Efecto de la temperatura y pH en la producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM A15 en un biorreactor agitado

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. AC IÓ. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. N. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE. TESIS. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. Efecto de la temperatura y pH en la producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado. BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO. N. DE. PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL. CC. IO. Autor: Br. Carlos Jimmy Pérez Plasencia. DI. RE. Asesor: Dr. Luis Alberto Llenque Díaz TRUJILLO --PERU. 2015. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. UN IC. AC IÓ. N. TRUJILLO. M. Dr. Orlando Gonzáles Nieves. IC. A. Y. CO. RECTOR. RM. ÁT. Dr. Rubén Vera Véliz. EM. AS. DE. IN FO. VICERECTOR ACADÉMICO. SI ST. Dr.Weyder Portocarrero Cárdenas. Dr. Esteban Ilich Zerpa. DI. RE. CC. IO. N. DE. VICERECTOR DE INVESTIGACIÓN. SECRETARIO GENERAL. ii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS. UN IC. AC IÓ. N. BIOLÓGICAS. CO. M. Dr. José Mostacero León. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. DECANO. DE. Dr. William Zelada Estraver. Dra. Bertha Soriano Bernilla. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. SECRETARIO. DI. RE. DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.. iii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. AC IÓ. N. Señores Miembros del Jurado:. UN IC. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y Títulos de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología de la. CO. M. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración y criterio el presente trabajo de tesis titulado:. IC. A. Y. “Efecto de la temperatura y pH en la producción de amilasas por Bacillus. DE. RM. IN FO. Título Profesional de Biólogo Microbiólogo.. ÁT. licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado” con el cual pretendo obtener el. DE. SI ST. EM. AS. Trujillo, Octubre de 2015. DI. RE. CC. IO. N. Br. Carlos Jimmy Pérez Plasencia. iv. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MIEMBROS DEL JURADO. Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada en. AC IÓ. N. concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y. Y. CO. M. UN IC. Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.. IC. A. _________________________________. ÁT. Ms. C. Anibal Quintana Díaz. AS. DE. IN FO. RM. PRESIDENTE. EM. _________________________________. SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz. _________________________________ Ms. C. Jaime Agreda Gaitán VOCAL v. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran que el Tesis. titulado: “Efecto de la temperatura y pH en la. N. de. AC IÓ. presente Informe. UN IC. producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado”, ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo. IC. A. Y. CO. M. APROBADO por UNANIMIDAD.. ÁT. _________________________________. RM. Ms. C. Anibal Quintana Díaz. EM. AS. DE. IN FO. PRESIDENTE. SI ST. _________________________________. SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz. _________________________________ Ms. C. Jaime Agreda Gaitán VOCAL vi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CERTIFICACION DEL ASESOR. AC IÓ. N. El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada:. UN IC. “Efecto de la temperatura y pH en la producción de amilasas por Bacillus. Y. CO. M. licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado”. IC. A. Que ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de. ÁT. Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad con. RM. su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las. DE. IN FO. observaciones y sugerencias alcanzadas.. AS. Por lo tanto, autorizo a Carlos Jimmy Pérez Plasencia continuar con el trámite. SI ST. EM. del reglamento correspondiente.. CC. IO. N. DE. Trujillo, Octubre de 2015. RE. _________________________________. DI. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz ASESOR. vii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIAS. AC IÓ. N. A Dios Por estar conmigo en cada paso que doy, cuidándome y dándome fuerzas. UN IC. para seguir adelante y no desalentarme en el intento, por haberme dado salud para. M. lograr mis objetivos y permitido llegar a este momento tan importante de mi vida. RM. ÁT. A mi madre Nélida. IC. A. Y. CO. profesional.. IN FO. Por ser el pilar más fundamental en mi vida, por sus consejos, comprensión, amor, valores y apoyo incondicional en todo momento, por inculcar. DE. en mí el sabio don de la responsabilidad ¡Gracias por estar siempre conmigo. A mi padre Carlos. DE. SI ST. EM. AS. mamita!. IO. N. A quien admiro porque es un ejemplo de esfuerzo y sacrificio, a no darse por. CC. vencido ante cualquier dificultad, a pesar de la distancia siempre te tengo presente,. DI. RE. gracias por tus consejos y apoyo incondicional para ser un hombre de bien.. viii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. N. AGRADECIMIENTO. UN IC. A mi asesor, Dr. Luis Alberto Llenque Díaz, por brindarme su tiempo, apoyo y dedicación, así como las sugerencias constructivas durante el desarrollo de la presente. CO. M. investigación, además por brindarme su amistad y conocimientos académicos durante. IC. A. Y. mi formación profesional.. ÁT. A mis compañeros y amigos Arturo, Cristóbal, Héctor y Omar por brindarme su. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. apoyo en parte del desarrollo de mi tesis.. ix. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INDICE Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo………………………….……...….ii. AC IÓ. N. Autoridades de la Facultad de Ciencias Biológicas……………………….…………... iii. UN IC. Presentación…………………………………………………….………….…………....iv. M. Miembros del jurado………………………………………………………..…………...v. Y. CO. Aprobación………………………………………………...……………….…………...vi. IC. A. Certificación del Asesor…………………………………...…….………….………….vii. RM. ÁT. Dedicatoria………………………………………………………...……….………….viii. IN FO. Agradecimiento………………..………………………….….………………………....ix. DE. Indice…...…………………………………………………….………………………….x. EM. AS. Resumen…………………………………………………………………………......... xii. SI ST. INTRODUCCION…………………….………………………………………………....1. DE. Justificación…………………………………………………………………………….13. N. Objetivos…………………………………………………………………………..……14. IO. MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………………15. RE. CC. 1. Material biológico……………………………………………………..………..15. DI. 2. Metodología..……………………………………………….……….…….........15 2.1. Reactivación del cultivo………………………………………………………15 2.2. Construcción de biorreactores agitados……………………………………….16. x. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.3. Preparación del inóculo…….…………………..……..……...……………….16 2.4. Evaluación de la producción de amilasas……………………………………..17. N. 2.5. Determinación de la actividad catalítica……………………………………....17. AC IÓ. 2.6. Medición del almidón residual………………………………………………..18. UN IC. 2.7. Elaboración de la curva estándar de almidón………………………………....18 2.8. Determinación de la producción de amilasas ………………………………...19. CO. M. 2.9. Análisis de resultados………………………………………………………....19. Y. RESULTADOS…………………………………………………………………….......20. IC. A. DISCUSIÓN…………………………………………………………………..……..…29. RM. ÁT. CONCLUSIONES………….……………………………………………………...…...34. IN FO. RECOMENDACIONES……………………………………………………….…........35 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………….....……...36. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. ANEXOS………………………………………………………………………...……..40. xi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo determinar el. AC IÓ. N. efecto de la temperatura y pH en la producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado hasta las 72h de incubación.. UN IC. El cultivo bacteriano fue reactivado mediante siembra en placas conteniendo. M. agar almidón 0.1% e incubadas a 37°C por 24h, a partir del cultivo joven se. CO. preparó una suspensión con solución salina fisiológica estéril, equivalente al. A. Y. tubo N° 3 del nefelómetro de Mc Farland (9.0 x 108 UFC/mL). En cada. ÁT. IC. biorreactor se colocó 180mL de caldo almidón 0.6% - buffer fosfato al pH de. RM. ensayo (6.0, 7.0 y 8.0), suplementado con sales: (NH4)2SO4, CaCl2 y CuSO4,. IN FO. luego se agregó 20mL del inoculo estandarizado (9.0 x 108 UFC/mL), y se puso. DE. en funcionamiento e incubo a cada una de las temperaturas de ensayo (25, 40 y. AS. 55°C). Se determinó la producción de amilasas presentes a los tiempos 0, 12, 24,. EM. 36 y 72h extrayendo 10mL de muestra de cada biorreactor y se centrifugó. Al. SI ST. sobrenadante (extracto enzimático) separado se cuantificó la cantidad de amilasas producidas en relación al tiempo de incubación, midiendo el almidón. DE. residual en un espectrofotómetro y se determinó las unidades enzimáticas de. IO. N. amilasas (UA/mL) y fueron analizados mediante las Pruebas de Tukey y. CC. Duncan. Se determinó que hay diferencia significativa entre las 24 y 36h de. DI. RE. incubación y se encontró mayor producción de amilasas (UA/mL) a 55°C a pH neutro.. xii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCION. El almidón es un polímero de glucosa unido por enlaces glucósidos y que. AC IÓ. N. estructuralmente presenta un grupo aldehído en el extremo de la cadena polimérica. conocido como grupo reductor. Está constituido por dos tipos de polímeros: la. UN IC. amilosa y la amilopectina; la primera, es un polímero lineal de aproximadamente. M. 6000 unidades de glucosa con enlace α-1,4 glucósido; mientras que la amilopectina. CO. posee cadenas lineales cortas α-1,4 de 10 - 60 unidades de glucosa y de cadenas. A. Y. laterales α-1,6 con 15 - 45 unidades de glucosa. El número promedio de puntos de. ÁT. IC. ramificación es del 5%. La molécula completa de amilopectina contiene. RM. aproximadamente 2 000 000 unidades de glucosa, por lo que es considerada una de. IN FO. las moléculas más grandes de la naturaleza1. La hidrólisis ácida del almidón a. DE. glucosa es una técnica que tiene muchas desventajas; formación de productos no. AS. deseables y flexibilidad muy pobre (el producto final sólo se puede modificar. EM. cambiando el grado de hidrólisis), por último es necesaria que el equipo resista el. SI ST. ácido y las temperaturas requeridas durante este proceso. La hidrólisis enzimática en los últimos 30 años ha desplazado la hidrólisis ácida, debido a que se dispone de. DE. nuevas enzimas, por lo tanto, la hidrólisis de almidón se realiza usando enzimas, ya. IO. N. que esta técnica presenta ventajas como: control de la formación de productos no. CC. deseables y mayor flexibilidad del producto. La α-amilasa hidroliza los enlaces. RE. glucosídicos α-1,4 de los polisacáridos que poseen 3 o más unidades de D-glucosa en. DI. unión α-1,4. El ataque se hace en forma no selectiva (tipo endoenzima) sobre varios puntos de la cadena simultáneamente, aunque los primeros productos de la hidrólisis son siempre oligosacáridos de 5.0 - 7.0 unidades de glucosa o un número múltiplo. 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La amiloglucosidasa es una exohidrolasa también conocida como glucosamilasa, que hidroliza los enlaces glucosídicos α-1,4 y α-1,6 de la amilasa y la amilopectina. AC IÓ. N. separando unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena2.. UN IC. El proceso enzimático consta de dos etapas consecutivas, denominadas licuefacción y sacarificación, en donde intervienen las enzimas amilasas y. CO. M. glucosamilasas, respectivamente. Recientes avances en el desarrollo de amilasas. Y. termoestables han permitido mejorar la eficiencia del proceso de licuefacción,. A. entendiendo éste como el proceso de hidrólisis del almidón a maltodextrinas. ÁT. IC. mediante el rompimiento de los enlaces glucosídicos α-D 1,4 internos de la molécula. RM. del almidón, produciendo moléculas de diferentes número de unidades de glucosa.. IN FO. La principal ventaja del proceso enzimático, comparado con la hidrólisis ácida,. DE. radica en la no formación de subproductos y la reducción en la demanda energética. AS. del proceso ya que no requiere el uso de grandes presiones ni elevadas. SI ST. EM. temperaturas3,4.. Las α-amilasas presentan una gran utilidad tanto para la industria textil como. DE. para la de alimentos, pues rompen la molécula de almidón en fracciones más cortas. IO. N. (dextrinas). Las amilasas son enzimas extracelulares que catalizan las reacciones. CC. hidrolíticas del almidón, dando origen a diversos productos como oligosacáridos en. DI. RE. pequeñas cantidades y otros que poseen una gran relevancia para algunos operaciones y procesos industriales. Son comúnmente halladas en animales y en plantas; sin embargo, para fines industriales, las más utilizadas son aquellas de origen bacteriano o fúngico. Poseen una gran importancia en la producción de 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. alimentos y de biocombustibles5,6. Las amilasas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, se pueden dividir en tres grupos: α-amilasas, las cuales rompen al azar los enlaces en el interior del sustrato; β-amilasas las cuales hidrolizan. AC IÓ. N. ordenadamente unidades de maltosa a partir de los extremos no reductores del. UN IC. sustrato (exoamilasas) y glucosamilasas que liberan unidades de glucosa a partir de los extremos no reductores del sustrato. El principal producto final de la acción de la. CO. M. glucosamilasa sobre el almidón es glucosa, lo que la diferencia claramente de la α y β. Y. amilasas. La acción de la amilasa causa inversión de la configuración, produciendo β. IC. A. glucosa. En el comercio se encuentran diversas preparaciones derivadas de hongos. ÁT. Aspergillus sp y Rhizopus sp, excepto por la enzima de Aspergillus awamori, las. RM. glucosamilasas son inactivas sobre almidón nativo. Su actividad es máxima entre pH. DE. IN FO. 4.0 - 5.5, y temperatura alrededor de 55 - 65 °C7.. AS. En cuanto al pH óptimo para las α-amilasas de Bacillus subtilis o B.. EM. amyloliquefaciens es variable, pero se encuentra generalmente en el rango 6.0 - 7.0.. SI ST. Existen pocos reportes de α-amilasas con un pH óptimo por debajo de 5.0. Algunos casos excepcionales incluyen la α-amilasa producida por Alicyclobacillus. DE. acidocaldarius con un pH óptimo de 3.0 y la producida por Pyrococcus furiosus. IO. N. activa a un pH de 3.5. Debido a que la mayoría de las amilasas utilizadas en la. CC. sacarificación del almidón no son estables a pH ácido, este proceso debe ser ajustado. DI. RE. a un pH cercano a 6.0. Se ha planteado que los costos de procesamiento del almidón pueden ser reducidos de manera significativa si se utilizan amilasas estables a la acidez en el paso de sacarificación ya que esto permitiría realizar la hidrólisis de almidón en un solo paso. La industria del almidón es una de las principales usuarias 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. de amilasas para la hidrólisis y modificación de esta materia prima con el fin de obtener glucosa, maltosa y oligosacáridos, que pueden ser convertidos en jarabes de fructosa y dextrosa. La glucosa obtenida, también puede ser fermentada para. AC IÓ. N. producir etanol, aminoácidos y ácidos orgánicos. Sin embargo, para la conversión. UN IC. enzimática de almidones es necesario utilizar amilasas termoestables, ya que estas son adicionadas luego de un paso de gelatinización que requiere temperaturas entre. CO. M. 70 °C - 110 °C. La mayoría de α-amilasas producidas por Bacillus amyloliquefaciens. Y. y Bacillus subtilis presentan una temperatura óptima cercana a los 70ºC, pero se han. A. encontrado enzimas con temperaturas óptimas superiores aisladas a partir de Bacillus. RM. ÁT. IC. licheniformis y Bacillus stearothermophilus8.. IN FO. Son enzimas que catalizan al azar la hidrólisis de enlaces glucosídicos α-1,4. DE. de polisacáridos como el almidón y el glicógeno, para producir maltosa,. AS. oligosacáridos de diferentes tamaños y cadenas más o menos ramificadas llamadas. EM. dextrinas límite. Son de gran importancia en la industria alimenticia, textil, papelera. SI ST. y farmacológica, aunque las fuentes productoras de α-amilasas incluyen plantas, animales y microorganismos, son las enzimas microbianas las que encuentran mayor. N. DE. demanda en aplicaciones industriales. Tradicionalmente la producción de α-amilasas. IO. se ha llevado a cabo mediante procesos de fermentación líquida sumergida (FLS). RE. CC. debido al mayor control de factores ambientales como temperatura y pH, sin. DI. embargo; la fermentación en fase sólida (FFS) constituye una alternativa interesante puesto que los metabolitos se concentran y los procesos de purificación son menos costosos. Los medios empleados en FFS son semejantes en textura al hábitat natural. 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. de hongos filamentosos como Penicillium commune, lo que genera mayores rendimientos en la producción de enzimas y la mínima degradación por acción de proteasas. La amilasa mostró máxima actividad de hidrólisis de almidón soluble con. AC IÓ. N. pH 6.0 y estabilidad en un intervalo de pH de 5.0 - 7.09.. UN IC. Un proceso de fermentación típico es esencialmente un proceso que se lleva a. M. cabo en un recipiente llamado fermentador o en general biorreactor, mediante el cual. CO. determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por. A. Y. acción microbiana en metabolitos y biomasa. Resumiendo, un proceso fermentativo. ÁT. IC. consiste en unir un medio de cultivo que contiene nutrientes con un microorganismo. RM. dado, en un ambiente óptimo (fermentador), donde se establecen condiciones. IN FO. experimentales adecuadas (pH, temperatura, agitación, etc.) para obtener finalmente el producto deseado: biomasa, metabolitos, enzimas con el mayor rendimiento. El. DE. diseño de un fermentador, aparte de asegurar que la operación se desempeñe en. EM. AS. forma aséptica, debe responder a tres requisitos principales: Mezcla adecuada, buena. SI ST. transferencia del oxígeno del aire al microorganismo y remoción del calor. Este último imperativo, explica que a pesar de las bajas temperaturas a que operan los. DE. procesos biológicos con respecto a la catálisis química; sea necesario considerar. IO. N. superficies importantes de intercambio térmico dentro del fermentador para mantener. CC. la temperatura de crecimiento. El fermentador agitado consiste en un cilindro vertical. RE. que posee varios deflectores para prevenir la formación de un torbellino durante la. DI. agitación. El aire estéril penetra por la base del reservorio, a través de un distribuidor circular. El eje vertical lleva una o varias hélices en función de la relación altura/diámetro10.. 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las amilasas hidrolizan el enlace glucosídico α-1.4 o α-1.6 del almidón, glucógeno y otros polisacáridos. Se obtiene principalmente de fuentes microbianas y tiene múltiples aplicaciones en la industria, principalmente en la alimentaria. Las. AC IÓ. N. mejores fuentes productoras de amilasas son bacterias y hongos, no solo porque sus. UN IC. amilasas son generalmente extracelulares, sino que además presentan altos niveles de expresión. En este sentido, los principales microorganismos productores de amilasas. CO. M. son Bacillus subtilis, B. stearothermophilus, B. licheniformis y Aspergillus sp. Bacillus amyloliquefaciens produce una α-amilasa termoestable que es ampliamente. IC. A. Y. utilizada en las industrias que usan almidón. Las α-amilasas, son enzimas. ÁT. extracelulares denominadas endoenzimas porque catalizan la hidrolisis de enlaces. RM. glucosídicos internos α-1.4 presentes en el almidón, glucógeno y otros polisacáridos,. IN FO. asimismo hidrolizan enlaces glucosídicos α-1.6 en un menor porcentaje11.. DE. Las principales aplicaciones de las enzimas extracelulares que degradan el. EM. AS. almidón consisten en la conversión del almidón de jarabes que contienen glucosa,. SI ST. maltosa y oligosacáridos en la producción de azucares fermentables en cervecería y en la obtención de bebidas alcohólicas y en la modificación de la harina de. DE. panadería. Entre las enzimas comercialmente utilizadas se destacan las α-amilasas de. IO. N. Bacillus licheniformis, B. amyloliquefaciens y Aspergillus oryzae. Se han obtenido. CC. enzimas termoestables a partir de B. subtilis y B. licheniformis, permitiendo llevar a. RE. cabo la sacarificación a altas temperaturas, acelerando el proceso. Por otro lado la β-. DI. amilasas son exoenzimas que atacan los enlaces α-1.4 glucosídicos en la parte externa de la cadena de almidón, separa unidades de maltosa a partir de los extremos no reductores de esta por hidrólisis alterna de enlaces glucosídicos. Las β-amilasas. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. contienen un grupo sulfidrilo esencial para la actividad enzimática, que se lleva acabo de forma óptima en un rango de pH entre 4.0 y 5.012.. AC IÓ. N. La enzima α-amilasa es la enzima que favorece la hidrólisis de la cadena lineal (amilasa) y ramificada (amilopectina) del almidón, rompiendo los enlaces α-. UN IC. 1,4 que se encuentran en su interior, para así formar una mezcla de dextrinas, está. M. conformada por amilodextrinas, eritrodextrinas, acrodextrinas y maltodextrinas.. CO. Producto que se desea ampliamente en la industria con su aplicación. Para su. A. Y. favorable acción catalítica sobre el almidón, esta enzima requiere un activador como. ÁT. IC. el cloruro de sodio y un pH óptimo que se encuentra entre 5.0 y 7.0, siendo éste. RM. valor, para la enzima α-amilasa bacteriana de 6.5. Por otro lado cabe mencionar que. IN FO. es una enzima resistente al calor, ya que a 70ºC conserva aún su actividad amilolítica en un 70%. La α-amilasa es una enzima altamente sensible a una acidez elevada y se. DE. inactiva a pH ≤ 3.3 en un tiempo aproximado de 15 minutos. Actúa sobre el almidón. AS. en estado sólido y granulado (almidón crudo o nativo), y sobre preparaciones en las. SI ST. EM. cuales el almidón ya se encuentra gelatinizado13.. DE. Las α-amilasas provenientes de hongos y bacterias son las más utilizadas en. N. el sector industrial por sus múltiples ventajas: fácil disponibilidad, volumen de. CC. IO. producción, estabilidad de operación, modificación y optimización del proceso. Las. RE. α-amilasas bacterianas del género Bacillus como B. subtilis, B. stearothermophilus,. DI. B. licheniformis y B. amyloliquefaciens, han encontrado una extensa aplicación en diversos procesos industriales debido a sus amplios rangos de operación de temperatura (25 - 90°C), resistencia a pH extremos (1.0 - 11.5) y altos niveles de. 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. expresión. Debido al amplio intervalo de operación (temperatura y pH) de las amilasas microbianas, estas son altamente demandadas por la industria del almidón14.. AC IÓ. N. El proceso de hidrólisis enzimática del almidón hasta glucosa, se ha llevado a cabo en dos etapas, licuefacción y sacarificación, esta última puede alcanzar hasta. UN IC. 96% de dextrosa, por lo que ha sido necesario cultivar y manipular dos. M. microorganismos productores de enzimas amilolíticas separadamente, conllevando a. CO. un alto consumo de energía y de equipos para el proceso además de las diferencias. A. Y. existentes entre el pH y la temperatura que necesitan las dos enzimas, es difícil que. ÁT. IC. ambos actúen simultáneamente con el almidón. Las perspectivas futuras con respecto. RM. a la hidrólisis del almidón es acortar las etapas del proceso a una sola etapa, ya sea. IN FO. con dos cepas microbianas juntas con sus respectivas enzimas, con una sola cepa con las dos enzimas amilolíticas o con una enzima que tenga capacidad de romper todo. DE. tipo de enlace de las moléculas de almidón como lo hace la glucosamilasa. La. AS. amiloglucosidasa se utiliza a gran escala en la industria del procesado del almidón en. EM. tanques discontinuos a 55 - 60ºC y pH de 4.5 y con períodos de incubación de 48 -. SI ST. 92 h. para transformar las dextrinas formadas por la α-amilasa en glucosa. El calcio. IO. N. DE. la estabiliza frente a la desnaturalización por el calor o el pH15.. CC. Las β-amilasas hidrolizan el almidón atacándolo únicamente por su extremo. RE. no reductor y produce moléculas de maltosa y dextrinas básicamente; debido a que. DI. no hay una inmediata destrucción de la estructura polimérica del almidón, la βamilasa reduce la viscosidad de las dispersiones de almidón en forma muy lenta, a las α-amilasa se la designa como enzima licuante ya que al hidrolizar los enlaces. 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. químicos del almidón en una forma al azar, reduce rápidamente la viscosidad de las dispersiones de este polímero, el producto de esta hidrólisis son dextrinas, maltosa y glucosa, por lo que el poder reductor de las dispersiones de almidón aumenta. AC IÓ. N. considerablemente. La glucosa obtenida, también puede ser fermentada para producir. UN IC. etanol, aminoácidos y ácidos orgánicos. Por otro lado la α-amilasa procedente de Aspergillus oryzae fue la primera enzima microbiana producida a escala industrial y. CO. M. comercializada. En la actualidad el A. oryzae es el microorganismo más ampliamente utilizado como fuente productora de α-amilasa de origen fúngico y bacterias del. IC. A. Y. genero Bacillus como Bacillus subtilis principalmente. Las α-amilasas bacterianas y. ÁT. en especial aquellas provenientes de bacterias del género Bacillus como B. subtilis,. RM. B. stearothermophilus, B. licheniformis y B. amyloliquefaciens, han encontrado una. IN FO. amplia aplicación en los procesos industriales gracias a sus rangos de temperatura. DE. óptima (25 - 90ºC), resistencia a pH extremos (1.0 - 11.5) y altos niveles de. AS. expresión en comparación con las procedentes de hongos filamentosos como. EM. aquellos del genero Aspergillus, por lo que ocupan un lugar importante en la. SI ST. industria16.. DE. Las amilasas son enzimas extracelulares que hidrolizan el almidón y que. IO. N. pueden ser producidos por diferentes microorganismos, entre ellos las bacterias y. CC. hongos. Actualmente en nuestro medio, no se han profundizado estudios de. RE. producción de amilasa, utilizando bacterias silvestres y sustratos de origen agrícola. DI. con alto contenido de almidón, este polisacárido es ideal para la inducción de las permeasas que hidrolizan el almidón en productos como dextrinas, maltosa y glucosa, que luego de hidrolizarlos hasta monosacáridos, son aprovechados por las. 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. bacterias para su metabolismo, la expresión de la enzima amilasa excedente, queda en el medio fermentado que puede ser recuperada posteriormente. Las α-amilasas son generalmente estable a pH 5.5 – 8.0 en presencia de un complemento de calcio, la. AC IÓ. N. actividad óptima de las α-amilasas normalmente ocurre entre pH 4.8 - 6.5, pero hay. UN IC. diferencias en las formas de las curvas de actividad de pH de las diferentes enzimas de amilasas y también en los valores de pH óptimo. Según la temperatura a la que. CO. M. actúan, las amilasas se pueden clasificar en amilasas termoestables y termolábiles;. Y. las enzimas termoestables son aquellas que actúan sin perder su actividad en un. IC. A. rango de 60 - 110 °C y la mayoría de ellas son de origen bacteriano; mientras que las. ÁT. enzimas termolábiles, son aquellas que actúan hasta 55 °C sin perder su actividad,. IN FO. RM. generalmente varían entre los 20 - 55 °C y son de origen fúngico principalmente17.. La hidrólisis del almidón es el resultado de la actividad de diversas amilasas. DE. produciendo oligosacáridos, maltotriosas, maltosas, maltohexosas, maltopentosas,. EM. AS. maltotetrosas, dextrinas y pequeñas cantidades de glucosa. La α-amilasa exógena. SI ST. proveniente de Bacillus licheniformis es una de las enzimas más estudiadas por sus efectos en la degradabilidad del almidón. Sin embargo, en los experimentos. DE. realizados se ha prestado poca atención a la temperatura de la solución de la enzima,. IO. N. al proceso físico del grano, así como a los cambios de tamaño de partícula del. DI. RE. CC. almidón por sus propiedades fisicoquímicas18.. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En la literatura se encuentran múltiples modelos cinéticos que describen la hidrólisis del almidón. Uno de estos modelos describe la cinética de la hidrólisis de almidón soluble con glucosamilasa como una modificación de la ecuación de. AC IÓ. N. Michaelis - Menten que tiene en cuenta algunos factores que afectan la velocidad de. UN IC. reacción (inhibición por productos, desnaturalización de la enzima, cambios del pH y de la fuerza iónica, reversibilidad de la reacción, etc). Pero este modelo presenta una. CO. M. desventaja respecto a las conversiones pues no es aplicable a conversiones mayores. Y. al 40%, lo que se convierte en una limitante para el estudio de cinéticas que estén. IC. A. relacionadas con conversiones superiores. Modelos cinéticos para la fermentación de. ÁT. azúcares han sido ampliamente estudiados, desarrollaron y validaron un modelo. RM. considerando los efectos de temperatura e inhibición de sustrato, producto y biomasa,. IN FO. en el cual los parámetros cinéticos son descritos como función de la temperatura.. DE. Este modelo fue desarrollado a partir del estudio de las cinéticas de fermentación. AS. bajo condiciones de alto estrés para el microrganismo permitiendo determinar los. EM. efectos de inhibición; y se extiende al uso industrial pues también consideró un. SI ST. proceso continuo y utilizó como sustrato azúcar recuperada19.. DE. La hidrólisis consiste en la doble descomposición de la molécula de agua (H+. IO. N. y OH-) con otro compuesto, en la cual sus átomos forman otra especie química. Por. CC. la naturaleza disolvente del agua, también puede efectuarse la hidrólisis mediante. RE. adición de un ácido o una enzima. Al comparar los dos tipos de hidrólisis se. DI. encuentra la gran ventaja de la hidrólisis enzimática sobre la ácida. Esto se debe, primordialmente, a que las enzimas son específicas para un tipo de enlace (selectividad), por lo cual, no es usual la aparición de productos de degradación; caso. 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. contrario sucede con la hidrólisis ácida, en la cual, el poco control y la selectividad pobre ocasionan la aparición de productos de degradación, inclusive tóxicos. Otra ventaja son los rangos moderados de condiciones como temperatura y pH en las que. AC IÓ. N. transcurre la hidrólisis enzimática (pH = 4.0 - 8.0; T = 40 - 60°C). Además, no se presentan sustancias extrañas añadidas como en el caso de la hidrólisis acida para la. M. UN IC. neutralización en presencia de sales20.. CO. Durante las últimas dos décadas, la tecnología de producción de enzimas y en. A. Y. el especial las de origen microbiano, ha permitido que estas sean actualmente. ÁT. IC. comercializadas para diversos usos industriales. Actualmente, el género Bacillus. RM. destaca entre los distintos microorganismos estudiados y modificados genéticamente. IN FO. para la producción de amilasas de uso industrial. Las condiciones de temperatura, pH, entre otros factores, condicionan la efectividad del accionar de las enzimas. DE. amilolíticas. El uso de las enzimas amilolíticas termoestables, también tienen. EM. AS. características potenciales para usarse como aditivo en rumiantes21. Las amilasas del. SI ST. Bacillus licheniformis actúan por difusión en los gránulos de almidón y presentan una gran actividad en un intervalo de pH entre 4.0 - 9.0 y de temperatura entre 30 -. DE. 90°C con un óptimo de 76°C, ha sido modificado mediante ingeniería genética, y se. DI. RE. CC. IO. N. usa para producir amilasas industriales22.. 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. JUSTIFICACION Existen distintas bacterias que producen una variedad de enzimas extracelulares que son segregadas al medio para degradar los sustratos existentes, es el caso de Bacillus. AC IÓ. N. licheniformis que destaca por hidrolizar almidón presente en diferentes ambientes. UN IC. haciendo uso de las amilasas excretadas al medio, a una concentración de almidón, pH, temperatura y tiempo de exposición. Por otro lado, no se tiene información. CO. M. científica sobre el tiempo necesario para producir amilasas por B. licheniformis,. Y. disponible en el laboratorio en un biorreactor agitado, en este sentido se pretende dar. IC. A. inicio a una investigación para optimizar el proceso de producción de amilasas a. ÁT. escala de laboratorio. Por tanto, se pretende optimizar la producción de amilasas por. RM. B. licheniformis en cultivo sumergido de un biorreactor agitado, determinando el. IN FO. proceso de hidrólisis de almidón bacteriana para obtener jarabes glucosados que. DE. posteriormente pueden ser utilizados en la industria de producción de etanol, como. AS. una alternativa en la obtención de biocombustibles. Del mismo modo, las. EM. condiciones ambientales que se pueda lograr en los sistemas de ensayo nos. SI ST. permitirán mejorar los sistemas de producción, constituyendo comercialmente una propuesta para la industria a gran escala utilizando residuos de almidón y B.. DE. licheniformis nativo. En este sentido la investigación estará orientada a la evaluación. IO. N. del efecto de la temperatura y el pH en la producción de amilasas por B.. CC. licheniformis en condiciones de laboratorio para lograr hidrolizar un alto porcentaje. DI. RE. de almidón en el menor tiempo. Teniendo como problema científico: ¿Cuál es el efecto de la temperatura 25, 40 y 55ºC y pH 6, 7 y 8 en la producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado?. 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. OBJETIVO(S). General:. AC IÓ. N. 1. Determinar el efecto de la temperatura y pH en la producción de amilasas por. UN IC. Bacillus licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado hasta las 72h de. CO. M. incubación.. Y. Específicos:. IC. A. 1. Monitorear la producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-. RM. ÁT. A15 a pH 6, 7 y 8 en un biorreactor agitado a 25, 40 y 55°C hasta las 72h de. IN FO. incubación.. 2. Comparar la producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-. DE. A15 a pH óptimo a las temperaturas de ensayo en un biorreactor agitado hasta las. AS. 72h de incubación.. EM. 3. Determinar si existe o no diferencias significativa en la producción de amilasas a. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. condiciones de ensayo con relación al tiempo de incubación.. 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y METODOS. MATERIAL BIOLOGICO. N. 1.. AC IÓ. Cultivo de Bacillus licheniformis FGM-A15, proporcionado por el Laboratorio de. UN IC. Fisiología y Genética Microbiana de la Universidad Nacional de Trujillo, con. Y. METODOLOGIA. ÁT. IC. A. 2.. CO. M. capacidad amilolítica aislado de residuos de efluente de curtiembre23. (ANEXO 1). RM. 2.1. REACTIVACION DEL CULTIVO Bacillus licheniformis FGM-A15. IN FO. El cultivo bacteriano conservado en refrigeración fue sembrado en placas conteniendo agar almidón 0.1% (ANEXO 2) por estría, luego se procedió. EM. AS. DE. a incubar a 37ºC por 24h. (ANEXO 3). SI ST. 2.1.1 VERIFICACION CUALITATIVA DE LA CAPACIDAD. DE. DEGRADATIVA DE Bacillus licheniformis FGM-A15 E. DI. RE. CC. IO. N. IDENTIFICACION MICROSCOPICA Luego de la reactivación del cultivo puro se procedió a verificar la capacidad degradativa de Bacillus licheniformis FGM-A15 mediante la técnica del lugol24. Se sembró en placa conteniendo agar almidón 0.1% mediante la siembra por puntura, luego se procedió a incubar a 37ºC por 48h. Posteriormente de agrego lugol 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. y se observó el halo de hidrolisis del almidón alrededor de las colonias amilolíticas. Posteriormente se procedió a la identificación. CONSTRUCCION DE BIORREACTORES AGITADOS. UN IC. 2.2. AC IÓ. N. microscópica mediante una coloración Gram. (ANEXO 4). CO. M. Se construyeron 03 biorreactores con frascos de vidrio con un volumen de. Y. operación de 300 mL, con 04 “bafles”, se acondiciono un motor de 6V y. IC. A. un agitador tipo Roushton a cada uno25. (ANEXO 5). Los frascos y. ÁT. agitadores fueron esterilizados haciendo uso de hipoclorito de sodio (lejía). RM. al 2.5 % por 30 minutos, luego fueron llevados para ser irradiados con luz. EM. AS. DE. minutos. (ANEXO 6). IN FO. ultravioleta de una lámpara de 300 Watt, a una distancia de 30 cm, por 60. PREPARACION DEL INOCULO. SI ST. 2.3. El cultivo se sembró en agar almidón 0.5% y se incubo a 37°C por 12h. A. DE. partir del cultivo joven y utilizando solución salina fisiológica estéril se. nefelómetro de Mc Farland (9.0x108 UFC/mL). (ANEXO 7). DI. RE. CC. IO. N. preparó una suspensión microbiana equivalente al tubo Nº 3 del. 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.4. EVALUACION DE LA PRODUCCION DE AMILASAS POR Bacillus licheniformis FGM-A15 EN EL BIORREACTOR AGITADO A LAS CONDICIONES DE ENSAYO.. AC IÓ. N. Se colocó 180 mL de una solución de caldo almidón 0.6% - buffer fosfato. UN IC. al pH de ensayo (6.0, 7.0 y 8.0), suplementado con (NH4)2SO4, CaCl2 y CuSO4 (ANEXO 8), luego se agregó 20mL de inoculo estandarizado en. CO. M. cada uno de los biorreactores (ANEXO 9), seguidamente, se puso en. Y. funcionamiento a los biorreactores, con una agitación de 200 rpm. IC. A. aproximadamente en cada biorreactor, y se incubó a las temperaturas de. ÁT. ensayo (25, 40 y 55°C), de acuerdo al protocolo de los sistemas de ensayo.. IN FO. RM. (ANEXO 10). DE. A los tiempos 0, 12, 24, 36 y 72h, se extrajo 10 mL de muestra del. AS. biorreactor (ANEXO 11), se centrifugo a 2500 rpm por 10 minutos. EM. (ANEXO 12). En el sobrenadante (extracto de enzimas) se cuantificó la. SI ST. cantidad de amilasas producidas en relación al tiempo de incubación. IO. N. DE. (ANEXO 13), midiendo la cantidad de almidón residual.. DI. RE. CC. 2.5. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD CATALITICA En un tubo de ensayo, se colocó 1.0mL de disolución de almidón 0.1% buffer fosfato al pH de ensayo (6.0, 7.0 y 8.0) y 1.0mL de extracto de enzimas, se mezcló e incubo a 50 °C por 1h (ANEXO 14).. 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Posteriormente se procedió a inactivar las enzimas presentes, calentando a 80°C por 5 minutos.. N. Se trabajó con un tubo Control, colocando 1.0 mL de buffer fosfato y 1.0. AC IÓ. mL de extracto de enzima, calentado a 80 °C, y se incubó en las mismas. UN IC. condiciones, para cuantificar la cantidad de almidón residual presente en el. Y. MEDICION DEL ALMIDON RESIDUAL. A. 2.6. CO. M. extracto de enzimas.. ÁT. IC. En otro tubo de ensayo, se colocó 0.5mL del inactivado con 0.1mL de. RM. solución yodada (ANEXO 15), y 0.4 mL de agua destilada. Las lecturas de. IN FO. las absorbancias (Problema), se realizaron en el espectrofotómetro (Spectronic 20) a una longitud de onda de 580nm. (ANEXO 16). DE. Para determinar los miligramos (mg) de almidón residual, se multiplicó la. AS. absorbancia Problema corregida por el factor de conversión, y por la. SI ST. EM. dilución realizada, antes de realizar la lectura de la absorbancia en el. DE. espectrofotómetro.. ELABORACION DE LA CURVA ESTANDAR DE ALMIDON. IO. N. 2.7. DI. RE. CC. Se trabajó con solución de almidón a una concentración de 0.1mg/mL. Se colocó 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 y 0.6mL, en tubos de ensayo, respectivamente; se aforó a 1.0mL con agua destilada; luego se agregó a cada tubo, 0.5mL de HCl 0.01M y 0.1mL de solución yodada (I2/KI). Para. el blanco de reactivo, se trabajó con 1.0mL de agua destilada. Por último. 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. se procedió a realizar las lecturas en el espectrofotómetro. (ANEXO 17). Finalmente, se determinó el factor de conversión para cuantificar almidón. AC IÓ. N. por espectrofotometría.. DETERMINACION DE LA PRODUCCION DE AMILASAS. UN IC. 2.8. (UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMATICA). CO. M. Una unidad de actividad amilolítica (UA) se definió como la cantidad de. Y. amilasas necesarias para hidrolizar 10mg de almidón en 30 minutos, a. RM. ÁT. IC. A. 50°C, a pH de ensayo, expresados como UA/mL (ANEXO 18 - 22). IN FO. La cantidad de almidón hidrolizado, se calculó a partir de la diferencia entre el almidón inicial incubado y el almidón residual, después de la. AS. DE. actividad catalítica.. EM. Para calcular las UA/mL, se dividió la cantidad de almidon hidrolizado. DE. SI ST. calculado entre 10 y luego multiplicado por 2. DI. RE. CC. IO. N. 2.9 ANALISIS DE RESULTADOS La producción de amilasas (UA/mL), fueron analizados mediante las pruebas estadísticas de Tukey y Duncan para verificar si existe o no diferencia significativa entre los resultados obtenidos en cada sistema de ensayo. (Tabla 1 - 3) (ANEXO 23 - 25). 19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS. En la Fig. 1, se muestra la producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis. AC IÓ. N. FGM-A15 en el biorreactor agitado a los pH de ensayo a 25°C, en relación al tiempo de. M. UN IC. incubación, donde se observa una mayor producción a pH 7 entre las 24 y 36h.. CO. En la Tabla 1, se muestra el análisis de varianza unidireccional (ANAVA) para la. A. Y. producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 en el biorreactor. ÁT. IC. agitado a condiciones de ensayo donde se observa que existe diferencia significativa. IN FO. RM. entre las 12h y 36h a 25°C.. DE. En la Fig. 2, se muestran la producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis. AS. FGM-A15 en el biorreactor agitado a los pH de ensayo a 40°C, en relación al tiempo de. SI ST. EM. incubación, donde se observa mayor producción a pH 7 entre las 24 y 36h.. DE. En la Tabla 2, se muestra el análisis de varianza unidireccional (ANAVA) para la. IO. N. producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis en el biorreactor agitado a. RE. CC. condiciones de ensayo donde se observa que existe diferencia significativa a las 12, 36 y. DI. 72h a 40°C.. 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En la Fig. 3, se muestra la producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 en el biorreactor agitado a los pH de ensayo a 55°C, en relación al tiempo de. AC IÓ. N. incubación, donde se observa mayor producción a pH 7.. UN IC. En la Tabla 3, se muestra el análisis de varianza unidireccional (ANAVA) para la. M. producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis en el biorreactor agitado a. CO. condiciones de ensayo donde se observa que existe diferencia significativa a las 12, 36 y. ÁT. IC. A. Y. 72h a 55°C.. RM. En la Fig. 4, se muestran la producción de amilasas (UA/mL) a pH 7 a las diferentes. IN FO. temperaturas por Bacillus licheniformis FGM-A15 en relación al tiempo de incubación,. DE. donde la mayor producción corresponde a 55°C, con tendencia a seguir. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. incrementándose.. 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 0.12. AC IÓ. N. 0.1. UN IC. pH 6. 0.06. M. pH 7. CO. UA/mL. 0.08. A. Y. 0.04. pH 8. 0 20. 40. IN FO. 0. RM. ÁT. IC. 0.02. 60. 80. AS. DE. Tiempo (h). EM. Figura 1. Producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 en. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. biorreactor agitado a los pH de ensayo (6, 7 y 8) a 25°C.. 22. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 1. Análisis de varianza unidireccional (ANAVA) para la producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 en el biorreactor agitado a. Unidades Amiloliticas/mL Subconjunto N (pH) 0.0000. 12. 3. 0.0434. 24. 3. 0.0545. 36. 3. 0.0688. 72. 3. 3. 24. 3. 36. 3. 72. 0.0545. 0.0545. 0.0688. 0.0688. 0.0000. DE. 3. 0.0777. 3. 0.0434. 3. 0.0545. 0.0545. AS. 24. Duncana,b. 0.0434. 3. 0 12. ÁT. 12. 0.055. 0.0000. RM. 3. IN FO. Tukey B. a,b. 1,000. A. 0.0777. Sig. 0. UN IC. 3. CO. 0. 3. IC. DHS de Tukeya,b. 2. Y. 1. M. Tiempo (h). AC IÓ. N. 25°C, mediante las Pruebas de Tukey y Duncan. (ANEXO 20). 3. 0.0688. 72. 3. 0.0777. EM. 36. 1.000. SI ST. Sig.. 0.303. 0.059. DE. Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.. IO. N. Basadas en las medias observadas.. DI. RE. CC. El término de error es la media cuadrática (Error) = 15431.133. a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3.000 b. Alfa = 0.05. 23. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 0.16. N. 0.14. AC IÓ. 0.12. UN IC M. 0.08. pH 8. A. Y. 0.06. pH 6 pH 7. CO. UA/mL. 0.1. ÁT. IC. 0.04. IN FO. RM. 0.02. 0. 0. 20. 40. 60. 80. EM. AS. DE. Tiempo (h). SI ST. Figura 2. Producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 en. DI. RE. CC. IO. N. DE. biorreactor agitado a los pH de ensayo (6, 7 y 8) a 40°C.. 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 2. Análisis de varianza unidireccional (ANAVA) para la producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 en el biorreactor agitado a. Unidades Amiloliticas/mL Subconjunto N 0.0000. 12. 3. 0.0844. 24. 3. 0.0916. 36. 3. 0.1028. 72. 3. A. IC. 0. 3. 12. 3. 24. 3. 36. 3. 72. 3. 0. 3. 12. 3. 0.0844. 3. 0.0916. EM. 36 72. 0.0916 0.1028 0.1108 0.167. IN FO. RM. 0.0844 0.0916. 0.0916. 0.1028. 0.1028 0.1108. 0.0000. DE. 24. Duncana,b. 0.0000. 0.195. AS. Tukey B. 1,000. 3. 0.0916 0.1028. 3. SI ST. Sig.. 4. M. 3. Y. 0. Sig.. a,b. 3. ÁT. DHS de Tukeya,b. 2. UN IC. 1. CO. Tiempo (h). AC IÓ. N. 40°C, mediante las Pruebas de Tukey y Duncan. (ANEXO 21). 0.1028 0.1108. 1.000. 0.366. 0.174. 0.314. DE. Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.. IO. N. Basadas en las medias observadas.. CC. El término de error es la media cuadrática (Error) = 8381.867. DI. RE. a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3.000 b. Alfa = 0.05. 25. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 0.2 0.18. AC IÓ. N. 0.16 0.14. UN IC. UA/mL. 0.12. pH 6 pH 7. CO. M. 0.1. pH 8. Y. 0.08. IC. A. 0.06. ÁT. 0.04. RM. 0.02. 0. IN FO. 0 20. 40. 60. 80. EM. AS. DE. Tiempo (h). Producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15. SI ST. FIGURA 3.. DI. RE. CC. IO. N. DE. en biorreactor agitado a los pH de ensayo (6, 7 y 8) a 55°C.. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 3. Análisis de varianza unidireccional (ANAVA) para la producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 en el biorreactor agitado a. AC IÓ. N. 55°C, mediante las Pruebas de Tukey y Duncan. (ANEXO 22). Subconjunto N 1 0.0000. 12. 3. 0.1202. 24. 3. 0.1309. 36. 3. 72. 3. 12. 3. 24. 3. 36. 3. 72. 3. 0. 3. 24. SI ST. 72. 0.1492. IC. 0.222. 0.191. 0.1202 0.1309. 0.1309 0.1492. 0.1492 0.1684. 0.1202. 3. 0.1309. 3. 0.1492. 3. 0.1684 1.000. 0.206. 1.000. 1.000. DE. Sig.. 0.1492 0.1684. A. 3. EM. 36. 0.1309. 0.0000. AS. 12 Duncana,b. 0.0000. 0.658. RM. 3. IN FO. 0. DE. Tukey B. 1.000. 4. M. 3. Y. 0. Sig.. a,b. 3. ÁT. DHS de Tukeya,b. 2. CO. Tiempo (h). UN IC. Unidades Amiloliticas/mL. N. Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.. CC. IO. Basadas en las medias observadas.. RE. El término de error es la media cuadrática (Error) = 9078.650. DI. a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3.000 b. Alfa = 0.05. 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 0.2 0.18. AC IÓ. N. 0.16. UN IC. 0.14. UA/mL. 0.12. M. 0.1. CO. 40°C 55°C. Y. 0.08. 25°C. IC. A. 0.06. RM. ÁT. 0.04. IN FO. 0.02 0 0. 20. 40. 60. 80. SI ST. EM. AS. DE. Tiempo (h). FIGURA 4. Producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 a. DE. pH 7 a las temperaturas de ensayo (25, 40 y 55°C), en relación al tiempo. DI. RE. CC. IO. N. de incubación.. 28. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSION. La producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 a condiciones. AC IÓ. N. de pH 6.0, 7.0 y 8.0 y a las temperaturas de 25, 40 y 55°C; fue determinado durante las 72h de incubación mediante la cuantificación de la actividad enzimática midiendo. UN IC. almidón residual para lograr determinar las condiciones óptimas de pH y temperatura.. M. Por otro lado según lo reportado por Fernández y col, para caracterizar el pH y la. CO. temperatura óptimos de la actividad amilásica utilizó un rango de pH entre 2.0 - 12.0 y. A. Y. un rango de temperatura entre 25 y 70°C, donde la actividad enzimática a diferentes pH. ÁT. IC. mostró que las amilasas son poco estables en medio ácido, reduciéndo su actividad en. RM. más de un 70%, con la existencia de más de un óptimo en la mayoría de las especies. IN FO. consideradas, apuntando a la posible existencia de isoformas de la α-amilasa con valores de pH óptimo más alcalinos (8.0 y 9.0), hecho que se corresponde con la alta. EM. AS. DE. sensibilidad a valores de pH ácidos 26.. SI ST. Calvo y Zúñiga, evaluaron diferentes cepas de Bacillus spp. a pH 4.0 y 5.5 quienes mostraron diferentes tasas de crecimiento, a pesar de ser un género bacteriano. DE. asociado a pH neutros27; es así que el estudio de Bacillus licheniformis FGM-A15 dió. IO. N. un efecto positivo de crecimiento a pH neutro (7.0), debido a que se determinó mayor. CC. producción de amilasas en comparación con pH 6.0 y 8.0 en los biorreactores agitados,. RE. con una velocidad de agitación aproximada de 200 rpm y el medio enriquecido que. DI. posiblemente permitió mantener un medio equilibrado y óptimo.. 29. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La temperatura, pH y el tiempo de incubación son factores determinantes en la producción de amilasas, así como en la actividad y estabilidad de una enzima; donde la actividad amilásica verifica el proceso de hidrólisis del almidón de Bacillus. AC IÓ. N. licheniformes FGM-A15, siendo a 40 y 55°C donde presentó la mayor actividad. UN IC. enzimática, debido a que hubo mayor producción de amilasas con pH 6.0 y 7.0, hasta las 72h de incubación (FIGURA 2 y 3); a diferencia de lo reportado por Guadarrama y. CO. M. col. sobre la actividad enzimática ya que trabajo con temperaturas entre 28 a 37°C,. Y. siendo esta última donde la actividad fue mayor, con rango de pH 4.0 a 6.0, suponiendo. A. que la producción de la enzima es directamente proporcional en relación al tiempo de. RM. ÁT. IC. incubación del sistema de producción 28.. IN FO. Según lo reportado por Llenque que monitoreo la presencia de almidón residual,. DE. registrando el tiempo total necesario para que la bacteria hidrolice completamente la. AS. cantidad de almidón presente en cada uno de los sistemas. Logró seleccionar un bacteria. EM. con mayor capacidad hidrolítica sobre el almidón de papa en medio acuoso identificado. SI ST. como Bacillus subtilis, el mismo que alcanzó una velocidad de hidrolisis experimental. DE. de 0.166 g almidón/h con 40ºC a pH 7.5 y 1.0 % de almidón, encontrándose un mayor. N. efecto positivo de la temperatura (40ºC) y el pH (7.5) sobre la velocidad de hidrólisis;. CC. IO. por el contrario, este trabajo realizado con Bacillus licheniformis FGM-A15 demostró. RE. que en los 3 ensayos realizados, el que se trabajó a pH 7 tuvo un efecto positivo sobre la. DI. hidrolisis del almidón a 55°C, ya que se produjo 0.1876 UA/mL hasta las 72h de incubacion, con una concentración de almidón de 0.6 % 29.. 30. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..