CAPÍTULO 2 20
2.5 Propiedades ópticas
2.5.2 Fluorescencia en solución
La luminiscencia es la emisión de luz de una sustancia y ocurre a partir de estados electrónicos excitados. La luminiscencia se divide formalmente en dos categorías, la fluorescencia y la fosforescencia, dependiendo de la naturaleza de los estados excitados. La fluorescencia tiene una rapidez de emisión típica de 108s-1, por lo que el tiempo de vida típico de la fluorescencia es del orden de los 10ns.
En estados excitados singulete, el spin del electrón en el orbital excitado está apareado al electrón en el orbital del estado basal. Esta es la razón por la cual el decaimiento al estado basal es permitido, y por tanto sucede rápidamente.
La fosforescencia es la emisión de luz de estados triplete, en los cuales el electrón en el orbital excitado tiene la misma orientación de espín que el electrón en el estado basal. Por esta razón las transiciones al estado basal están prohibidas y y como consecuencia los tiempos de vida en la fosforescencia son mucho mayores. Una forma muy útil de ilustrar los procesos que ocurren entre la absorción y la emisión de luz son los diagramas de Jablonski (ver figura 2.7).
Fosforescencia hvP
Cruce Intersistémico
Fluorescencia hvF
hvA
S2
2 1 0
S1
S0 hvA
Conversión Interna
T1
Figura 2.7 Forma representativa del diagrama de Jablonski
Los estados electrónicos singulete basal, y excitados primero, y segundo se identifican por S0, S1, y S2 respectivamente. En cada uno de estos niveles electrónicos de energía, los fluoroforos pueden existir en un número de niveles de energía vibracionales identificados por 0, 1, y 2, etc. Las transiciones entre los estados se identifican como líneas verticales para ilustrar la naturaleza instantánea de la absorción luminosa. Las transiciones ocurren en aproximadamente 10-15s, un tiempo muy corto para que se tenga un desplazamiento significante del núcleo. Este fenómeno se conoce como principio de Franck-Condon.
La energía térmica también es una fuente que produce excitación molecular, sin embargo, esta excitación vibracional no es suficiente para poblar significativamente de estados excitados S1 en la mayoría de los casos. Por lo que generalmente se utiliza un haz luminoso para lograr la excitación previa a la luminiscencia. Algo importante a considerar es que existe un proceso previo a la luminiscencia, y dicho proceso es una pérdida de energía por conversión interna que sucede en 10-12s o menos. Ya que los tiempos de vida de fluorescencia son típicamente cerca de 10-
8s, la conversión interna se completa antes que la emisión. Por lo tanto, la emisión de fluorescencia generalmente resulta de un estado excitado equilibrado térmicamente, que es el más bajo estado de energía vibracional S1. El regreso al estado basal típicamente ocurre a una alta excitación vibracional del estado basal.
Examinando el diagrama de Jablonski, se puede observar que la energía de emisión es típicamente menor que la de absorción, por lo que la fluorescencia típicamente
sucede a mayores longitudes de onda. A este desplazamiento energético se le conoce como desplazamiento de Stokes (νA-E) (ver figura 2.8).
El rendimiento cuántico Φ representa la fracción de fotones emitidos respecto de los fotones absorbidos, (Φ=fotones Em/Fotones Abs.). En cuanto a su determinación, esta medición se realiza indirectamente mediante la comparación de la fluorescencia del analito con la de un estándar conocido.
En la tabla 2.1 se muestran algunos valores de rendimiento cuántico de estándares típicamente empleados en estudios de fluorescencia. Las densidades ópticas típicamente utilizadas son de alrededor de 0.05 para evitar los efectos de filtrado interno de la señal.
El rendimiento cuántico Φ de un material desconocido se calcula entonces utilizando la ecuación:
2
m m est
est
est est m
n F A
n F A
(2.8)
Donde n, representa el coeficiente de refracción del disolvente del estándar (est) y la muestra (m), F la integral de la intensidad de la fluorescencia del estándar y la muestra, y A la densidad óptica (absorbancia) a la longitud de onda de excitación para la muestra y el estándar.[75] Existe una serie de estándares comúnmente empleados en las mediciones de rendimiento cuántico, de los cuales es recomendable utilizar un estándar acorde al rendimiento cuántico esperado en el analito para disminuir errores de la medición, pues de acuerdo con la formulación, una intensidad de fluorescencia mayor en la muestra que en el estándar, tiende a incrementar el error de la medición (
F
m/ F
est 1
).El tiempo de vida es también importante, y éste determina el tiempo disponible para que el fluoróforo interactúe con su ambiente. En este sentido, son importantes dos constantes que disminuyen la población de estados excitados, la razón de decaimiento radiativo Г,y no radiativo knr. La absorción es proporcional a la suma de estas razones de decaimiento ya que ésta suma representa la despoblación total de estados excitados; mientras que la emisión es proporcional a Г, porque representa la despoblación radiactiva de los estados excitados. En este sentido entonces:
knr
(2.9)
250 300 350 400 450 500 550 600
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
E10
Em
Absorción Emisión
Absorbancia normalizada
Longitud de Onda
Abs
HHBWA
10%=365.6nm A=0.1
E10*
HHBWE
A-E
Figura 2.8 Determinación del ancho de banda de los espectros de absorción y emisión (HHBWA y HHBWE), su longitud de onda (λA , y λE), desplazamiento de Stokes(νA-E) y la
energía del primer estado excitado (E10)
Tabla 2.1. Rendimientos cuánticos (T=22°C) de estándares típicamente utilizados en la determinación del rendimiento cuántico.[75]
Compuesto disolvente λEX Φ
Sultafo de Quinina 0.1M H2SO4 350 0.577
366 0.53
POPOP1 Ciclohexano 366 0.97
2-Aminopiridina 0.1N H2SO4 385 0.60±0.05 Fluoresceína 0.1M H2SO4 496 0.95±0.03
1 POPOP 2,2’-(1,4-fenilen)bis[5-fenilozazole]
El rendimiento cuántico puede acercarse a la unidad, si la razón de decaimiento no radiativo knr es mucho menor que la razón de decaimiento radiactivo. Nótese que el rendimiento energético de la fluorescencia es siempre menor que la unidad debido a las pérdidas por conversión interna.
Un dato importante del diagrama de Jablonski es la energía a partir de la cual inicia la emisión (E10), y se calcula normalmente mediante la intersección de los espectros de absorción y emisión normalizados en su longitud de onda de máxima intensidad, sin embargo, también se puede determinar desde el mismo espectro de emisión. En este segundo método se identifica primeramente la pendiente en el punto con el 10% de la emisión, el punto de intersección con el eje de la ordena (longitud de onda) es el punto que se identifica como el valor de inicio (onset) de la emisión tal como se muestra gráficamente en la figura 2.9. Debido a la connotación geométrica de esta técnica para la determinación de E10, es posible realizar el cálculo directamente aplicando la ecuación:
10 10%
10%
E 0.1
m
(2.10)
Donde λ10% representa la energía en eV a la cual se tiene una emisión del 10% del máximo, y m10% la pendiente en este mismo punto que puede ser determinada numéricamente.
Esta técnica es particularmente útil cuando las moléculas cuentan con cromóforos no emisivos cuya absorción rivaliza con la absorción de cromóforos emisivos o fluoróforos. En este tipo de materiales los espectros de emisión y absorción pueden traslaparse incluso contar con máximos a casi la misma longitud de onda, por lo tanto es de mayor utilizad usar el este segundo método aplicando la ecuación (2.10) .
El ancho de banda de los espectros tanto de emisión como de absorción son una medida cualitativa de la diversidad de confórmeros posibles en una molécula.
Normalmente los espectros de emisión cuentan con un menor ancho de banda (HHBWE) debido a que en el estado excitado las moléculas cuentan preferentemente con geometrías más planas que en el caso del estado basal.
4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8
1.0 EMISION
Pl
Energía (eV)
Em=0.10
10%=3.52eV y=m(x-a)
E10
Figura 2.9 Esquema del cálculo de E10 mediante el onset del espectro de emisión.
2.5.2.1 Fluorescencia resuelta en el tiempo.
Hay dos métodos para realizar mediciones de fluorescencia resuelta en el tiempo, o fluorescencia dinámica. Los métodos de dominio en el tiempo, y de dominio en la frecuencia. En el dominio en el tiempo, la muestra es excitada con un pulso de luz (ver figura 2.10). Es importante tomar en cuenta que el ancho del pulso debe ser más corto que el tiempo de decaimiento τ de la muestra. La intensidad se mide seguida de la excitación en función del tiempo, y el tiempo de decaimiento τ se calcula de la pendiente de un gráfico tal como se muestra en la figura 2.10.
En el método del dominio en la frecuencia, la muestra es excitada con luz a una intensidad modulada, típicamente con una modulación sinusoidal. La intensidad de la luz incidente se varía a alta frecuencia, típicamente cerca de 10MHz, dependiendo del rango del tiempo de vida. Cuando la muestra fluorescente se excita, la emisión es forzada a responder a la misma frecuencia modulada. El tiempo de vida del fluoróforo causa un retardo relativo a la excitación. Este retardo se mide como un cambio de fase (ϕ), que puede ser usado para calcular el tiempo de decaimiento.
Figura 2.10 Medición del tiempo de vida con dominio en el tiempo
Para entender el significado del tiempo de vida, supóngase que una muestra que contiene un fluoróforo es excitada con un pulso infinito de luz. Este dará lugar a una población inicial (n0) de fluoróforos en el estado excitado. La población de estados excitados decae a una velocidad dn(t) donde n(t) representa la población de estados excitados en el tiempo t después de la excitación. Partiendo de que la emisión es un evento al azar, y que cada fluoróforo excitado tiene la misma probabilidad de emitir en un periodo de tiempo dado, éste da como resultado un decaimiento exponencial de la población del estado excitado.
( )
0exp( / )
n t n t
(2.11)En experimentos de fluorescencia no se observa el número de moléculas excitadas, pero en lugar de ello se observa la intensidad de fluorescencia, que es proporcional a n(t). Por lo tanto la ecuación (2.11) se puede escribir también en términos de la intensidad y de esta forma se tiene que:
( )
0exp ( / )
I t I t
(2.12)Donde I0 es la intensidad en el tiempo t=0 y τ es el tiempo de vida. En la determinación del tiempo de vida, la ecuación (2.12) también se puede expresar en su forma logarítmica como:
0
ln( )I ln(I ) 1t
(2.13)
Esta es la ecuación de una recta con ordenada en el origen ln(I0)cuya pendiente es 1/τ, de esta forma es que el inverso del tiempo de vida puede ser obtenido a partir de esta ecuación(2.13).
Tomando en cuenta que Γ es la razón de decaimiento radiativo y krn la de decaimiento no radiativo, debido a que ambas constantes son responsables de la despoblación de estados excitados, entonces el rendimiento cuántico también estará dado por:
knr
(2.14)
Ahora bien, tomando en cuenta que la emisión por fluorescencia es un proceso al azar, sólo algunas moléculas emitirán sus fotones a t=τ y otras lo harán de forma no radiativa, en ese sentido es que:
1 knr
(2.15)
Por consiguiente, las razones de decaimiento radiativo y no radiativo estarán determinadas por:
; knr 1
(2.16)
2.5.2.2 Decaimiento Multiexponenciales.
En el modelo multiexponencial de decaimiento, la intensidad de fluorescencia es asumida como una suma de decaimientos individuales monoexponenciales:
1
( ) exp( / )
n
i i
i
I t t
(2.17)En esta expresión τi son los tiempos de decaimiento, αi representa las amplitudes a t=ti, y n es el número de tiempos de decaimiento. Este es el modelo más comúnmente usado, pero el significado de los parámetros (αi y τi) depende del sistema que se estudia. Lo más obvio es que el comportamiento multiexponencial se deba a la existencia de distintos fluoróforos con distintos tiempos τi, pero de hecho algunas muestras que contienen sólo un fluoróforo muestran decaimientos más complejos que un exponencial debido a diversas variables del decaimiento, como diferencias en las velocidades de conversión interna.[76] Independientemente
del ambiente y otras variables, en el decaimiento multiexponencial originado con un solo fluoróforo o múltiples fluoróforos, los valores αi y τi pueden ser usados para determinar la fracción de contribución (fi) de cada tiempo de decaimiento a la intensidad de estado estable. Estos valores están dados por:
( )
i i i
j j j
f
(2.18)Los términos αi y τi son proporcionales al área bajo la curva individual de decaimiento para cada exponencial. En estado estable se miden todas las emisiones independientemente de cuándo el fotón es emitido. Para una mezcla de fluoróforos, los valores de fi representan la fracción de intensidad de cada fluoróforo en cada longitud de onda observada. Sin embargo, los valores obtenidos de fi
pueden no correlacionarse bien con las intensidades esperadas debido a problemas de resolución de un decaimiento multiexponencial.
En muchos análisis de decaimiento la intensidad total no es medida, y Σαi se normaliza a la unidad, al igual que Σfi. Por lo tanto para un ajuste de tres tiempos de decaimiento hay típicamente cinco parámetros independientes. Tres tiempos de vida, y dos amplitudes. Sin embargo, muchos programas requieren que todas las amplitudes permanezcan variables durante el procedimiento de ajuste, y los valores de Σαi son normalizados al final de análisis. En estos casos uno es ajustado a la intensidad total y hay tres parámetros variables.
Cuando se usa la ley de decaimiento multiexponencial es útil determinar el tiempo de vida promedio. El tiempo de vida promedio para un decaimiento multi exponencial está dado por:
i i i