Validación del método analítico por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) para la cuantificación de aciclovir en tabletas de 200 mg junio agosto 2007

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. O. Q. UI M. IC A. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. Y. BI. “VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO POR CROMATOGRAFÍA. AC. IA. LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC) PARA LA CUANTIFICACIÓN DE. FA. RM. ACICLOVIR EN TABLETAS DE ACICLOVIR 200 mg. JUNIO-AGOSTO 2007”. DE. INFORME DE INTERNADO REALIZADO EN EL. TE. CA. ÁREA: INDÚSTRIA FARMACÉUTICA PARA OPTAR EL:. BI BL. IO. TÍTULO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO. AUTORA:. Br. RUIZ NAVARRETE, MARÍA FIORELLA.. ASESOR: Q.F. Dr. RAMON PIMINCHUMO CARRANZA. TRUJILLO-PERU 2008. -0Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UI M. ________________________________. IC A. JURADO EVALUADOR. AC. IA. Y. BI. O. Q. PRESIDENTE. RM. ________________________________. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. MIEMBRO. ______________________________________ Dr. RAMON PIMINCHUMO CARRANZA MIENBRO. -1Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR: De conformidad con las disposiciones legales y vigentes del reglamento de grados y títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de la Libertad – Trujillo, someto a vuestro elevado criterio de evaluación la tesis intitulada:. IC A. “VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO POR CROMATOGRAFÍA. UI M. LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC) PARA LA CUANTIFICACIÓN DE. Q. ACICLOVIR EN TABLETAS DE ACICLOVIR 200 mg. JUNIO-AGOSTO 2007”.. BI. O. Con la cual pretendo optar el Título de Químico Farmacéutico.. Y. Esperando vuestra aprobación para los errores involuntarios que pudieran presentarse,. Trujillo, Agosto del 2008.. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. dejo a vuestra consideración, la respectiva calificación de la presente.. _____________________________________ MARÍA FIORELLA RUIZ NAVARRETE. -2Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO. Quiero expresar mi agradecimiento a todas aquellas personas que hicieron posible la realización de este trabajo; a quienes me dieron la oportunidad de dar mis primeros pasos en la industria farmacéutica y a quienes contribuyeron con todos sus conocimientos en esta labor; en especial al Dr. José Luís Morales Bravo, quien con paciencia y esmero hizo posible que aprendiera a ser analista y amar más aún mi. UI M. IC A. carrera, al Dr. Edwin Medina Rojas, quien siempre tuvo el tiempo suficiente para. Q. brindarme ayuda cuando se lo pedí.. BI. O. A mis amigos, Juan José y Pedro Miguel, con quienes desde el primer momento nos. IA. Y. propusimos salir adelante y alcanzar nuestros más anhelados sueños, con quienes. AC. hemos compartido alegrías y penas y de quienes siempre he escuchado una palabra de. FA. RM. aliento.. DE. A José Luís, porque no solo me has apoyado en los momentos de triunfo, sino también. CA. en los momentos difíciles y a pesar de los errores cometidos jamás me has dado la. TE. espalda, y me has enseñado que cuando las cosas se desean con tanta fuerza, el. BI BL. IO. universo conspira para que se realicen. Por supuesto infinitas gracias a mi asesor, Dr. Ramón Piminchumo Carranza por su tiempo, su paciencia y los valiosos aportes a este trabajo.. María Fiorella Ruiz Navarrete.. -3Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) UI M. IC A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Q. Gracia Dios Padre por permitirme llegar a esta etapa de mi vida. Y. BI. O. en la que puedo decir que he logrado algo por mi familia y. AC. IA. por mi país.. RM. Bendíceme en el camino profesional y permite que cada labor que realice le. DE. FA. brinde a las personas salud y bienestar.. BI BL. IO. TE. CA. Que mi trabajo sea bueno y que nunca le falle a mi profesión.. -4Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A mi Padre José Ruiz Cárdenas, quien me ha enseñado que el fuerzo, la dedicación y el trabajo son el camino para ser mejores cada día y me ha. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. conducido por esa senda; gracias padre por tu sacrificio.. AC. IA. A mi Madre Herminda Navarrete Medina, a quien jamás podré retribuir los. RM. enormes sacrificios hechos y que sigue haciendo por lograr de mí una mejor. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. persona.. A Lupita Magali, Jhony Ronald, José Abel y Lina Lelsy, gracias por el apoyo, por las risas, por ser ustedes. Son los mejores hermanos del mundo.. -5Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. PÁGINAS PRELIMINARES PRESENTACIÓN AGRADECIMIENTO. IC A. DEDICATORIA. UI M. ABSTRACT……………………………………………………………………………. i. Q. RESUMEN………………………………………………………………..............…… ii. BI. O. I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………….................. 1. Y. II. MATERIAL Y MÉTODO………………………………………………................ 9. AC. IA. III. RESULTADOS.………………………………………………………................. 25. RM. IV. DISCUSIÓN……………………………………………………...…….…………29. FA. V. CONCLUSIONES…………………………………………………………........... 34. DE. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………................. 35. BI BL. IO. TE. CA. ANEXOS. -6Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRAT. This report shows the development of the process high performance liquid chromatography (HPLC) used to for quantification of Acyclovir in tablet of Acyclovir 200 mg, for which the study was made of the following performance parameters: Selectivity and specificity, linearity, accuracy, precision, robustness and limits of. IC A. quantification.. UI M. This validation was made to establish well documented evidence to ensure that the. Q. valuation method provides reliable results to be applied in the analysis routine and thus. BI. O. meet the standards set by the national regulatory organization.. Y. It has been determined that the analytical method of valuation is selective and specific,. AC. IA. it is accurate with a confidence level of 95%, and it is linear to the range of. RM. concentration studied, with adequate precision and accuracy. It has also determined that. FA. the method can handle small variations in the conditions of analysis, without affecting. DE. the reliability of results and the least amount of active ingredient that can be quantified. CA. is 2, 3 mg/mL.. BI BL. IO. TE. Fulfilling all parameters established the analytical method has been validated.. Keywords: Validation, quality control, Acyclovir, performance parameter, HPLC.. -- i7- Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN. El presente informe muestra el desarrollo del proceso de validación del método cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) usado para la cuantificación de Aciclovir presente en tabletas de Aciclovir 200 mg, para lo cual se efectúo el estudio de los siguientes parámetros de desempeño: Selectividad y especificidad, linealidad, exactitud,. IC A. precisión, robustez y límite de cuantificación.. UI M. Esta validación se realizó para establecer pruebas documentadas de que el método de. Q. cuantificación brinda resultados confiables al ser aplicado en el análisis de rutina y así. BI. O. cumplir con las normas establecidas por el organismo regulador nacional.. Y. Se concluye que el método de valoración es selectivo y específico, exacto con un nivel. AC. IA. de confianza del 95%, lineal para el rango de concentración estudiado, con adecuada. RM. precisión y exactitud. Así mismo, se ha determinado que el método puede soportar. FA. pequeñas variaciones en las condiciones de análisis, sin afectar la confiabilidad de los. DE. resultados; y se ha establecido que la menor cantidad de principio activo que puede ser. CA. cuantificada es de 2,3 µg/ mL. Como se cumple con todos los parámetros establecidos,. BI BL. IO. TE. el método analítico se considera validado.. Palabras clave: Validación, control de calidad, Aciclovir, parámetros de desempeño, HPLC.. --ii8 -Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN:. La vocación de la industria farmacéutica desde siempre ha sido producir medicamentos de calidad y con total garantía de seguridad. Con los años, se han ido desarrollando recomendaciones e incorporando requerimientos que han evolucionado hasta una reglamentación estricta, con lo cual ha logrado hacerse de una imagen de calidad. IC A. excelente. Al elaborar productos destinados a curar la enfermedad, salvar vidas o. UI M. mejorar la calidad de vida, no puede haber el mínimo margen de error. Sin embargo, a. Q. pesar de los esfuerzos de control y fabricación, se exige una mejora continua y máximas. BI. O. garantías de la calidad; y es en el avance para conseguir un total dominio de la calidad,. Y. cuando surge la concepción de validación 2,9,16,18.. AC. IA. Los procedimientos para la evaluación de los niveles de calidad de los productos. oficiales. son. considerados. FA. monografías. RM. farmacéuticos están sujetos a diversos requisitos. Los análisis y especificaciones de las por. las. instituciones. nacionales. e. DE. internacionales, como indispensables y que deben ser cumplidas para asegurar la calidad. CA. de los productos farmacéuticos 2,6.. IO. TE. La industria farmacéutica nacional debe sostenerse a los más altos parámetros de. BI BL. calidad por el tipo de producto que elabora. En el país, la entidad reguladora de asegurar que los productos farmacéuticos se fabriquen en forma uniforme y controlada, de acuerdo a las normas de calidad en relación al uso que se les pretenden dar y conforme a las condiciones exigidas para su comercialización que garanticen la salud de la población es la Dirección General de Medicamentos, Insumos y Drogas del Ministerio de Salud (DIGEMID). Esta institución, ha elaborado el Manual de Buenas Prácticas de Manufactura de Productos Farmacéuticos, cuyas normativas son obligatorias de cumplir por parte de los laboratorios fabricantes de productos farmacéuticos en el país. En el. -1Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Título Primero del manual: “De la administración de la calidad en la industria farmacéutica: Fundamentos y elementos esenciales”, señala en el Capítulo V. Validación; Artículo 11º, lo siguiente: “Los estudios de validación constituyen una parte esencial de las BPM, deben efectuarse conforme a protocolos definidos de antemano. Debe prepararse y archivarse un reporte escrito que resuma los resultados y las conclusiones registradas. Deben establecerse procesos y procedimientos sobre la base. IC A. de un estudio de validación, los cuales se sometan periódicamente a una revalidación. UI M. para asegurar que con ellos se puedan seguir obteniendo los resultados deseados. Se. Q. debe prestar especial atención a la validación de los procedimientos de proceso,. BI. O. limpieza y de los métodos analíticos.” Parte de las políticas de calidad establecidas en. Y. los laboratorios farmacéuticos, es cumplir con las normas vigentes indicadas en el. AC. IA. Manual de BPM, siendo un tema de interés el cumplimiento del Capítulo V: Validación;. RM. con la finalidad de garantizar que todo método analítico que es empleado en el. FA. laboratorio de control de calidad sea el adecuado y esté validado mediante el. DE. cumplimiento de la realización de un programa de validación de métodos analíticos para. CA. garantizar la calidad de los productos farmacéuticos 5.. IO. TE. La calidad se define como el conjunto de atributos o cualidades que constituyen la. BI BL. manera de ser de un objeto y que satisfacen las necesidades del usuario, cuando nos referimos al medicamento, de cuyas características depende la salud de los seres humanos, la calidad se convierte en un requisito fundamental 1, 2, 3, 16, 18. La validación garantiza la calidad del medicamento, porque mediante su desarrollo, se establecen pruebas documentadas que aportan un alto grado de seguridad de que un proceso planificado se efectuará uniformemente en conformidad con los resultados previstos especificados 10, 12, 19, 21,23, 25, 26.. -2Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La validación puede definirse como una aproximación sistemática para asegurar la calidad del producto, basada en la identificación de las variables del proceso que más influyen en las características de calidad del producto, con el objeto de obtener un método de fabricación y métodos de control establecidos, de manera que se asegure que si se siguen al pie de la letra se alcanzarán todas las especificaciones del producto y por tanto su calidad 9.. 7, 19.. Estos estudios verifican el. UI M. sistemas, los servicios de un laboratorio y sus procesos. IC A. Los estudios de validación son aplicables a los métodos analíticos, los equipos, los. Q. sistema en observación y en condiciones de pruebas extremas, semejantes a las que. BI. O. cabría esperar durante su desarrollo, de modo que comprueban que dicho sistema está. Y. bajo control 9, 21, 24, 25.. AC. IA. La validación de cualquier equipo, proceso, ensayo, método, cumple tres requisitos. RM. fundamentales: Garantía de la calidad (contribuye a garantizar la calidad y asegurar el. FA. mantenimiento de las propiedades de calidad de un producto); Demostración (fiabilidad. DE. y reproducibilidad) y Documentación (pruebas efectuadas y datos obtenidos referidos a. CA. las pruebas según protocolo de validación) 2,16,18,21.. IO. TE. La validación se puede establecer mediante estudios prospectivos (cuando un producto. BI BL. se estudia por primera vez), concurrentes (basados en datos recogidos durante la ejecución efectiva de un método que ya ha sido implementado, es decir, métodos analíticos y procesos de fabricación bien controlados) o retrospectivos (basados en la evaluación de datos históricos acumulados de un producto) 12,17,20. Para iniciar una validación de un método analítico, es necesario establecer previamente el analito a estudiar, trabajar con una formulación definitiva y trabajar el método analítico de modo que nos ofrezca garantía de que la validación puede ser satisfactoria 1,12,20.. -3Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se deben establecer las condiciones por cumplir, determinar los parámetros estadísticos del procedimiento y valorar los resultados de la validación obtenidos 19. Sumado a ello, se realiza la prueba de idoneidad del sistema (SST, del inglés, System Suitability Test), que consiste en un conjunto de ensayos que permiten comprobar en el momento de la utilización del método, que el sistema (analista, reactivos e instrumentos) es adecuado para llevar a cabo la determinación para la que se ha establecido y validado dicho. IC A. método. En la práctica podría equipararse a una calificación del proceso analítico o una. UI M. “revalidación en continuo”, ya que proporciona la seguridad de que en el momento de. Q. iniciar el ensayo, el conjunto del sistema continúa siendo válido para el propósito para. BI. O. el que fue creado 1.. Y. En la validación de métodos analíticos se establecen las siguientes propiedades:. AC. IA. exactitud, precisión, linealidad, intervalo o rango, límite de cuantificación y de. RM. detección, especificidad o selectividad y robustez. Estos son los denominados. FA. parámetros de validación o de desempeño 1,7,10,20,25.. DE. La exactitud de un método analítico expresa la proximidad entre el valor aceptado. Se puede obtener de diversas formas, una alternativa es. TE. 1,6,7,9,11,14,19.. IO. encontrado. CA. convencionalmente como verdadero o un valor de referencia y el valor experimental. BI BL. comparar los resultados del método a evaluar con otro método de referencia ya validado, también se puede analizar muestras de concentración conocida (patrones de referencia) 1. El método más utilizado es el de adición de placebo o placebo cargado, el cual se ha empleado en el presente estudio 1,7,10,14,20. La precisión expresa el grado de concordancia o grado de dispersión entre una serie de medidas de tomas múltiples a partir de una misma muestra homogénea en las condiciones establecidas, da a conocer la variabilidad del método analítico. 1, 12.. El. estudio de la precisión resulta ser muy importante ya que los factores susceptibles de. -4Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. influir en los resultados de un ensayo, no pueden ser siempre controlados 1. Este parámetro se expresa como la desviación estándar (SD) o desviación estándar relativa también denominado coeficiente de variación: RSD o CV 6,10,16,17,18,20. Se pueden estudiar varios tipos de precisión: reproducibilidad, se refiere al uso del método analítico en diferentes laboratorios, es decir, bajo distintas condiciones de medición; no es de obligado cumplimiento en las validaciones de métodos analíticos La repetibilidad o repetitividad, estudia la variabilidad del método efectuando. IC A. 1,10,12,19,20.. 1,6,7,9,13,17,18,19. y finalmente la. Q. en un mismo laboratorio y en un período corto de tiempo. UI M. una serie de análisis sobre las mismas muestras en las mismas condiciones operativas,. BI. O. precisión intermedia, también conocida como tolerancia o fortaleza, estudia la. Y. variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra, pero. AC. IA. bajo condiciones operativas distintas, es decir, diferentes analistas, diferentes equipos,. FA. en un mismo laboratorio 7,10,14.. RM. en tiempos diferentes 1,6,12,18,19,20. Este estudio es el más representativo de la variabilidad. DE. La linealidad expresa la capacidad del método para producir resultados directamente. La proporcionalidad puede obtenerse también mediante. TE. 1,6,14,16,17,18.. IO. establecido. CA. proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un intervalo. BI BL. transformaciones matemáticas bien definidas, que incluyen el logaritmo, la raíz cuadrada o la recíproca 6. El valor de linealidad determina el intervalo de valoración o rango. 1,10,18,20.. El rango es el intervalo entre la concentración superior e inferior del. analito, para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método analítico 1,6,7,10. La especificidad es la capacidad de evaluar de forma inequívoca el analito en presencia de otros componente cuya presencia se espera en la muestra (impurezas, productos de degradación, matriz) 6. Generalmente el término especificidad se usa como sinónimo de. -5Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. selectividad; ésta se debe determinar antes de iniciar el estudio de los otros parámetros de desempeño, dado que da a conocer en qué grado la respuesta del método es únicamente proporcionada por el analito y no interfieren otras sustancias presentes en la muestra 1,6,10,12,14,18,19,20. Entre otros parámetros importantes se tiene el límite de detección que es la mínima cantidad de analito en la muestra que se puede cuantificar bajo las condiciones. IC A. experimentales descritas con adecuada precisión y exactitud y el límite de. UI M. cuantificación que es la mínima cantidad de analito que puede ser cuantificada con. Q. adecuada precisión y exactitud. Ambos parámetros no son de obligado cumplimiento. BI. O. pero son importantes principalmente para el establecimiento de métodos para análisis de. Y. estabilidad 6,7,10,13,14,19.. AC. IA. Finalmente la robustez es la medida de la capacidad del método para permanecer. RM. inalterado ante pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros analíticos,. FA. proporcionando idea de su fiabilidad y estabilidad durante su empleo en rutina. 1,6,18.. El. DE. objetivo de esta prueba es optimizar el método analítico y describir que se puede. CA. obtener resultados exactos con alta seguridad, de modo que se acepta como método. IO. TE. confiable en las condiciones normales de uso 14,19.. BI BL. Una vez cumplidas todas las etapas del proceso de validación, es importante documentar los procedimientos de forma que el método sea implantado de manera clara y sin ambigüedades 10. La validación es fundamental pues permite demostrar que los métodos analíticos son adecuados para el análisis de las condiciones establecidas y es la prueba documental de que existe confianza y seguridad en los resultados; así validar los métodos analíticos permite cumplir las exigencias legales tanto del registro de los productos farmacéuticos,. -6Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. como de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL), asegurando la calidad del producto y en ello radica su importancia en la industria farmacéutica 1,7,14. Para el desarrollo químico-farmacéutico de un nuevo medicamento es imprescindible la utilización de un método analítico que permita cuantificar el producto mayoritario en forma de materia prima o como ingrediente activo de una formulación. Mediante un proceso de validación, se comprueba si el método es lo suficientemente confiable y si. IC A. los resultados previstos se obtienen dentro de las condiciones prefijadas 2,5,21.. UI M. El Aciclovir pertenece a una clase de medicamentos antivíricos llamados análogos. Q. sintéticos de los nucleósidos. Es una droga que se usa en el tratamiento de las. BI. O. infecciones producidas por el virus Herpes humano (VHH), entre las que se incluyen el. Y. herpes genital, el herpes bucal, el herpes zoster y la varicela. Esta droga impide la. AC. IA. replicación viral, el efecto es la detención de la replicación del virus. Este efecto es muy. RM. selectivo de los virus herpes simple tipos 1 y 2 (VHH 1 y 2), virus varicela-zoster. FA. (VZV) y virus de Epstein-Barr (VEB) 22.. DE. Al establecerse la producción de este medicamento en el país, en la forma farmacéutica. CA. de tabletas de Aciclovir 200 mg, se hizo necesario, validar el método analítico de. IO. TE. cuantificación para el control de calidad del producto terminado, así como su empleo en. BI BL. los estudios de estabilidad. Por estas razones en el desarrollo del presente trabajo, se plantearon los siguientes objetivos: Objetivo General: 1. Validar el método analítico por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) usado para la cuantificación de Aciclovir contenido en tabletas de Aciclovir 200 mg.. -7Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Objetivos específicos: 1. Demostrar que el método analítico para la cuantificación de Aciclovir contenido en tabletas de Aciclovir 200 mg, cumple con las especificaciones de los parámetros de desempeño establecidos y es apto para el propósito indicado. 2. Determinar la sensibilidad y especificidad del método analítico. 3. Determinar la linealidad del método analítico.. IC A. 4. Determinar la exactitud del método analítico.. UI M. 5. Determinar la precisión del método analítico.. Q. 6. Determinar la robustez del método analítico.. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. 7. Establecer el límite de cuantificación del método analítico.. -8Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIAL Y MÉTODO:. 1. MATERIAL: 1.1. Material en estudio: 1.1.1. 120 tabletas de Aciclovir 200 mg tableta, Nº. de lote: 0010857. 1.1.2. 50 g de placebo de Aciclovir tabletas elaborado por el área de producción. IC A. según el procedimiento de fabricación.. UI M. 1.2. Material de Laboratorio:. Q. 1.2.1. Materiales:. BI. O.  Columna cromatográfica RP 18 125x4 mm.. Y.  Filtros de 0,22 y 0,45 µm.. AC. IA.  Frasco 1L con tapa de cierre hermético.. RM.  Jeringas de vidrio de 10 mL.. FA.  Matraz aforado de 200 y 250 mL.. DE.  Pipetas volumétricas de 5 y 20 mL.. CA.  Probetas de 1000 mL.. IO. TE.  Viales con tapa de 2 mL de capacidad.. BI BL. El material de vidrio en mención se encuentra verificado. 1.2.2. Equipos:. NOMBRE Agitador múltiple Balanza Analítica Cromatógrafo Líquido. MODELO. MARCA. ÚLTIMO MANTENIMIENTO. -----. IKA. -----. CP225D. Sartorius. 2007/04. Serie 1100. Hewlett Packard. 2007/04. -9Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Cromatógrafo Líquido. HP1200 DAD. Hewlett Packard. 2007/04. Ultrasonido. 150D. VWR. -----. 1.2.3. Reactivos:  Ácido Acético Glacial (Marca Merck).  Agua destilada calidad HPLC.. UI M.  Estándares de referencia secundario:. IC A.  Estándar de resolución : Guanina USP. O. Q. Aciclovir: Lote 4608516018. BI. Potencia: 93.85% T/C. IA. Y. Fecha de expira: 30-03-2010.. AC.  Hidróxido de Sodio (Marca Merck).. RM. Los reactivos se encuentran almacenados a 25 º C, debidamente. FA. identificados y con los certificados respectivos.. DE. 2. MÉTODO:. TE. CA. 2.1. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO:. IO. 2.1.1. MÉTODO ANALÍTICO POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE. BI BL. ALTA EFICACIA (HPLC) 6:. 2.1.1.1.. CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS:.  Columna: Licrospher 100, RP-18,125 x 4 mm.  Detección: 254 nm.  Equipo: HPLC Hewlett Packard Serie 1200 DAD.  Fase Móvil: Solución Ácido Acético 0.02M.  Flujo: 1.5 mL/minuto.  Temperatura: 40 º C. - 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  Tiempo de corrida: Aproximadamente 7,0 minutos.  Volumen de inyección: 20 uL. 2.1.1.2.. PREPARACIÓN DE LA FASE MOVIL: SOLUCIÓN DE ÁCIDO ACÉTICO 0,02 M: Se midió 0,71 mL de Ácido Acético y se llevó a un matráz aforado de 1000 mL, se enrasó con agua destilada. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES DE TRABAJO:. IC A. 2.1.1.3.. UI M. ESTÁNDAR DE RESOLUCIÓN:. Q. Se pesó exactamente 25 mg de Guanina estándar USP y se. BI. O. transfirió a un matráz aforado de 250 mL, se disolvió y enrasó con. Y. Hidróxido de Sodio 0,1N. En otro matráz aforado de 250 mL se. AC. IA. pesó exactamente 26,5 mg de Aciclovir estándar. Se disolvió con. RM. 20 mL de Hidróxido de Sodio 0,1N y se llevó a ultrasonido por 10. FA. minutos, se retiró, enfrió y adicionó 5 mL de la solución de. DE. Guanina antes preparada y se completó a volumen con agua. CA. destilada. Se homogenizó y filtró por membrana de 0,45 µm antes. IO. TE. de inyectar.. BI BL. Se consideró como parámetro de aptitud que la resolución entre la Guanina y el Aciclovir no debió ser menor de 2 y la desviación. estándar relativa (DSR) para inyecciones repetidas para el pico de Aciclovir no debió ser más del 2%. Orden de elusión: 1er pico: Guanina. 2do pico: Aciclovir.. - 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PREPARACIÓN DEL ESTÁNDAR SECUNDARIO: En un matráz aforado de 250 mL se pesó aproximadamente 26,5 mg de Aciclovir estándar. Se disolvió con 20 mL de Hidróxido de Sodio 0,1N y llevó al ultrasonido por 10 minutos. Se retiró y enfrió. Se completó a volumen con agua destilada. Concentración teórica:. 0,1 mg/mL.. IC A. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PROBLEMA:. UI M. Se trituró a polvo fino 10 tabletas; en un matráz aforado de 200 20 mg de. Q. mL, se pesó aproximadamente el equivalente a. BI. O. Aciclovir (51 mg de polvo aproximadamente). Se adicionó 20 mL. Y. de Hidróxido de Sodio 0,1N y llevó al ultrasonido por 10 minutos. AC. IA. Se retiró y enfrió. Se completó a volumen con agua destilada, se. RM. homogenizó y llevó a agitación magnética por 20 minutos. Se. FA. filtró a través de membrana de 0,45 µm y se inyectó.. CÁLCULOS:. CA. 2.1.1.4.. DE. Concentración teórica: 0,1 mg/mL.. IO. TE. Se determinó el contenido de Aciclovir % aplicando la siguiente. BI BL. fórmula: X . Amp Wstd Pot .std 200 100 x x x x Astd 250 100 Wmp 200. Donde: X: Contenido porcentual de Aciclovir por tableta. Pot.std: Potencia del estándar en % Amp: Área cromatográfica de Aciclovir en la muestra. Wmp : Peso de muestra problema en mg. Astd: Área cromatográfica de Aciclovir en estándar. - 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Wstd: Peso del estándar en mg. 200: Contenido teórico por tableta.. 2.1.2. PARÁMETROS DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO: Siendo el método analítico del tipo de determinación cuantitativa del principio activo en el producto terminado clasificado como método de. UI M. parámetros de validación y sus especificaciones:. IC A. Categoría I, en la USP 30- NF 25, se consideraron los siguientes. Q. 2.1.2.1. ESTUDIO DE LA SELECTIVIDAD Y ESPECIFICIDAD:. BI. O. ESPECIFICACIÓN: 98% - 102% de ausencia de interferencia. Y. debido a excipientes y/o impurezas.. AC. IA. Este parámetro se determinó mediante el estudio de las placebo en el. RM. interferencias que pudieron presentarse en el. FA. análisis normal de la muestra.. DE. PREPARACIÓN DE PLACEBO:. CA. Producción preparó el placebo de Aciclovir 200 mg tabletas.. IO. TE. Luego se pesó aproximadamente 31 mg de placebo, se transfirió. BI BL. a un matráz aforado de 200 mL, se sometió al mismo tratamiento según método analítico indicado en el ítem 2.1.1. Se consideró como criterio que no hubiera presencia de otros picos de absorbancia en el tiempo de retención. y en las. condiciones de integración correspondientes a Aciclovir.. - 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PREPARACIÓN DEL PLACEBO MÁS LA ADICIÓN DE ANALITO: Se pesó 20 mg. de Aciclovir y 31 mg. de placebo, se transfirió a un matráz aforado de 200mL y se añadió 20 mL de Hidróxido de Sodio 0,1N. Se sonicó por 10 minutos, retiró y enfrió. Se completó a volumen con agua destilada. Se llevó a agitación. UI M. través de membrana de 0,45 µm e inyectó.. IC A. magnética por 20 minutos y se homogenizó. Luego se filtró a. Q. PREPARACIÓN DEL ANALITO SOLO:. BI. O. Se prepararon tres muestras de analito puro en concentración. Y. similar a las anteriores y se analizó de acuerdo al método. AC. IA. analítico.. Fstd . Wstd Pot .std x 250 100. DE. FA. RM. CÁLCULO DEL FACTOR ESTÁNDAR:. CA. Donde:. TE. F std: Factor de estándar.. BI BL. IO. Wstd: Peso del estándar. Pot.std.: Potencia del estándar. CÁLCULO DE LA CANTIDAD DE MUESTRA RECUPERADA (CMR): CMR . 200 100 x x100 Wpa Pot .std. Donde: Pot. std: Potencia del estándar. W p.a:. Peso del principio activo. - 14 -. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. % Re cuperacion . Cant. Re cup (mg ) x100 Cant. Agregado(mg ). La especificidad fue expresada como porcentaje de recuperación (98% - 102%). TRATAMIENTO POR CALOR, LUZ, HIDRÓLISIS ÁCIDA, HIDRÓLISIS BÁSICA:. IC A.  PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS: Se sometió la. UI M. muestra al tratamiento por calor durante 07 días a 80º C y se procedió a análisis según metodología analítica. En el caso de. y se procedió a análisis según. Y. tratamiento por 7 días. BI. O. Q. la muestra sometida a exposición de luz artificial, se sometió a. AC. IA. metodología analítica. Para el caso de la muestra tratada por. RM. hidrólisis ácida se sometió la muestra a tratamiento con HCl. FA. 1,0 N durante 30 minutos, luego se neutralizó con NaOH 1,0. DE. N y se prosiguió al análisis según metodología analítica. En el. CA. caso de la muestra tratada por hidrólisis básica se sometió la. BI BL. IO. TE. muestra a tratamiento con NaOH 1,0 N durante 30 minutos, luego se neutralizó con HCL 1,0 N y se prosiguió al análisis según metodología analítica. Se reportaron los resultados obtenidos como contenido en cada caso..  PREPARACIÓN DE PLACEBO: Producción preparó el placebo de Aciclovir 200 mg tabletas. Se pesó 31 mg de placebo luego se transfirió a un matráz aforado de 200 mL, se sometió al mismo tratamiento según método analítico y a las condiciones de estrés a las que se sometió la muestra.. - 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se consideró como criterio, que no debió observarse picos de absorbancia en el tiempo de retención y en las condiciones de integración correspondiente a Aciclovir.. 2.1.2.2. ESTUDIO DE LA LINEALIDAD: ESPECIFICACIONES:. IC A.  Expresión de la recta lineal y = b x + a. UI M.  Coeficiente de correlación r mayor de 0,990.. Q.  Coeficiente de determinación r2 mayor de 0,999.. BI. O.  Coeficiente de variación de los factores de respuesta deben. Y. ser menor de 5%.. AC. IA.  Intercepto “a”, valor cercano a cero.. RM. La linealidad se estudió desde dos puntos de vista:. FA.  Linealidad del Sistema: Evaluó equipo y analista.. DE.  Linealidad del Método: Evaluó el desarrollo del método en sí. CA. y la influencia de la matriz en el proceso de extracción de la. IO. TE. muestra.. BI BL. LINEALIDAD DEL SISTEMA: Se prepararon cinco soluciones de estándar de referencia en las concentraciones de 50 %, 75 %, 100 %, 125 % y 150 % en torno a la concentración teórica de cuantificación del principio activo en la muestra. Se prepararon por triplicado. Los pesos empleados fueron los siguientes: Estándar 50 %: Se pesaron 13,79 mg; 13,58 mg y 13,82 mg de estándar separadamente en un matráz aforado de 250 mL y se. - 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. prosiguió según el método analítico. Concentración aproximada 0,050 mg/mL. Estándar 75 %: Se pesaron 20,30 mg; 20,04 mg y 20,34 mg de estándar separadamente en un matráz aforado de 250 mL y se prosiguió según el método analítico. Concentración aproximada 0,075 mg/mL.. IC A. Estándar 100 %: Se pesaron 27,01 mg; 26,89 mg y 27,04 mg. UI M. de estándar separadamente en un matráz aforado de 250 mL y se. Q. prosiguió según el método analítico. Concentración aproximada. BI. O. 0,100 mg/mL.. Y. Estándar 125 %: Se pesaron 33,39 mg; 33,48 mg y 33,44 mg. AC. IA. de estándar separadamente en un matráz aforado de 250 mL y se. RM. prosiguió según el método analítico. Concentración aproximada. FA. 0,120 mg/mL.. DE. Estándar 150 %: Se pesaron 40,09 mg; 39,95 mg y 40,00 mg. CA. de estándar separadamente en un matráz aforado de 250 mL y se. IO. TE. prosiguió según el método analítico. Concentración aproximada. BI BL. 0,16 mg/mL. Con los datos obtenidos se preparó una curva de calibración relacionando concentraciones (mg/mL) con las respuestas (áreas). LINEALIDAD DEL MÉTODO: El estudio de la linealidad del método se hizo por adición de analito al placebo. El placebo fue preparado por el área de producción siguiendo el proceso de fabricación del producto. Se. - 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. pesó estándar en concentraciones de 80 %, 100 % y 120 % en torno a la concentración final del principio activo en la muestra y se adicionó placebo en cantidad proporcional a la concentración del estándar, se realizó por triplicado. Muestra 80 %: Se pesaron 16,001 mg; 16,189 mg y 16,048 mg de analito. y 35. mg de placebo aproximadamente; se. IC A. transfirieron a matraces aforados de 200 mL y se continúo según. UI M. el método analítico.. Q. Muestra 100 %: Se pesaron 19,953 mg; 19,859 mg y 19,896. BI. O. mg de analito y aproximadamente 31 mg de placebo; se. AC. el método analítico.. IA. Y. transfirieron a matraces aforados de 200 mL y se continúo según. RM. Muestra 120 %: Se pesaron 23,819 mg; 23,697 mg y 23,744. FA. mg del analito y aproximadamente 27 mg de placebo; se. DE. transfirieron a matraces aforados de 200 mL y se continúo según. CA. el método analítico.. IO. TE. Con los datos obtenidos se preparó una curva de calibración. BI BL. relacionando concentraciones (mg/mL) con respuestas (áreas).. 2.1.2.2. ESTUDIO DE LA EXACTITUD: ESPECIFICACIÓN: Porcentaje de recuperación: 98%. -. 102%.. - 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PREPARACIÓN DEL ESTÁNDAR: Se pesaron estándares por triplicado en un aproximado de 27 mg de Aciclovir en matraces aforados de 250 mL. Los pesos fueron los siguientes: St1: 27,01 mg; St2: 26,89 mg y St3: 27,04 mg. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: Se trabajó con las muestras preparadas para determinar la. IC A. linealidad del método.. UI M. CÁLCULOS:. Q. Se determinó el porcentaje de recuperación para cada. BI. O. concentración, el porcentaje de recuperación global y el. Y. coeficiente de variación del porcentaje de recuperación global.. AC. IA. Se realizaron los cálculos correspondientes para determinar la. FA % Analito . WstdxPot .st 250 x100. CA. DE. fórmulas:. RM. cantidad de analito recuperado en cada muestra por las. TE. Donde:. BI BL. IO. F std: Factor de Standard.. Wstd: Peso del estándar. Pot.std.: Potencia del estándar Cantidad de muestra recuperada (CMR):. CMR . AmpxFstx 200 x100 AstdxWmpx 200. Porcentaje de recuperación (R %):. R% . Cantidad .encontrada x100 Cantidad .agregada. - 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.1.2.3. ESTUDIO DE LA PRECISIÓN: ESPECIFICACIÓN:  Coeficiente de variación de Repetibilidad: Menor de 1,5%.  Precisión Intermedia: Desviación estándar relativa menor a 2%. 2.1.2.3.1. REPETIBILIDAD:. IC A. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:. UI M. Se pesó el equivalente a 20 mg de Aciclovir. Q. (aproximadamente 51 mg de muestra) y se transfirió a un. BI. O. matráz aforado de 200 mL. Se prosiguió según el método. IA. Y. analítico. Se prepararon 6 muestras.. AC. PREPARACIÓN DEL ESTÁNDAR:. RM. El estándar se trabajó en las mismas condiciones que. FA. indica el método analítico.. DE. CÁLCULOS:. BI BL. IO. TE. CA. Se determinó:  Desviación Estándar.  Coeficiente de variación o grado. de dispersión del. método estableciéndose los límites de confianza de los resultados individuales y de los resultados promedios con un grado de confianza de 95% y n - 1 grado de libertad.  Se. realizan. determinar. los. cálculos. correspondientes. para. la cantidad de analito (principio activo). presente en el producto.. - 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  Cálculo del factor estándar:. FSt . WStdxPot .st 250 x100.  Cálculo del factor de muestra:. FMp . 200 xPPtabx100 Wmpx200. IC A.  Cálculo del contenido por muestra:. Q. UI M. CCM  AreaMpxFSt xFMp. BI. O.  Cálculo del límite de confianza individual:. AC. RM. Donde:. IA. Y. Lc  X  ST (n  1). FA. X: Promedio de la concentración. DE. T (n-1): 2,571 (Valor del estadístico T para n-1 grados de. CA. libertad).. BI BL. IO. TE. S: Desviación estándar..  Cálculo del límite de Confianza promedio:. LC  X  T (n  1) x. S 6. 2.1.2.3.2 PRECISIÓN INTERMEDIA: Para el estudio de la precisión intermedia los cambios de la condiciones fueron: Tiempos diferentes, diferente analista y diferente equipo y reactivos.. - 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: Se determinó el peso promedio de 20. tabletas y. homogenizó. Se pesó el equivalente a 20 mg de Aciclovir (51 mg de peso del polvo), se transfirió a un matráz aforado de 200 mL y se trató según método analítico. Se prepararon 6 muestras.. IC A. PREPARACIÓN DEL ESTÁNDAR:. UI M. El estándar se trabajó en las mismas condiciones que. Q. indica el método.. BI. O. CÁLCULOS: Se determinó:. Y.  Desviación estándar.. AC. IA.  Coeficiente de variación.. RM.  Se realizaron los cálculos correspondientes para. FA. determinar. la cantidad de analito (principio activo). DE. presente en el producto.. BI BL. IO. TE. CA.  Cálculo del factor estándar:. FSt . WStdxPot .st 250 x100.  Cálculo del factor de muestra:. FMp . 200 xPPtabx100 Wmpx200.  Cálculo del contenido por muestra: CCM  AreaMpxFSt xFMp. - 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.1.2.4. ESTUDIO DE LA ROBUSTEZ: ESPECIFICACIÓN: Desviación estándar relativa menor a 2%. Para el estudio de la robustez, los factores que se evaluaron fueron los siguientes:  Análisis después de un día de preparada la muestra.  Cambio en el flujo de análisis de 1,5 a 2,0 mL/min.. IC A.  Cambio de temperatura en la columna de 40º C a 30ºC.. UI M. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:. Q. Se trabajó con las mismas muestras del estudio de. BI. O. repetibilidad, por duplicado y siguiendo el método. IA. Y. analítico.. AC. CÁLCULOS:. FSt . WStdxPot .st 250 x100. DE. FA. RM.  Cálculo del factor estándar:. BI BL. IO. TE. CA.  Cálculo del factor de muestra:. FMp . 200 xPPtabx100 Wmpx200.  Cálculo del Contenido por muestra: CCM  AreaMpxFSt xFMp.  Se determinó: El coeficiente de variación del método (menor a 2%), el coeficiente de variación entre el resultado del estudio de robustez y el resultado del estudio de repetibilidad (menor a 2%).. - 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.1.2.5. ESTUDIO DEL LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN: Se efectuó el cálculo de las variables en el estudio de linealidad del sistema y se tomó en cuenta la respuesta del placebo en el análisis cuantitativo. Tomando dichos valores se calculó es límite de cuantificación utilizando la fórmula siguiente:. IC A. Ybl  10( Sbl ) Bx n. UI M. LC  Donde:. O. Q. Ybl: Ruido de fondo o background del sistema.. Y. BI. Sbl: Desviación estándar de la señal del placebo.. AC. IA. b: Pendiente de la curva de calibración.. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. n: Número de determinaciones (15).. - 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III. RESULTADOS: Cuadro Nº 1: Criterios de aceptación, resultados cuantitativos y estadísticos para cada parámetro de desempeño: CRITERIO Ausente. RESULTADO Conforme. 98 % - 102 %. 100,201 %. Sin interferencia. 94,551 %. Sin interferencia. 97,854%. Muestra sometida a hidrólisis ácida con HCL 1,0 N.. Sin interferencia. 69,267%. Muestra sometida a hidrólisis básica con NaOH 1,0 N.. Sin interferencia. 96,766%. IC. A. DATO EVALUADO Ausencia de interferencia del placebo. M. PARÁMETRO DE DESEMPEÑO. UI. Porcentaje de recuperación. Q. Muestra sometida a exposición luz artificial por 7 días.. BI. O. SELECTIVIDAD Y ESPECIFICIDAD. FA RM. AC IA. Y. Muestra sometida a calor por 7 días a 80 º C.. BI B. LI O. TE CA. DE. Coeficiente de correlación (r) > de 0,990 0,99996 Coeficiente de determinación (r2) > de 0,999 0,9999 Coeficiente de Variación de f (y/x) (*) < a 5% 0,388% Linealidad de sistema Prueba T-Student Texp> Ttab 360,541 > 2,16 LINEALIDAD Intervalo de Confianza de b (*) Texp>Ttab 18,351> 2,16 Intervalo de Confianza de a (*) Debe incluir el cero -301,44 a 306,09 Coeficiente de correlación (r) > de 0,990 0,99986 Coeficiente de determinación (r2) > de 0,999 0,9997 Linealidad del método Coeficiente de Variación de f (y/x) < a 5% 0,305% Prueba T-Student Texp> Ttab 152,733 > 2,16 Intervalo de Confianza de b (*) Texp>Ttab 543153,9 > 2,365 Intervalo de Confianza de a (*) Debe incluir el cero -339,80 a 310,55 (*) Leyenda: CV: Coeficiente de Variación; A1: Analista 1; A2: Analista 2; a: Intercepto; b: Pendiente; f (y/x): Factor de respuesta.. - 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PARÁMETRO DE DESEMPEÑO. DATO EVALUADO. RESULTADO. Gexp< G tab. 0,622 < 0,8709. 98 % - 102 %. 99,922 %. Texp< Ttab. 0,766 < 2,306. 90%-110%. 96,0166%. <a2%. 0,586%. Coeficiente de variación CV (*). < a 1,5%. 0,610 %. ---. 191,782 - 192,284 mg. 90%-110%. 96,1375%. <a2%. 0,178%. Muestra después de un día de preparada. CV < 2 %. 0,167 %. Cambio de flujo de la fase móvil. CV < 2 %. 0,430 %. CV < 2 %. 0,299 %. ---. 2,3 µg/mL.. IC. A. CRITERIO. FA RM. Cuadro Nº 1: Criterios de aceptación, resultados cuantitativos y estadísticos para cada parámetro de desempeño (CONTINUACION):. EXACTITUD. M. Prueba de Cochran. Q. UI. % de Recuperación. BI. O. Prueba t de Student. AC IA. Desviación estándar. Y. Promedio. REPETIBILIDAD. Límite de Confianza Promedio. DE. Promedio (A1+A2) (*) PRESICION INTERMEDIA. TE CA. Desviación Estándar Relativa. LI O. ROBUSTEZ. BI B. Cambio de temperatura de 30 º C a 40 º C.. LIMITE DE CUANTIFICACION. Límite de Cuantificación. (*) Leyenda: CV: Coeficiente de Variación; A1: Analista 1; A2: Analista 2; a: Intercepto; b: Pendiente; f (y/x): Factor de respuesta.. - 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. LINEALIDAD DEL SISTEMA A IC M UI Q. 2. R = 0,9999. O. 2500,0000. AC IA. 2000,0000. FA RM. 1500,0000 1000,0000. 150 % 125 %. BI. 3000,0000. y = 24171x + 2,3276. Y. 3500,0000. 100 %. 75%. 50%. DE. 500,0000. TE CA. AREA (RESPUESTA). 4000,0000. BI B. LI O. 0,0000 0,000000 0,020000 0,040000 0,060000 0,080000 0,100000 0,120000 0,140000 0,160000 CONCENTRACIÓN (mg/mL). Gráfico Nº 1: Linealidad del sistema, ecuación de la curva de calibración. - 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. :. 2000,00000. A M Q. UI. 1000,00000. 100 % 80 %. TE CA. DE. 500,00000. 0,020000 BI B. 0,00000 0,000000. O. FA RM. 1500,00000. 120 %. BI. y = 30524x - 14,623 R2 = 0,9997. Y. 2500,00000. AC IA. 3000,00000. IC. 3500,00000. LI O. AREA (RESPUESTA). LINEALIDAD DEL METODO. 0,040000. 0,060000. 0,080000. 0,100000. 0,120000. CONCENTRACION (mg/mL). Gráfico Nº 2: Linealidad de método, ecuación de la curva de calibración. - 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV. DISCUSIÓN: Para el desarrollo de la validación del método de valoración de Aciclovir 200 mg tableta, se verificó la aptitud del sistema determinando la resolución entre el pico de Aciclovir y del estándar interno (Guanina USP), siendo éste conforme, con un resultado de: 3,5 y se determinó también la desviación estándar relativa de inyecciones repetidas, siendo de: 0,212% (menor a 2%), lo cual también es. IC A. conforme. La conformidad de la prueba de aptitud del sistema, nos indica que el. UI M. sistema (analista, reactivos e instrumental) es adecuado para llevar a cabo la. Q. determinación para la que se ha establecido y validado el método, proporciona la. BI. O. seguridad de que en el momento de iniciar el ensayo, el conjunto del sistema. Y. continuará siendo válido para el propósito para el que ha sido concebido 1.. AC. IA. La selectividad fue evaluada por el estudio de las interferencias que pudieran. RM. presentarse en el placebo durante el análisis de las muestras, y se ha determinado. FA. que los componentes de la matriz no interfieren en la determinación del principio. CA. de Aciclovir 16.. DE. activo, pues no hubo señal cromatográfica del placebo en el tiempo de retención. IO. TE. Debido a que pudieran encontrase otras sustancias que interfieran en el análisis. BI BL. (impurezas y productos de degradación), las muestras fueron sometidas a condiciones de estrés en las que se lograría por lo menos un 10 % de degradación de la muestra y así se verificó que dichas sustancias no interfieren en el análisis. Tras el análisis de las muestras sometidas a calor (80 º C por 7 días), luz artificial (por 7 días), hidrólisis ácida (con HCL 1,0 N por 30 minutos) e hidrólisis básica (con NaOH 1,0 N por 30 minutos) se obtuvo los siguientes resultados: 94,551 %; 97,854%; 69,267% y 96,766%, respectivamente; lo que muestra que la señal corresponde a Aciclovir y que los porcentajes varía debido a la condición de. - 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. estrés, los placebos sometidos a las mismas condiciones no mostraron señal en el tiempo de retención de aciclovir, dando porcentajes de 0% en todos los casos, lo que determina la selectividad del método 1. La especificidad se evaluó en función del porcentaje de recuperación, y se obtuvo un 100,201 % (98% - 102%), resultado que da la conformidad para este parámetro de desempeño. El estudio de la linealidad se llevó a cabo por medio de la evaluación de la. IC A. linealidad del sistema y el estudio de la linealidad del método. La primera evaluó. UI M. el equipo y el analista; y la segunda, el desarrollo del método en sí. En ambos. Q. casos se determinaron los coeficientes de correlación (r) y de determinación (r2).. BI. O. Para la linealidad del sistema se obtuvo un valor de r de 0,99996 (mayor a 0,990),. Y. lo que indica que existe correlación lineal entre la variable “x” (concentración) y. AC. IA. la variable “y” (respuesta) con una probabilidad elevada (nivel de confianza del. RM. 95%). El valor de r2 fue de 0,9999 que tiene mayor significación estadística ya. FA. que expresa la proporción de la variación total de la respuesta explicada por el. DE. método y este valor también es conforme (mayor de 0,9990). Por lo que se. CA. confirma la linealidad en el rango de concentraciones estudiado (50%-150%).. IO. TE. Para verificar la linealidad del sistema se aplicó la prueba de regresión T-Student. BI BL. dando un valor de t experimental de 360,541, mayor al t tabulado (2,16; para un nivel de confianza de 95% y n-2 grados de libertad), lo que confirma que existe correlación lineal significativa entre “x” y “y”. Además de ello se evaluó el coeficiente de variación para los factores de respuesta, siendo de 0,388% (menor de 5%) lo que indica también la relación entre la concentración y la respuesta 1,2,7,10.. Los restantes aspectos considerados en el estudio de la linealidad también. cumplen con los criterios establecidos, según se observa en el cuadro Nº 1: La verificación de la pendiente (b) mostró un valor de T experimental mayor al T. - 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. tabulado (18,351> 2,16), y el intervalo de confianza (30523,85 a 30524,11) no incluye el cero. Este resultado indica la sensibilidad de la calibración y/o del método, relaciona la aleatoriedad de la respuesta con la aleatoriedad debida a la variación de la concentración. La verificación del término independiente (a) se relaciona con la presencia de interferencias o errores sistemáticos, presenta un T experimental menor al T tabulado (0,017 < 2,16), y un intervalo de confianza (-. IC A. 301,44 a 306,09) que incluye el cero, lo cual es conforme y cumple el requisito de. UI M. proporcionalidad 2.. Q. El mismo análisis estadístico se realizó en la evaluación de la linealidad del. BI. O. método, y se obtuvieron los resultados siguientes: r de 0,99986; r2 de 0,9997; t. Y. experimental de 152,733 y un coeficiente de correlación para los factores de. AC. IA. respuesta de 0,305%, dando así la conformidad a este parámetro de desempeño. RM. para el rango estudiado (80%-120%). Las pruebas de verificación de la linealidad. 1,2,7,10,12,20.. El método analítico responde linealmente a las. DE. cuadro Nº 1. FA. del método también cumplen con los criterios establecidos y se especifican en el. TE IO. 1 y Nº 2.. CA. concentraciones en las cuales se trabajó, tal como se observa en los gráficos Nº. BI BL. Para el estudio de la precisión se ha evaluado la repetibilidad, analizando las muestras en las mismas condiciones operativas y se obtuvo un coeficiente de variación de 0,610% (menor de 1,5%) que expresa el error aleatorio que se corresponde con la dispersión de los datos alrededor del promedio (96,017%) lo que demuestra que la variabilidad en el instrumento y en el proceso de preparación de la muestra es conforme en el límite de confianza promedio (191,782 a 192,284). De acuerdo a las teorías de Hortwitz, se reportan tablas que establecen el coeficiente de variación máximo aceptable de un método analítico. - 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. en función del porcentaje de analito en la muestra, por ello se escogió un CV del 2 % para el presente estudio 2. La precisión intermedia se evaluó efectuando el análisis en las mismas muestras pero en condiciones operativas diferentes (diferente analista, diferente equipo y reactivos) obteniéndose un coeficiente de variación de 0,178% (menor a 2%), lo que demuestra que la variabilidad del método aportada por el conjunto de factores. IC A. modificados, cumple la especificación 1,7,10.. UI M. Del estudio de la exactitud se pudo determinar en primer lugar, que el factor. Q. concentración no influyó en la variabilidad de los resultados, pues mediante el. BI. O. Test de Cochran se determinó un valor G experimental menor al valor G tabulado. Y. (0,622 < 0,8709) para una probabilidad de 0,05. El porcentaje de recuperación. AC. IA. obtenido fue de 99,922 % (98% - 102%). Este promedio no presenta diferencia. RM. estadísticamente significativa con el 100% (T experimental < T tabulado, con un. FA. 95% de confianza) y por lo tanto la exactitud es correcta. Si bien el porcentaje de. DE. recuperación es bueno, no siempre se obtienen valores cercanos al 100% por lo. CA. que con este resultado se confirma la efectividad del método de preparación 1,9,11.. IO. TE. A diferencia de la precisión, que refleja el error aleatorio, la exactitud refleja el. BI BL. error sistemático o la tendencia a él. Para asegurar una buena exactitud es necesario eliminar los errores que no están sujetos a tratamiento estadístico (calibración o control incorrecto de equipos), los errores inherentes a blancos (errores constantes), y los que dependen de la cantidad de analito presente (errores proporcionales) 2. El estudio de la robustez arrojó un coeficiente de variación de 0,167%; 0,430% y 0,299%, para la muestra analizada después de un día de preparación, la muestra en la que cambió el flujo de la fase móvil y la muestra en la que se cambió la. - 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. temperatura de análisis, respectivamente; siendo todos conformes (menor a 2%). Estos resultados confirmarían la fiabilidad o “estabilidad” del método durante su empleo en rutina; ya que demuestran que el análisis seguirá proporcionando resultados válidos en presencia de variaciones pequeñas y deliberadas, susceptibles de producirse durante la utilización del método. Si no se estudiara la robustez, se pudiera validar un método poco robusto con los consiguientes malos. IC A. resultados y perdida de tiempo y dinero 1.. UI M. Finalmente se estudió el límite de detección, obteniéndose un resultado de 2,3. Q. µg/mL, lo que significa que ese valor es la menor cantidad posible de principio. BI. O. activo que puede cuantificarse en Aciclovir 200 mg tabletas utilizando el método. Y. analítico de valoración ya descrito. La importancia de determinar el límite de. AC. IA. cuantificación radica en que cada vez es más frecuente y necesaria la. RM. cuantificación de sustancias relacionadas o impurezas de una especialidad. FA. farmacéutica. Sólo conociendo las limitaciones del método se puede garantizar. DE. que es válido para evaluar el contenido en productos de degradación de una. BI BL. IO. TE. CA. especialidad, lo que a su vez permite controlar su estabilidad.. - 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V. CONCLUSIONES:. De acuerdo a los resultados obtenidos se concluye lo siguiente:. 1. Todos los parámetros de desempeño cumplen con las especificaciones establecidas y el método es apto para la cuantificación de Aciclovir.. IC A. 2. No se observan interferencias en el análisis de las muestra por tanto el método es. El método analítico es lineal en el rango de concentraciones estudiado (50% a. Q. 3.. UI M. selectivo y específico.. BI. O. 150%) con adecuada precisión y exactitud.. Y. 4. El método es exacto con un nivel de confianza de 95%, ya que no existe. AC. IA. diferencia significativa entre la recuperación media y el 100%.. RM. 5. El método analítico es preciso en base a los resultados de repetibilidad y. FA. precisión intermedia.. DE. 6. El método analítico es robusto ya que se obtienen resultados reproducibles. CA. efectuando algunos cambios o ajustes en la metodología y no se observó. IO. TE. diferencias significativas en los resultados.. BI BL. 7. El límite de cuantificación del método analítico fue de 2,3 µg/mL.. Por lo tanto el método de valoración por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) empleado para la cuantificación de Aciclovir en tabletas de Aciclovir 200 mg, cumple con los parámetros de desempeño establecidos y por ende la técnica está validada.. - 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.