UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

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FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

“HIDROLISIS ENZIMÁTICA DEL SUSTRATO OBTENIDO DE LA TORTA DE SACHA INCHI (Plukenetia Volubilis Linneo)

PARA MEJORAR LA CALIDAD PROTEICA”

TESIS

PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE INGENIERO QUÍMICO

PRESENTADO POR:

Bach. QUISPE QUISPE, Liz Yaneth.

Bach. ROJAS VILLANUEVA, Marcos.

HUANCAYO – PERÚ 2013

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ASESOR:

MG. SALVADOR TEÓDULO ORE VIDALON

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DEDICATORIA

En primer lugar a Dios, porque me dio la oportunidad de vivir y regalarme una familia maravillosa. Con mucho cariño para mis padres, Manuel y Angélica, ejemplos dignos de superación y entrega, porque en gran parte gracias a ustedes, hoy puedo ver alcanzada una de mis metas. Va por ustedes, por lo que valen, porque admiro su fortaleza y por lo que han hecho de mí. A mi hermano Eduardo.por su cariño y consejos.

Liz Yaneth.

Hoy es un día como otro en el cual agradezco a Dios por iluminar cada paso firme que doy en esta vida, este trabajo va dedicado a una mujer que confió en mí, quien hizo el papel de mejor amiga, consejera y lo mejor de ser madre: María Cleofe Villanueva Elguera, quien me enseño a sembrar, cultivar y cosechar no solo la tierra si no también éxitos, amor y mucho coraje para salir adelante, gracias a ti y a mi papa Altuve Rojas Romo, sacaste adelante a mis hermanos y a mi ahora como siempre me dijiste “Seguiremos Adelante” con más locuras de la vida.

Marcos.

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AGRADECIMIENTO

En primer lugar agradecer a Dios a la virgen María y a su hijo Jesús por iluminarnos día a día para cumplir con nuestros objetivos de cada locura que nos nace y nacerán. A nuestros padres por ser el apoyo moral y fuerza que necesitábamos en el camino.

Nos gustaría expresar nuestra gratitud a la Directora Hellen Judith Rojas Villanueva por ser participe en la concepción de la idea de esta investigación con el sacha inchi y confiar de principio a fin en nosotros.

Queremos expresar nuestro agradecimiento a la empresa Agroindustrias Amazónicas especialmente al Gerente Comercial Patricia Aguilar y al Gerente de investigaciones José Anaya por haber depositado su confianza en este proyecto de investigación.

Al Mg. Salvador Teódulo Ore Vidalon por su asesoría de la presente Tesis, asimismo al Mg. Olga Angulo Gutiérrez por el apoyo incondicional mostrado de igual manera al Ing. Jaime Claros Castellares por brindarnos su amistad y a la Mg. Yessica Bendezu Roca por ser nuestra consejera en nuestra etapa universitaria.

A la Srta. Karina Ccapa Ramírez encargada del laboratorio de Tesis del departamento de Química de la facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Agraria La Molina por su amistad y recomendaciones en el desarrollo de la presente tesis. A la Dra. Ana Kittazono docente del área de Biotecnología de la Universidad Nacional Agraria La Molina por su orientación para el desarrollo de la tesis. Al Ing. Luis Miguel Pérez Solís por su indudable aportación a esta tesis y su apoyo personal. Al Sr. José Alejandro Vilcamiche Llactahuaman por sus comentarios, sugerencias que nos brindó para mejorar el proyecto.

Y a nuestros catedráticos de nuestra querida y muy apreciada UNCP por impartirnos sus conocimientos y experiencias durante nuestra formación profesional.

Para todos ustedes nuestra gratitud será eterna.

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RESUMEN

La materia prima para este trabajo de investigación es la torta desengrasada de sacha inchi, subproducto que se obtiene como residuo del prensado en la obtención del aceite de la semilla del sacha inchi, razón por la cual es necesario aplicar un proceso alternativo para encontrar las condiciones adecuadas de operación para el proceso de hidrolisis enzimática, así también darle un valor agregado a este subproducto para lo cual nuestro trabajo consistió en dos etapas, en la primera etapa la torta desengrasada fue sometida a dos procesos de extracción obteniéndose el concentrado y aislado de proteína de sacha inchi para esto contrastamos en base al porcentaje de proteínas teniendo así los resultados, para el concentrado proteico: 65,00 %; y en el aislado proteico: 76,90 %, siendo nuestro punto de interés el contenido en proteínas, entonces se eligió como sustrato el aislado proteico.

En la segunda etapa se realizó la hidrolisis enzimática para obtener el hidrolizado proteico de sacha inchi, se procedió a calcular la concentración optima del sustrato por medio del método de solubilidad fijándose este valor de concentración en 0,08 g de sustrato/mL de solución, así también se determinó los niveles de tiempo, concentración de enzima y pH, para el tiempo de reacción se utilizó una solución patrón de concentración de enzima igual a 0,0625 g de enzima/mL de solución, siendo necesario construir la curva de calibración del BSA con la cual se determinó la concentración de proteínas con respecto al tiempo y se eligió los puntos con mayor pendiente siendo estos 5 y 12 minutos, para determinar las dosis adecuadas de enzima, se tomó en cuenta la concentración inicial del sustrato ya que este valor seria limite en las diferentes variaciones de concentración de enzima, se determinó el Grado de Hidrolisis (%) para cada una de las variaciones , determinando así los niveles de dosis de enzima (E/S) de 0,50 y 0,63; para el pH se tomó en cuenta la ficha técnica de la enzima Neutrasa 1.5 MG en la cual indica los niveles de 6,0 y 7,0.

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En el diseño experimental propuesto se evaluó el efecto de las variables independientes en el grado de hidrolisis, donde cada prueba experimental se llevó a cabo con una repetición obteniendo un diseño estadístico con arreglo factorial de 2³, del análisis de varianza y cálculo de F encontramos que las variables son significativas sobre el grado de hidrolisis, teniendo como mayor efecto la concentración de enzima y con menor efecto no significativo al pH, teniendo también un efecto significativo la interacción de tiempo – pH.

Realizadas las pruebas experimentales para cada condición se determinó el grado de hidrólisis obteniendo así las constantes cinéticas para cada caso donde se apreció que a una condición de razón enzima/sustrato (E/S) = 0,63;

tiempo de reacción de 12 minutos y a pH = 7,0 se obtuvo un Grado de Hidrólisis = 57,19 % y con esto se obtiene los parámetros de cinética enzimática de Vmax = - 0,1806 g/mL.h y Km = 0,1069 g/mL valores promedio de las ocho condiciones con las que se trabajó. Con dichas resultados se evaluó en la ecuación linearizada de Michaelis-Menten con el lenguaje de programación de Matlab, utilizando el método diferencial de Runge-Kutta de cuarto orden para la estimación de parámetros en cinética enzimática, observándose así la dispersión de los puntos experimentales de concentración de sustrato vs. tiempo, calculando un margen de error mínimo de 4,2 %, concluyendo así que los resultados del experimento realizado son confiables.

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INTRODUCCIÓN

A partir de la extracción de la semilla de sacha inchi, se obtiene la torta desengrasada que presenta alto contenido de proteínas, este subproducto es utilizado solo para la alimentación de animales, con esta investigación se desea realizar un proceso de hidrolisis enzimática, para así encontrar las condiciones de operación que nos permitan darle un valor agregado a la torta desengrasada y el producto obtenido pueda formar parte de un suplemento alimenticio. La modificación de la estructura de las proteínas alimentarias mediante hidrólisis enzimática permite mejorar las propiedades funcionales, nutricionales e inmunológicas de alimento original sin perder su valor nutritivo. La hidrólisis mejora la solubilidad, el poder espumante y la capacidad emulsificante de las proteínas. Aumenta su digestibilidad y reduce el carácter alergénico. Por ello en esta investigación que lleva por título “Hidrolisis enzimática del sustrato obtenido la torta de sacha Inchi (Plukenetia Volubilis Linneo) para mejorar la calidad proteica”, se determinó el grado de hidrolisis de forma experimental a nivel de laboratorio.

Para poder determinar dicho grado de hidrolisis primero se caracterizo la torta desengrasada de sacha inchi, realizándose dos tipos de extracciones por 2 diferentes métodos (acida y alcalina), después se realizó la hidrólisis enzimática obteniendo así el hidrolizado proteico de sacha Inchi. Lo determinado se hizo posible gracias a una revisión bibliográfica detallada de los métodos para la extracción del concentrado y aislado, así como también los métodos utilizados en la hidrólisis, los cuales se presentan en el primer capítulo.

En el segundo capítulo se detalla el trabajo desarrollado en el laboratorio, así como los métodos utilizados. Para el trabajo de laboratorio fue muy importante el manejo del pH, tiempo y concentración de la enzima, monitoreadas a temperatura constante para la obtención del hidrolizado. En el tercer capítulo se detalla los resultados obtenidos y finalmente, presentamos un análisis de los datos obtenidos, así como la discusión de los mismos.

LOS AUTORES

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OBJETIVOS

OBJETIVOS GENERALES

 Evaluar la Hidrolisis Enzimática del sustrato obtenido de la Torta de Sacha Inchi utilizando la Enzima Neutrasa para mejorar la calidad proteica.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Seleccionar el método adecuado de extracción de la torta de sacha inchi para la obtención del sustrato.

 Determinar la concentración óptima del sustrato para el proceso de hidrólisis.

 Definir experimentalmente los valores adecuados de tiempo, pH y concentración de enzima para el proceso de hidrolisis.

 Establecer las constantes cinéticas, Km y Vmax por el modelo linearizado de Michaelis – Menten.

 Comparar el modelo de Michaelis – Menten con los datos experimentales utilizando el software Matlab.

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SIMBOLOGÍA UTILIZADA

SIMBOLO DETALLE UNIDAD

cS Concentración del sustrato. g/mL cSo Concentración inicial del sustrato. g/mL

2 /

S1

c Concentración de sustrato a la

mitad de la velocidad máxima. g/mL cE Concentración de la enzima.

cET Concentración para una cantidad total de enzima. g/mL cEo Concentración inicial de la enzima.

dt Diferencial del tiempo. Adimensional k1 Constante de velocidad para la

formación del complejo. Adimensional k2 Constante de velocidad para la

reacción inversa. Adimensional k3 Constante de velocidad para la

disociación del complejo. Adimensional Km Constante de Michaelis – Menten . g/mL p.I. Punto isoeléctrico. Adimensional

rP Velocidad de formación del producto. g/mL.h rS

 Velocidad de desaparición del reactante g/mL.h rSo

 Velocidad inicial de desaparición del

reactante. g/mL.h rPo Velocidad inicial de formación del

producto. g/mL.h

max ,

rPo Velocidad máxima de formación del producto.

v Velocidad de reacción. g/mL.h Vmax Velocidad máxima . g/mL.h

ABREVIATURAS ABS : Absorbancia

ABSPROM : bsorbancia promedio

AOAC : Association of Official Analytical Chemist

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b.s. : Base seca

BSA : Albumina de suero bovino E : Enzima

ES* : Complejo Enzima – Sustrato E/S : Relación enzima sustrato

FAO : Organización de la Naciones unidas para la agricultura Fcalc. : Valores de F calculados

Ftab : Valores de F de tablas a un nivel de significancia del 5%

Hi : Hipótesis de investigación Ho : Hipótesis nula

INIA : Instituto Nacional de Investigación Agraria kg : Kilogramo

KDa : Kilo Dalton

cES* : Concentración del complejo enzima – sustrato ln : Logaritmo natural

L : Litros S : Sustrato

SSH : Hipótesis de estado estacionario t : Tiempo de hidrólisis

T : Temperatura, ºC um : Micrómetro µL : micro Litros mL : Mililitros mg : Miligramo

N : Número de experimentos

OMS : Organización Mundial de la Salud [P] : Concentración del producto PSS : Estado pseudo – estacionario rpm : Revoluciones por minuto

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ÍNDICE DE CONTENIDOS

Pág.

ASESOR i

DEDICATORIA ii

AGRADECIMIENTO iii

RESUMEN iv

INTRODUCCIÓN vi

OBJETIVOS vii

SIMBOLOGÍA UTILIZADA viii

ÍNDICE DEL CONTENIDO x

CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1 ACTUALIDAD DEL SACHA INCHI 1

1.2 PERFIL DEL SACHA INCHI 1

1.2.1 Producción del sacha inchi 3

1.2.2 Composición química del sacha Inchi 3

1.2.3 Descripción de obtención de la torta de sacha inchi 4

1.2.4 Torta desengrasada de sacha inchi 5

1.2.4.1 Proteínas 7

1.2.4.2 Carbohidratos 8

1.2.4.3 Grasas 8

1.2.4.4 Vitaminas 9

1.2.5 Solubilidad 9

1.2.5.1 Punto isoeléctrico del sacha inchi 10

1.2.6 Composición de aminoácidos en la torta de sacha inchi 10

1.2.7 Digestibilidad de aminoácidos 12

1.2.8 Extracción y purificación de proteínas 12

1.2.8.1 Concentrado de proteínas 13

1.2.8.2 Aislado de proteínas 14

1.2.9 Albumina de suero bovino 15

1.3 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS 15 x

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1.3.1 Hidrólisis de proteínas 15

1.3.1.1 Hidrolisis acida 16

1.3.1.2 Hidrolisis alcalina 16

1.3.2 Hidrólisis 16

1.3.3 El grado de hidrolisis 18

1.3.4 Enzimas 19

1.3.4.1 Naturaleza química 20

1.3.4.2 Propiedades 21

1.3.4.3 Efecto del pH 22

1.3.4.4 Efecto de la temperatura 23

1.3.4.5 Efecto del tiempo 24

1.3.4.6 Enzimas proteolíticas 25

1.3.4.7 Proteasas comerciales 25

1.3.4.8 Enzima neutrasa 27

1.3.5 Mecanismo de acción y cinética 27

1.3.5.1 Determinación del orden de reacción 29

1.3.6 Modelos de cinética enzimática 32

1.3.6.1 Modelos de Michaelis - Menten 32

1.3.6.2 Modelo de Briggs – Haldane 38

1.3.6.3 Estimación de K^my V^max de la ecuación linealizada de Michaelis - Menten 40

1.3.7 Liofilización 43

1.3.8 Programa Matlab para ingenieros 44

1.4 APLICACIONES DE LA PROTEÍNA HIDROLIZADA 45

CAPÍTULO II: PARTE EXPERIMENTAL 2.1 METODOLOGÍA EXPERIMENTAL 46

2.2 MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 47

2.2.1 Materia prima 47

2.2.1.1 Pruebas experimentales 47

2.2.1.2 Equipos 47

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2.2.1.3 Procedimiento Experimental 47

2.2.2 Métodos de Extracción para la obtención del sustrato 47

2.2.2.1 Método 1: Extracción acida para la obtención de concentrado de proteína de sacha inchi 47

2.2.2.1.1 Materiales de laboratorio 47

2.2.2.1.2 Equipos 48

2.2.2.1.3 Reactivos 48

2.2.2.1.4 Procedimiento Experimental 48

2.2.2.2 Método 2: Extracción alcalina para la obtención de aislado de proteína de sacha inchi 51

2.2.2.2.2 Equipos 51

2.2.3 Determinación de la concentración optima del sustrato 54

2.2.3.1 Materiales de laboratorio 54

2.2.3.2 Equipos 54

2.2.3.3 Reactivos 54

2.2.3.4.1 Método de solubilidad 54

2.2.4 Determinación de los Niveles de las Variables Independientes 55

2.2.4.1 Niveles de pH para la Hidrolisis Enzimática 55

2.2.4.2 Niveles de tiempo 55

2.2.4.2.2 Equipos 55

2.2.4.3 Niveles de concentración de enzima 56

2.2.4.3.1 Materiales de laboratorio 56 xii

(14)

2.2.4.3.2 Equipos 56

2.2.5 Hidrolisis Enzimática para la obtención del Hidrolizado proteico 58

2.2.5.2 Equipos 58

2.2.6 Determinación del Grado de Hidrolisis 61

2.2.6.2 Equipos 61

2.3 DISEÑO DEL EXPERIMENTO 62

2.3.1 Variable Dependiente 62

2.3.2 Variable Independiente 62

2.3.3 Niveles de las Variables 69

CAPÍTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1 MATERIA PRIMA 63

3.1.1 Determinación del tamaño de muestra 63

3.1.2 Composición química 63

3.2 OBTENCIÓN DEL SUSTRATO PARA EL PROCESO DE HIDROLISIS ENZIMATICA 64

3.2.1 Concentrado de proteína de sacha inchi 64

3.2.1.1 Rendimiento del proceso 64

3.2.1.2 Composición química 64

3.2.2 Aislado de proteína de sacha inchi 65

3.2.2.1 Rendimiento del proceso 65

3.2.3 Concentración optima del sustrato 66

xiii

(15)

3.2.4 Resultados para los niveles de tiempo; pH y concentración

de enzima 67

3.2.4.1 Niveles de tiempo 67

3.2.4.2 Niveles de Concentración de enzima 68

3.3 HIDROLISIS ENZIMATICA PARA LA OBTENCION DEL HIDROLIZADO PROTEICO 70

3.4 VALIDACION EXPERIMENTAL 72

3.4.1 Prueba de Hipótesis 72

3.4.1.1Matriz de diseño 72

3.4.2 Análisis de Varianza 72

3.5 EVALUACIÓN DEL PH, TIEMPO Y CONCENTRACION DE ENZIMA 73 3.5.1 Evaluación de la concentración de enzima 73

3.5.2 Evaluación del pH 79

3.6 EVALUACIÓN DEL GRADO DE HIDROLISIS 83

3.7 DETERMINACION DE LA CONSTANTE CINETICA Km y Vmax DEL PROCESO DE HIDROLISIS ENZIMATICO 86

3.7.1 Determinación de la concentración del sustrato final (Cs) 86

3.7.1.1 Para la concentración del sustrato: 8 % a las condiciones: E/S = 0,50; pH = 6,0; T = 50 °C; t = 5 minutos 86

3.7.1.2 Para la concentración del sustrato: 8 % a las condiciones: E/S = 0,63; pH = 6,0; T = 50 °C; t = 5 minutos y t = 12 minutos 88

xiv

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CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA

ANEXOS

Descripción

Anexo A:

A.1 Preparación del reactivo de Biuret.

A.2 Determinación de la curva estándar de Albumina de Suero Bovino (BSA).

A.3 Reporte de absorbancias para determinar la concentración óptima del sustrato

A.4 Determinación de la solución patrón de la enzima

A.5 Reporte de absorbancias para la determinación de los niveles de las variables independientes

A.5.1 Reporte de absorbancias promedio en los tiempos propuestos

A.5.2 Reporte de absorbancias para la determinación de la proteína soluble en TCA al 10 %, pH = 6,0 y 7,0

A.5.3 Reporte de absorbancias para la determinación de la proteína total Anexo B:

B.1 Prueba de Hipótesis

B.2 Cuadro ANOVA para la evaluación de la influencia del tiempo de reacción.

B.3 Cuadro ANOVA para la evaluación de la influencia de la concentración de enzima.

B.4 Cuadro ANOVA para la evaluación de la influencia del pH

B.5 Cuadro ANOVA para la evaluación de la influencia del tiempo y concentración de enzima.

B.6 Cuadro ANOVA para la evaluación de la influencia del tiempo de reacción y el pH

B.7 Cuadro ANOVA para la evaluación de la influencia de la concentración de enzima y el pH

B.8 Cuadro ANOVA para la evaluación de la influencia de la concentración de enzima, tempo de reacción y el pH

xv

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Anexo C:

C.1 Resultado de los análisis de Grado de Hidrolisis (%)

C.2 Porcentaje de recuperación de proteína y rendimiento en peso de los productos proteicos de la torta desengrasada de sacha Inchi.

C.3 Resultados del análisis fisicoquímico a la torta de sacha Inchi

C.4 Resultados del análisis fisicoquímico a la torta de sacha inchi solicitado por la empresa AGROINDUSTRIAS AMAZONIAS S.A.

C.5 Resultados del análisis fisicoquímico al concentrado de sacha Inchi C.6 Resultados del análisis fisicoquímico al aislado de sacha Inchi

C.7 Resultados del análisis fisicoquímico realizado al hidrolizado proteico de sacha Inchi

Anexo D:

D.1 Evaluación de los puntos experimentales con el modelo de Michaelis- Menten en el lenguaje de programación de Matlab.

D.2 Representación de datos experimentales en el modelamiento de Michaelis- Menten, para la concentración del sustrato al 8% a las condiciones de E/S = 0,50; T = 50°C; pH = 6,0 ; t = 5 minutos y t = 12 minutos.

D.3 Representación de datos experimentales en el modelamiento de Michaelis- Menten, para la concentración del sustrato al 8% a las condiciones de E/S = 0,63; T = 50 °C; pH = 6,0 ; t = 5 minutos y t = 12 minutos

D.4 Representación de datos experimentales en el modelamiento de Michaelis- Menten, para la concentración del sustrato al 8 % a las condiciones de E/S = 0,50; T = 50°C; pH = 7,0; t=5 minutos y t = 12 minutos

D.5 Representación de datos experimentales en el modelamiento de Michaelis- Menten, para la concentración del sustrato al 8 % a las condiciones de E/S = 0,63; T = 50 °C; pH = 7,0 ; t = 5 minutos y t = 12 minutos

Anexo E:

E.1 Fotos de los diferentes procesos (metodología experimental)

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(18)

ÍNDICE DE TABLAS

Descripción Página

TABLA Nº 1.1 Contenido de proteínas ácidos grasos en

sacha inchi y otras oleaginosas. 3

TABLA Nº 1.2 Composición Química del Sacha Inchi. 4 TABLA Nº 1.3 Análisis Fisicoquímico de la torta de Sacha Inchi. 7 TABLA Nº 1.4 Contenido de Aminoácidos en proteína de principales

Semillas oleaginosas. 11 TABLA Nº 1.5 Algunas de las proteasas disponibles comercialmente

en grado alimenticio. 26 TABLA Nº 3.1 Composición proximal de la harina desengrasada

molida de Sacha Inchi (%). 63 TABLA Nº 3.2Composicion proximal del concentrado de Sacha

Inchi (%). 65 TABLA Nº 3.3Composicion proximal del aislado de Sacha Inchi (%). 66 TABLA Nº 3.4 Reporte de Grado de Hidrólisis (%) de los productos

para distintos valores de concentración de enzima a pH = 6,0. 69 TABLA Nº 3.5 Reporte de Grado de Hidrólisis (%) de los productos

para distintos valores de concentración de enzima a pH = 7,0. 69 TABLA Nº 3.4 Grado de Hidrólisis (%) de los productos a distintas

condiciones de operación. 71 TABLA Nº 3.5 Matriz de Diseño. 72 TABLA Nº 3.6 Resultados obtenidos de Fcalculado y FTablas. 73 TABLA Nº 3.7 Influencia de la Concentración de Enzima en el Grado

de Hidrólisis (%). 74 TABLA Nº 3.8 Influencia de la Concentración de Enzima en el Grado

de Hidrólisis (%). 74 TABLA Nº 3.9 Influencia de la Concentración de Enzima sobre el

Grado de Hidrólisis(%) . 76 TABLA Nº 3.10 Influencia de la Concentración de Enzima sobre el

Grado de Hidrólisis (%). 76 xvii

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TABLA Nº 3.11 Influencia del pH en el Grado de Hidrólisis a las siguientes condiciones: Concentración de Sustrato: 8 %; Dosis de

Enzima: (E/S) 0,63; Temperatura: 50 ºC y Tiempo: 5 minutos. 79 TABLA Nº 3.12 Influencia del pH en el Grado de Hidrólisis a las

siguientes condiciones: Concentración de Sustrato: 8 %; Dosis de

Enzima: (E/S) 0,63; Temperatura: 50 ºC y Tiempo: 12 minutos. 79 TABLA Nº 3.13 Influencia del pH sobre el Grado de Hidrólisis

a distintas condiciones de operación en función de la temperatura

a pH = 6,0. 81 TABLA Nº 3.14 Influencia del pH sobre el Grado de Hidrólisis a

distintas condiciones de operación en función de la temperatura a

pH = 7,0. 81 TABLA Nº 3.21 Constantes Cinéticas determinadas para los niveles

de trabajo establecido. 91

ÍNDICE DE FIGURAS

Descripción Página

FIGURA Nº 1.1 Hojas, flores, semillas verdes y maduras de sacha

inchi. 2

FIGURA Nº 1.2 Proceso de obtención de torta de sacha inchi. 6 FIGURA Nº 1.3 Efecto del pH en la solubilidad de las proteínas

Berk, 1992. 10 FIGURA Nº 1.4 Estructura secundaria albumina de suero bovino

(BSA). 15

FIGURA Nº 1.5 Estructura de la enzima. 20 FIGURA Nº 1.6 Efecto del pH sobre la actividad enzimática. 23 FIGURA Nº 1.7 Efecto de la temperatura en la actividad enzimática. 24 FIGURA Nº 1.8 Representación gráfica del curso grafico de una

reacción. 24 FIGURA Nº 1.9 Hidrólisis de proteínas con endo y exoproteasas. 25 FIGURA Nº 1.10 Cinética enzimática. 28

xviii

(20)

FIGURA Nº 1.11 Actividad enzimática. 29

FIGURA Nº 1.12 Gráfico característico para una reacción de orden _{. 31}

FIGURA Nº 1.13 Gráfico característico para una reacción de orden 0. 31

FIGURA Nº 1.14 Gráfico característico para una reacción de orden 1. 32

FIGURA Nº 1.15 Cinética clásica de Michaelis – Menten. 35

FIGURA Nº 1.16 Inhibición por el sustrato. 37

FIGURA Nº 1.18 Gráfica de Lineweaver – Burk. 41

FIGURA Nº 1.19 Gráfica de Eadie – Hofstee. 42

FIGURA Nº 1.20 Evaluación de Km y Vmax para la ecuación integrada de MM. 43

FIGURA Nº 1.19 En el diagrama de fases la frontera entre gas y líquido va desde el punto triple hasta el punto crítico. 44

FIGURA N° 2.1 Diagrama de bloques para la obtención de concentrado de proteína de sacha inchi (Método 1). 50

FIGURA N° 2.2 Diagrama de bloques para la obtención de aislado de proteína de sacha inchi (Método 2). 53

FIGURA N° 2.3 Diagrama de bloques para la obtención del Hidrolizado proteico de Sacha Inchi. 60

FIGURA Nº 3.1 Solubilidad de aislado de proteína de Sacha Inchi a pH 7,0. 67

FIGURA Nº 3.2 Representación de Concentración de proteínas vs. Tiempo. 68

FIGURA Nº 3.3 Influencia de la Concentración de Enzima en el Grado de Hidrólisis. 75

FIGURA Nº 3.4 Influencia de la Concentración de Enzima sobre el Grado de Hidrólisis a distintas condiciones de operación en función del Tiempo. 77

FIGURA Nº 3.5 Influencia de la Concentración de Enzima sobre el Grado de Hidrólisis a distintas condiciones de operación en función del Tiempo. 78

xix

(21)

FIGURA Nº 3.9 Influencia del pH sobre el Grado de Hidrólisis. 80 FIGURA Nº 3.10 Influencia del pH sobre el Grado de Hidrólisis

a temperatura constante 82 FIGURA Nº 3.11 Grado de Hidrólisis para diferentes condiciones en

función del tiempo. 84 FIGURA Nº 3.12 Comportamiento del grado de hidrolisis para

diferentes condiciones de operación. 85

FIGURA Nº 3.13 Representación de los datos experimentales en el

modelo de Michaelis – Menten. 92

xx

(22)

CONCLUSIONES

1. El método seleccionado para la obtención del sustrato fue la extracción alcalina, el cual reporto un rendimiento del 50,00 % de un total de 769 gramos de proteína.

2. Se determinó la concentración óptima del sustrato (Aislado de sacha inchi) igual a 80 mg/mL por el método de solubilidad.

3. Se determinó experimentalmente los valores adecuados para el proceso de hidrolisis que corresponden a un tiempo de reacción de 12 minutos, pH de 7,0 y razón enzima/sustrato (E/S) igual a 0,63, ya que a estas condiciones adecuadas se reportó mayor Grado de Hidrolisis igual a 57,192 %.

4. Se determinó las constantes de la velocidad de reacción enzimática a las condiciones adecuadas ya mencionadas anteriormente, siendo

Vmax = - 0,1806 g/mL.h y K_m = 0,1069 g/mL (Constante de Michaelis – Menten).

5. Al realizar la comparación de nuestros puntos experimentales con el modelo de Michaelis-Menten, por el método diferencial de Runge - Kutta de cuarto orden, se obtiene un porcentaje de error del 4,2 % lo cual indica que a las condiciones óptimas ya mencionadas nuestros puntos

experimentales se ajustan al modelo.

(23)

RECOMENDACIONES

 Se recomienda utilizar la investigación desarrollada en el presente trabajo como parte de la industrialización de suplementos alimenticios desarrollados en el Perú.

 Se recomienda que cuando se realice la extracción del aislado, de inmediato se realice la hidrolisis, ya que al pasar más tiempo el pH del mismo varia, lo cual no es conveniente.

 En los dos tipos de extracción agregar el HCl y NaOH. gota a gota ya que al incrementarlos en gran cantidad podrían variar el pH siendo perjudicial para el proceso.

 Se recomienda utilizar conjuntamente neutrasa y alcalasa para minimizar el tiempo de hidrólisis y obtener hidrolizados con mayor grado de hidrolisis.

 Se recomienda trabajar con sumo cuidado en todo el procedimiento de obtención del hidrolizado proteico, controlando minuciosamente las variables de trabajo.

 Efectuar una evaluación económica financiera con la finalidad de mostrar la factibilidad de producción comercial del producto obtenido.

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BIBLIOGRAFIA

 Aguirre Vargas Elsa, 2006. Obtención de jarabe de Glucosa por vía Enzimática del almidón de Umari. Tesis para optar el grado de Magíster Scientiae. Universidad Nacional Agraria La Molina.

 Andrea Pardo, 2011 “Proteínas Vegetales, Alimentación Sana”

[Articulo en línea] Disponible en:

http://www.alimentacionsana.com.ar/portal%20nuevo/actualizaciones/pro teinas%20vegetales.htm (Consultado 26 de Setiembre 2012).

 Arce Guadalupe, Flor Paucar Huarcaya, Betania Tueros Gonzales, Miriam

“Restricciones para la exportación del producto peruano novel food sacha inchi con destino Francia - apisi (asociación de productores industriales de sacha inchi)”, año 2011 Editora: Dra. Sabina Mlodzianowska.

 Arévalo, Gloria. (1990-1995). Colección, caracterización y mantenimiento de germoplasma de oleaginosas nativas en Tarapoto, Perú. Informe Anual 1990-1995. Tarapoto: INIA, Pronargeb, E. E. A. El Porvenir.

 Arévalo, Gloria. (2000). El cultivo de sacha inchi (Plukenetia volubilis L.) en la Amazonía. Tarapoto: INIA, Pronargeb, E. E. A. El Porvenir.

 Arévalo, Gloria. (1989-1995). Informes de resultados de investigación.

Tarapoto: Instituto Nacional de Investigación Agraria (INIA), Programa Nacional de Investigación en Recursos Genéticos y Biotecnología (Pronargeb), Estación Experimental Agraria (E. E. A.) El Porvenir.

 BADUI, 1985. Química de alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza España.

(25)

 Belitz, H. y Grosch, W., 1992, “Química de los Alimentos”, 2da.

edición,Editorial Acribia, S.A., Zaragoza, España, Pag. 68.

 Braverman, J.B.S. 1967. Introducción a la Bioquímica de los alimentos.

Ediciones omega, S: A. Barcelona – España.

 Bruce E. Rittmann, 2001. Biotecnología del Medio Ambiente Principios y Aplicaciones. Perry L. McCarty – McGraw Hill/Interamericana de España, S.A.U. Pag. 40 – 47.

 Bruchman, E.1980. bioquímica técnica. Ed. Acribia, Zaragoza-España.

 Campano, S., 2002, “Productos de proteína de soya en carnes procesadas”, Central Soya Company, Inc., Oficina Regional para México, Centro América y el Caribe, [Articulo en línea] Disponible en:

http://asamex.nsrl.uiuc.edu/carnico4.html, (Consultado 14 Octubre 2012).

 Centro de Investigación, Educación y Desarrollo CIED Selva Central.

PROTOCOLO DEL CULTIVO DE SACHA INCHI [Articulo en línea]

Disponible en: http://www.ciedperu.org/descarga/protocolosacha.pdf.

(Consultado 30 de diciembre 2012) .

 Chávez, M., 1990, “Temas de Enzimología”, Universidad de La Habana, Facultad de Biología, Cuba, 7, Pag. 7-67.

 Cheftel, J., Cuq, J. y Lorient, D., 1989, “Proteínas alimentarias”, Editorial Acribia S.A., Zaragoza, España, Pag. 40-56, 258-259, 280.

 Childs, E.A. 1975. An enzymatic chemical method for extraction of cottonseed protein. J.Food Science 40: Pag. 78-80.

(26)

 Clemente, A., 1997, “Hidrolizados de proteína de Garbanzo”, Instituto de la Grasa, Sevilla, España, Pag.155, 159.

 D.C.Hanselman and B. Littlefield, Mastering MATLAB 6. A comprehensive Tutorial and reference. Englewood Cliffs, NJ: Prentice Hall 2001.

 Fennema, D.R. 1982. Introducción a la cinética de los alimentos. Tomo I.

Ed. Reverte S.A. España.

 Fisher, A. y Bender, P. 1988. Valor nutritivo de los alimentos. Ed. Acribia – Zaragoza – España.

 Fleming, M., 1989, “Enzyme technology versus engineering technology in the food industry”, Biotechnology and Applied Biochemistry, 11, Pag.

249-265.

 Flores, Ada M. (2009). Ficha Técnica de Sacha Inchi-Publicación Virtual Red Peruana De Alimentación Y Nutrición Pag. 2.

 Fox, P., Morrissey, P. y Mulvihill, D., 1982, “Chemical and enzymatic modification of food proteins”, Developments in Food Proteins, Editors Hudson, B.J.F., Applied Science Publishers, London, Pag. 150-164.

 Garcia H. Sacha inchi (Plukenetia volubilis): una alternativa para mejorar la nutrición animal y humana. Investigaciones apoyadas por Fundeagro.

1ra parte. Perú; 1993.

 Gregorini, J., 2003, “Comentarios sobre el grano de soja y sus derivados”,

[Articulo en línea] Disponible en: http:

//www.galeon.com/mundosoja/gregorini.htm, (consultado 2 de Enero 2013).

(27)

 Haiyan W., Mouming Z., and Xiao H., 2010, “Enzymatic hidrolysis of Grass carp Myofibrillar protein and antioxidant of Hidrolysates”, [Articulo en

línea] Disponible en:

http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/31769.pdf (Consultado en 22 Octubre 2012).

 Hameker, B.R. et.al. Amino acid a fatty an profiles of the inca peanut (Plukenetia volubilis L.). Cereal chemical 1992, 69 (4), Pag. 461-463.

 Hart, L. y Fisher, H., 1971. “Introducción a los métodos generales para el análisis básico y mineral”, Análisis Moderno de los alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza, España, Pag. 21 – 22.

 Hazen y Stoewesand. 1980. Resultados de análisis del aceite del cultivo de sacha inchi. Universidad de cornell USA.

 Hicks, J., 2001, “Bioquímica”, McGraw Hill Interamericana Editores, México, D. F., Pag. 107, 109, 117.

 Industria Alimentaria, 2002 “Extracción y purificación de proteínas.”

[Artículo en línea] Disponible en: http://www.industriaalimenticia.com (Consultado 23 de Agosto 2012).

 Jim Dickerson Vásquez Pinedo, funcionario del Instituto Nacional de Investigación y Extensión Agraria (INIA) de la Estación Experimental Agraria El Porvenir de Tarapoto.

 J. M. Smith 1991. Ingeniería de las Reacciones Químicas; sexta edición.

McGraw – Hill, USA.

 Jorge Ayala Mina, 1995. Optimización por Diseños Experimentales con Aplicaciones en Ingeniería, Perú.

(28)

 Kayode Taiwo, “Cinética Química Aplicada. Problemas Resueltos”, Universidad Politécnica de Valencia, Valencia, 1998.

 Kerry Hughes, 2011 “Potencial del Camu Camu y Sacha inchi en el mundo estadunidense.” [Articulo en línea] Disponible en:

http://es.scribd.com/doc/54145727/37105109-Camu-Camu-y-Sacha- Inchi-USA. (Consultado 16 de Noviembre 2012).

 Kim, S., Peter, S. y Rhee, K., 1990, “Functional properties of proteolytic enzyme modified soy protein isolate”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 38, 651-656.

 Kinsella, J., 1976, “Functional properties of proteins in foods: a survey”, CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 7, Pag. 219-244.

 Kojio K, Takahara A, Kajiyama T (1998). "Bovine serum albumin adsorption onto immobilized organotrichlorosilane surface: influence of the phase separation on protein adsorption patterns". J Biomater Sci Polym Edition. 9 (2): Pag. 131–50.

 Kongpob R. and Kittnan K., 2007, “Enzymatic hidrolysis of rawhide using papain and neutrase”, [Articulo en línea] Disponible en:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1226086X07000299, (Consultado en 15 Octubre 2012).

 Kosmulski M and Saneluta C (2004). 'Point of zero charge/isoelectric point of exotic oxides: Tl2O3', Journal of Colloid and Interface Science vol.

280, no. 2, Pag. 544–545.

 Lahl, W. y Braun, S., 1994, “Enzymatic production of protein hydrolysates for food use”, Journal of Food Technology, Pag. 48, 68-71.

 Lamy D. Schmidt, 1998. The Engineering of Chemical Reactions. Oxford University Press. 269.

(29)

 Lehninger, A., 1970, “Biochemistry”, Worth Oublishers, Inc., New York, United States of America, Pag. 60, 153, 158, 159, 169, 170.

 Litwack C. 1969. "Bioquímica Experimental. Un Manual de Laboratorio".

Omega, Barcelona.

 Liu, K., 1999, “Soybeans: Chemistry, Technology and Utilization”, A Chapman & Hall Food Science Book, Maryland, Pag. 37-41, 47, 385, 389, 391.

 López F. Diagnostico del cultivo de sacha inchi en la provincia de Satipo.

Satipo 2011.

 Mahmoud, M., 1994, “Physicochemical and functional properties of protein hydrolysates in nutritional products” Journal of Food Technology, Pag.

48, 89-95.

 Mancebo, María Fernanda (1994). La Universidad de Valencia: de la monarquía a la república, 1919-1939. Valencia: Universitat de València.

p. 394. ISBN 84-370-1603-7. (Consultado el 23 de diciembre 2012).

 Mejía M. Extracción y refinación de aceite de sacha inchi (Plukenetia volubilis). [Tesis para optar el título de ingeniero en industrias alimentarias]. Lima: Universidad Nacional Agraria La Molina; 1997.

 Missen, R.W., Mims, C.A., Saville, B.A., “Chemical Reaction Engineering and Kinetics”, Editorial de Nueva York, 1999.

 Miller, D., Sangines, M. y Torre, M., 2001, “Química de alimentos: manual de laboratorio”, Editorial Universidad de Costa Rica, Costa Rica, Pag.

111-118.

 Murray R. Spiegel; 1991. Estadística, Segunda Edición. McGraw Hill/Interamericana de Mexico, S.A. 223 – 224.

(30)

 Novozymes, Information Sheet, Special Food, 1999, “Introduction to proteins and protein hydrolysis”.

 Novo Nordisk A/S, 2012 “Empresa Farmacéutica Danesa ” [Articulo en

línea] Disponible en: http:

//www.pers.katedral.se/~perssz/kemihemsida/privat/nuetrase.pdf, (Consultado 2 de Enero 2013).

 Octave Levenspiel, 1987. Ingeniería de las Recciones Químicas, Segunda Edicion. Ediciones Repla, s.a. 216 – 219.

 Octavio Chirinos, Leonardo Adachi, Fernando Calderón, Raúl Díaz, Luis Larrea, Gustavo Mucha, Liliana Roque, 2009. Exportación de Sacha Inchi a los Estados Unidos, primera edición, ESAN ediciones-Perú.

 Pelczar, et. al. 1981. microbiología 4º edición. Libros Mc. Graw Hill, Colombia.

 Perez Romero, Leocadia, 2008 “Evaluación de cuatro temperaturas de prensado en la calidad del aceite virgen de sacha inchi (Plukenetia volubilis L.)” Pag. 12, 13, 14, 15, 16,17.

 Primo Yufera, E.1979.Quimica agrícola III. Alimentos. Edit. Alhambra S.A., México.

 Rittmann, 2001, “The Biodesign Institute, Swette Center for Environmental Biotechnology”, [Articulo en línea] Disponible en:

http://www.biodesign.asu.edu/people/bruce-rittmann (Consultado en 16 Febrero 2013).

 Roberto Hernandez Sampieri, Carlos Fernandez Collado, Pilar Baptista, 2003. Metodología de la investigación, Tercera Edición. McGraw Hill.

523.

(31)

 Rodríguez, N., 1999, “Obtención de hidrolizado de chocho (lupinus mutabilis) por vías enzimáticas”, Proyecto de Titulación previo a la obtención del Título de Ingeniera Química, EPN, Quito, Ecuador, Pag.

40-42.

 Salas V., F. 1981. Obtención de bebida de soya en polvo a partir de soya integral. Tesis grado. UNA-La Molina.

 Schmidl, M., Taylor, S. y Nordlee, J., 1994, “Use of hydrolysates-based products in special medical diets” Journal of Food Technology, Pag. 48, 77-85.

 Schmidt – Hebbel, Pennacchiotti, I. 1982. Las enzimas en los alimentos.

Ed. Fundacion Chile – Santiago de Chile.

 Soottawat Benjakul and Michael T. Morrissey, 1997. “ Protein Hydrolysates from Pacific Whiting Solid Wastes”, Abstrac of Faculty of Agro-industry, Prince of Songkla University, Hat Yai, Songkla, Tailand.

 Stryer, L., 1985, “Bioquímica”, Introducción a la estructura y función de las proteínas, 2da edición, ed. J. Macarulla, Editorial Reverte, S.A., Madrid, España, Pag.11-35.

 The Solae Company, 2003, “Información Básica de la Soya – Proteína de

Soya”, [Articulo en línea] Disponible en:

http://www.solae.com/company/sp/soyessentials/yprotein.html,(Consulta do en 13 Diciembre 2012).

 Valles, C. R. (1990). El «sacha inchi», planta nativa de importancia proteica y aceitera promisoria para la selva alta. Lima (separata).

(32)

 Valles, C. R. (1992). Sacha inchi, importante oleaginosa selvática. Revista Pura Selva. (Tingo María): Pag. 40-41.

 Villacrés, E., 2001, “Obtención de un hidrolizado enzimático de alta funcionalidad a partir del chocho (lupinus mutabilis sweet)”, Tesis de Maestría, EPN, Quito, Ecuador, Pag. 19, 58, 62, 63, 64, 65.

 Wagner, J., 2008, “La utilización de soja en la alimentación humana”,

[Articulo en línea] Disponible en:

http://www.ms.gba.gov.ar/CalidadAlimentaria/Ciclo1/4conf.htm, (Consultado en Junio 2012).

 Wilchek, M. y Miron, T., 2003, “Oriented versus random protein immobilization”, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, Pag.

55, 67-70.

(33)

(34)

(35)

A.1 PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE BIURET

Uno de los métodos usados para la determinación de proteína total en suero, se basa en la reacción de Biuret .La reacción de Biuret es uno de los métodos químicos más antiguos para medir proteína, fue aplicado en suero en 1914 y sin embargo, sigue siendo uno de los más simples y precisos.

1. Preparación:

 Primero preparamos una solución NaOH 6,0 mol/L. Para esto se disolverá 240 g de NaOH en agua recién destilada (para minimizar CO), enfriar y diluir a 1L. Guardar en botella de polietileno muy cerrada a temperatura ambiente.

 En segundo lugar para la preparación del reactivo de Biuret se necesitara ( CuSO4, 12 mol/L; tartrato de sodio y potasio, 32 mmol /L ; KI 30 mmol /L; NaOH 0,60 mol/L), disolver 3 g de sulfato de cobre (CuSO4.H2O) en 500 mL de agua recién destilada después añadir 9 g de tartrato de sodio y potasio y 5 g de ioduro de potasio .Luego de que se hayan disuelto los sólidos, añadir 100 mL de 6,0 mol/L NaOH y aforarlo a 1 L con agua destilada para finalizar guardarlo en una botella de polietileno muy cerrada a temperatura de ambiente.

 Nota: Para la preparación de la solución NaOH 6,0 mol/L. disolver en una tina con agua potable para equilibrar el calor de la reacción ya que se produce una reacción exotérmica.

(36)

A.2 DETERMINACIÓN DE LA CURVA ESTÁNDAR DE ALBUMINA DE SUERO BOVINO (BSA)

 Solución madre: 2 g de BSA/Litro de agua: C₁2mg mL

 Solución de hidróxido de sodio al 6 %: 6 g de BSA/100 mL de agua

 Reactivo por Biuret (Especificado en el Anexo A)

 Longitud de onda (λ = 330 nm) según el manual de laboratorio para análisis de proteínas (Litwack C., 1969).

En la siguiente Tabla se muestran las 8 diferentes concentraciones a que fue preparada la curva.

TUBOS V(mL) BSA V(mL) Agua

destilada V(mL) NaOH V(mL) Biuret

1 0 2 1 0,2

2 0,1 1,9 1 0,2

3 0,2 1,8 1 0,2

4 0,4 1,6 1 0,2

5 0,6 1,4 1 0,2

6 1,0 1,0 1 0,2

7 1,5 0,5 1 0,2

8 2,0 0 1 0,2

En la siguiente Tabla se muestran los resultados para la obtención de la curva de calibración.

TUBOS Concentración

(ppm) BSA ABS (330nm) ABSPROM

(330nm)

1 Blanco 0 0 0

2 100 0,050 0,056 0,053

3 200 0,107 0,111 0,109

4 400 0,251 0,249 0,250

5 600 0,330 0,330 0,330

6 1000 0,570 0,574 0,572

7 1500 0,862 0,858 0,860

8 2000 1,210 1,190 1,200

(37)

Para facilitar los cálculos y obtener directamente los valores de concentración de proteína a partir de los datos de absorbancia, la ecuación de la recta se expreso como:

x1666,667y12,667 (42)

(38)

A.3 REPORTE DE ABSORBANCIAS PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN ÓPTIMA DEL SUSTRATO

En el siguiente cuadro se muestra la solubilidad del aislado de sacha inchi a pH igual a 7,0 (concentración óptima de sustrato), según la variación de la absorbancia (λ = 330 nm) según el manual de laboratorio para análisis de proteínas (Litwack C., 1969)

[ S ] (mg/mL) Absorbancia (330nm) ABSPROM

(330nm)

10 0,192 0,178 0,185

40 0,249 0,241 0,245

80 0,340 0,352 0,346

120 0,342 0,332 0,337

150 0,319 0,329 0,324

200 0,315 0,327 0,321

A.4 DETERMINACIÓN DE LA SOLUCIÓN PATRÓN DE LA ENZIMA

Para la preparación de esta solución patrón de la enzima neutrasa fue necesario de una ficha técnica de Novo Nordisk, del cual se tomó en cuenta la especificación recomendada para el grado de enzimas en alimentos considerándose como factor límite de 5g. de enzima en 100g de sustrato.

. 0625 , 0 patron muestra de

gramos  g

Obteniéndose así el valor de la muestra patrón de 0,0625 g de enzima Neutrasa 1.5 MG.

Sustrato de

100g

Enzima de

Sustrato 5g de

1,25g patron

muestra

de

cantidad  x

(39)

A.5 REPORTE DE ABSORBANCIAS PARA LA DETERMINACION DE LOS NIVELES DE LAS VARIABLES INDEPENDIENTES

A.5.1 REPORTE DE ABSORBANCIAS PROMEDIO EN LOS TIEMPOS PROPUESTOS

Tiempo

(min.) Absorbancia (330nm) ABSPROM.

(330nm)

Concentración (µg /mL)

0 0,000 0,000 0,000 12,667

3 0,010 0,006 0,008 26,000

5 0,019 0,015 0,017 41,000

8 0,024 0,026 0,025 54,334

12 0,041 0,038 0,040 78,500

16 0,046 0,039 0,043 83,500

20 0,047 0,042 0,045 86,834

25 0,041 0,044 0,043 83,500

A.5.2 REPORTE DE ABSORBANCIAS PARA LA DETERMINACION DE LA PROTEINA SOLUBLE EN TCA AL 10 %, pH = 6,0 y pH = 7,0

pH = 6,0 ABSORBANCIA A 330 nm

Tiempo 5 min

(E/S ) ABS1 ABS2 ABSPROM.

0,13 0,016 0,010 0,013

0,25 0,021 0,015 0,018

0,38 0,023 0,019 0,021

0,50 0,044 0,050 0,047

0,63 0,080 0,074 0,077

0,75 0,081 0,077 0,079

0,88 0,085 0,079 0,082

1,00 0,083 0,087 0,085

Tiempo 12 min

0,13 0,021 0,015 0,018

0,25 0,024 0,018 0,021

0,38 0,027 0,021 0,024

0,50 0,080 0,078 0,079

0,63 0,127 0,119 0,123

0,75 0,130 0,122 0,126

0,88 0,131 0,123 0,127

1,00 0,130 0,126 0,128

(40)

pH = 7,0 ABSORBANCIA A 330 nm

Tiempo 5 min

(E/S) ABS1 ABS2 ABSPROM.

0,13 0,016 0,012 0,014

0,25 0,021 0,016 0,019

0,38 0,025 0,019 0,022

0,50 0,051 0,059 0,055

0,63 0,095 0,087 0,091

0,75 0,097 0,091 0,094

0,88 0,098 0,092 0,095

1,00 0,091 0,099 0,095

Tiempo 12 min

0,13 0,022 0,016 0,019

0,25 0,025 0,019 0,022

0,38 0,030 0,024 0,027

0,50 0,098 0,090 0,094

0,63 0,159 0,151 0,155

0,75 0,162 0,154 0,158

0,88 0,165 0,153 0,159

1,00 0,166 0,154 0,160

A.5.3 REPORTE DE ABSORBANCIAS PARA LA DETERMINACION DE LA PROTEINA TOTAL

Tiempo (min) Absorbancia 330 nm ABSPROM.

1 0,278 0,263 0,271

(41)

(42)

B.1 PRUEBA DE HIPÓTESIS

Ho1.- El tiempo de reacción no afecta en el grado de hidrolisis para la obtención del hidrolizado proteico.

Ho2.- La concentración de enzima no afecta en el grado de hidrolisis para la obtención del hidrolizado proteico.

Ho3.- El pH no afecta en el grado de hidrolisis para la obtención del hidrolizado proteico.

Ho4.- El tiempo y la concentración de enzima no afectan en el grado de hidrolisis para la obtención del hidrolizado proteico.

Ho5.- El tiempo de reacción y el pH no afectan en el grado de hidrolisis para la obtención del hidrolizado proteico.

Ho6.- La concentración de enzima y el pH no afectan en el grado de hidrolisis para la obtención del hidrolizado proteico.

Ho7.- El tiempo de reacción, la concentración de enzima y el pH no afectan en el grado de hidrolisis para la obtención del hidrolizado proteico.

Hi.- El grado de hidrolisis es afectado por la concentración de enzima, el tiempo de reacción y pH del sistema.

(43)

B.2 Cuadro ANOVA para la evaluación de la influencia del tiempo de reacción

Estadísticas de la regresión Coeficiente de correlación

múltiple 0,99234348

Coeficiente de determinación

R^2 0,98474558

R^2 ajustado 0,97711837

Error típico 0,05501519

Observaciones 4

ANÁLISIS DE VARIANZA

Grados de libertad

Suma de cuadrados

Promedio de los

cuadrados F

Valor crítico de F

Regresión 1 0,39077216 0,39077216 129,109557 0,00765652

Residuos 2 0,00605334 0,00302667

Total 3 0,3968255

Coeficientes Error típico Estadístico t Probabilidad Inferior 95%

Superior 95%

Inferior 95.0%

Superior 95.0%

Intercepción -0,3212235 0,14830361 -2,16598564 0,16267505 -0,95932244 0,31687545 -0,9593224 0,31687545 Variable X1 11,844972 1,04244906 11,3626386 0,00765652 7,35967571 16,3302683 7,3596757 16,3302683

(44)

B.3 Cuadro ANOVA para la evaluación de la influencia de la concentración de enzima

R^2 0,97883269

R^2 ajustado 0,96824904

Observaciones 4

Promedio de los

cuadrados F

Regresión 1 1,10463123 1,10463123 92,4853299 0,01064026

Residuos 2 0,02388771 0,01194385

Total 3 1,12851894

Superior 95%

Inferior 95.0%

Superior 95.0%

(45)

B.4 Cuadro ANOVA para la evaluación de la influencia del pH

R^2 0,95557268

R^2 ajustado 0,93335901

Observaciones 4

Promedio de los

cuadrados F

Regresión 1 0,59741945 0,59741945 43,0173402 0,02246602

Residuos 2 0,02777575 0,01388788

Total 3 0,6251952

Superior 95%

Inferior 95.0%

Superior 95.0%

(46)

B.5 Cuadro ANOVApara la evaluación de la influencia del tiempo y concentración de enzima

R^2 0,85649864

R^2 ajustado 0,78474797

Observaciones 4

Promedio de los

cuadrados F

Regresión 1 0,55326551 0,55326551 11,9371506 0,07452788

Residuos 6 0,09269641 0,04634821

Total 7 0,64596192

Superior 95%

Inferior 95.0%

Superior 95.0%

Intercepción -2,42562712 0,62959728 -3,85266456 0,06124738 -5,13456556 0,28331133 -5,1345655 0,28331133 Variable X1X2 7,79315136 2,25560358 3,45501817 0,07452788 -1,91192755 17,4982303 -1,9119275 17,4982303

(47)

B.6 Cuadro ANOVA para la evaluación de la influencia del tiempo de reacción y el pH Estadísticas de la regresión

Coeficiente de correlación

múltiple 0,944055

R^2 0,891241

R^2 ajustado 0,873114

Observaciones 8

Promedio de los

cuadrados F

Regresión 1 9,27717178 9,27717178 49,1678489 0,00041957

Residuos 6 1,13210222 0,1886837

Total 7 10,409274

Superior 95%

Inferior 95.0%

Superior 95.0%

Intercepción 0,01434 0,52420622 0,02735564 0.97906325 -1,26834641 1,29702641 -1,2683464 1,29702641 Variable X1X3 15,9069233 2,26853551 7,01197896 0,00041957 10,3560168 21,4578297 10,356016 21,4578297