), 14–21. Recuperado de. http://revistas.unitru.edu.pe/index.php/facccbiol/article/viewFile/ 2137/2030. 33. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(46) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . Carvalho, S; Crespo, M. M; Araújo, A. P; Santana, R; Melo-santos, M. A. V; De, Maria, C. & Lobo, N. (2018). Long-term exposure of Aedes aegypti to Bacillus thuringiensis var. israelensis did not involve altered susceptibility to this microbial larvicide or to other control agents, 1– 11.. Recuperado. de. DO. https://parasitesandvectors.biomedcentral.com/track/pdf/10.1186/s. . SG RA. 13071-018-3246-1. Chavez Pardo, K. C., & Garboza Torres, A. S. (2018). Efecto biocida de cepas nativas de Bacillus sp. aisladas de humus sobre larvas de. PO. Anopheles sp. obtenidas en el distrito de Motupe, 2016. Universidad de Recuperado. de. DE. Lambayeque.. http://repositorio.udl.edu.pe/handle/UDL/135 Díaz, A., Márquez, M. E. y Fernández-Larrea, O. (1996). «Influencia de. CA. . IO TE. la composición del medio de cultivo en la producción por cultivo sumergido de diferentes cepas de Bacillus thuringiensis», IV Encuentro. . BL. Científico-Técnico de Bioplaguicidas, La Habana, p. 27. Doolotkeldieva, T., Leclerque, A., Bobusheva, S., & Schuster, C. (2018).. BI. Biodiversity of Bacillus thuringiensis Strains and Their Cry Genes in Ecosystems of Kyrgyzstan. Advances in Bioscience and Biotechnology, 09(03), 107–126. https://doi.org/10.4236/abb.2018.93009. . Gómez-Vargas, W., Valencia-Jiménez, K., Correa-Londoño, G., & Jaramillo-Yepes, F. (2018). Novel larvicide tablets of Bacillus. 34. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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