Validación del método analítico espectrofotométrico UV/VIS para la cuantificación de alprazolam 0,5 mg en comprimidos

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. IC. A. ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. O. Q. UI. M. TESIS I. Y. BI. “Validación del método analítico espectrofotométrico. AUTORES:. CA. DE. FA. RM. AC I. A. UV/VIS para la cuantificación de alprazolam 0,5 mg en comprimidos”. TOCAS BRINGAS, Kevin Franklin. BI. BL. IO. TE. TARRILLO PERALTA, Lizbeth Katarini. ASESOR: DR. ALVA PLASENCIA, Pedro Marcelo. TRUJILLO – PERÚ 2017. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIAS. A Dios. Por regalarme la vida, la salud y haberme dado una familia hermosa, por lo bueno que. A. tengo hoy y por lo que está por venir, pero. UI. M. IC. sobre todo por estar siempre a mi lado.. BI. O. Q. A mis padres. Y. Porque en todo momento han apoyado y. AC I. A. respetado mis decisiones. Por el impulso. RM. que me brindaron en los momentos más. FA. difíciles de mi vida. Por ayudarme a vencer. DE. cualquier obstáculo. Por educarme y. TE. CA. convertirme en una persona de bien.. BL. IO. A mi familia y amigos. BI. Por estar siempre conmigo, por sus buenos consejos y aliento en momentos de tristeza. A mis hermanos por acompañarme en cada momento de mi vida y ser un gran apoyo para mi bienestar espiritual.. Lizbeth I Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A mis padres: A ellos, por toda su dedicación, amor y. IC. A. confianza.. UI. M. A mi familia. O. Q. Por brindarme todo su apoyo, amor y. Y. BI. compresión. Además de compartir conmigo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC I. A. todos mis logros y metas.. Kevin. II Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO. A la Universidad Nacional de Trujillo, por habernos permitido desarrollarnos intelectualmente en sus aulas, logrando de este modo cumplir con una de las más anheladas metas de nuestra vida, ser profesionales.. A. A la Facultad de Farmacia y Bioquímica, por habernos facilitado los materiales. M. IC. empleados en esta investigación, así como al laboratorio de Tecnología Farmacéutica,. O. Q. UI. por permitir el desarrollo y ejecución de la presente investigación.. Y. BI. A nuestros amigos(as) y a las personas que siempre nos brindaron apoyo en todo. AC I. A. momento.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. Nuestra gratitud y reconocimiento por siempre.. Lizbeth y Kevin. III Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Nuestro especial agradecimiento al Dr. Pedro Marcelo Alva Plasencia. Agradecemos de manera muy especial y sincera a nuestro profesor por la oportunidad de desarrollar la presente investigación bajo su tutoría, por su apoyo y confianza en. A. nuestro trabajo y su capacidad para guiar nuestras ideas ha sido un aporte invaluable, no. M. IC. solamente en el desarrollo de la tesis, sino también en nuestra formación como. Q. UI. profesionales de calidad.. BI. O. Le agradecemos también el habernos facilitado siempre los medios suficientes para. A. Y. llevar a cabo todas las actividades propuestas durante el desarrollo de esta tesis.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC I. Agradecemos por permitirnos culminar con responsabilidad y éxito nuestro trabajo.. Lizbeth y Kevin IV Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. Señores Miembros de Jurado Dictaminador: Dando cumplimiento establecido por el reglamento de trabajos de investigación de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, sometemos a vuestra consideración y elevado criterio profesional el presente Informe de Investigac ió n. UI. M. IC. A. tipo I titulado:. O. Q. “Validación del método analítico espectrofotométrico. AC I. A. Y. BI. UV/VIS para la cuantificación de alprazolam 0,5 mg en comprimidos ”. RM. Es propicia la oportunidad para manifestar nuestro más sincero reconocimiento y. FA. gratitud a la plana docente y administrativa que con su capacidad y buena voluntad han. DE. contribuido en nuestra formación profesional.. CA. Dejamos a vuestra consideración señores miembros del jurado la calificación del. BI. BL. IO. TE. presente trabajo de investigación científica.. Trujillo, septiembre del 2017. Tarrillo Peralta Lizbeth Katarini. Tocas Bringas Kevin Franklin. V Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UI. M. IC. A. JURADO DICTAMINADOR. DE. FA. RM. AC I. A. Y. BI. O. Q. Dr. MIRANDA LEYVA, SEGUNDO MANUEL Presidente. BI. BL. IO. TE. CA. Dr. ALVA PLASENCIA PEDRO MARCELO Miembro. Dra. MANTILLA RODRIGUEZ ANA ELENA Miembro. VI Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN El presente estudio tuvo como objetivo validar el método analítico por espectrofotometr ía UV-VIS para la cuantificación de alprazolam 0,5 mg en comprimidos, mediante la evaluación de selectividad, linealidad, exactitud y precisión. En el ensayo fue selectivo para el estándar y la muestra, así mismo no hay interferencia y el analito es inestable a degradación forzada. En el ensayo de linealidad se encontró que, para el estándar, el. IC. A. coeficiente de correlación (r) fue 0,9975 y para el método (r) fue 0,9995, y el coeficiente de. UI. M. determinación (r2 ) fue de 0,9951 y 0,999 respectivamente, demostrando la linealidad del. O. Q. método. Del mismo modo, el método demostró exactitud, no existiendo diferenc ia. Y. BI. significativa entre la recuperación promedio (98,84%). En el ensayo de precisión se evaluó. AC I. A. la precisión del sistema y método, y se encontró que el coeficiente de variación (CV) fue de. RM. 1,1844% y 1,9923% respectivamente (valor de especificación < 2) y 1,79% de precisión. FA. intermedia. Se concluye que el método analítico es especifico, lineal, exacto y preciso, y. CA. DE. aplicable para la cuantificación para la aplicación de comprimidos de Alprazolam 0,5 mg.. BI. BL. IO. TE. Palabras clave: Alprazolam, espectrofotometría UV-VIS, validación.. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. The present study aimed to validate the analytical method by UV-VIS spectrophotometr y for the quantification of alprazolam 0.5 mg in tablets, by the standard and the sample, also no interference and the analyte is unstable to forced degradation. In the linearity test it was found that, for the standard, the correlation coefficient (r) was 0.9975 and for the (r) method. IC. A. was 0.9999, and the coefficient of determination (r2) was 0.9951 and 0.999 respectively,. UI. M. demonstrating the linearity of the method. Likewise, the method showed accuracy, with no. O. Q. significant difference between the average recovery (98.84%). The precision of the system. Y. BI. and method was evaluated, and the coefficient of variation (CV) was found to be 1.1844%. AC I. A. and 1.9923% respectively (specification value <2) and 1.79% intermediate precision. It is. RM. concluded that the analytical method is specific, linear, accurate and precise, and applicable. DE. FA. for the quantification for the application of Alprazolam 0.5 mg tablets.. BI. BL. IO. TE. CA. Key words: Alprazolam, UV-VIS spectrophotometry, validation.. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. DEDICATORIAS…………………………………………………………………… I. AGRADECIMIENTO……………………………………………………………….III. A. PRESENTACION……………………………………………………………………V. UI. M. IC. JURADO DICTAMINADOR……………………………………………………….VI. BI. O. Q. RESUMEN……………………………………………………………………………i. AC I. A. Y. ABSTRACT………………………………………………………………………….ii. INTRODUCCION............................................................................................1. II.. MATERIAL Y METODO……………………………………………………8. III.. RESULTADOS………………………………………………………………29. IV.. DISCUSION…………………………………………………………………34. V.. CONCLUSION………………………………………………………………39. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS……………………………………….40. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. I.. ANEXO………………………………………………………………………………44. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC I. A. Y. BI. O. Q. UI. M. IC. A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCIÓN. Los métodos analíticos. empleados. para la determinación. cuantitativa. de. medicamentos deben generar datos reproducibles y fiables para permitir una interpretación válida de los estudios que apoyan. Es esencial emplear métodos analíticos bien caracterizados y totalmente validados para obtener resultados. A. confiables que puedan interpretarse satisfactoriamente. También es importante. M. IC. enfatizar que cada técnica analítica tiene sus propias características, que variarán de. Q. UI. analito a analito; en estos casos, puede que sea necesario desarrollar criterios de. BI. O. validación específicos para cada analito 1 .. A. Y. Los métodos analíticos validados desempeñan un papel en el logro de este objetivo.. AC I. Los resultados de la validación de métodos pueden utilizarse para juzgar la calidad,. RM. fiabilidad y consistencia de los resultados analíticos, que es parte integral de. FA. cualquier buena práctica analítica. Por lo tanto, validar un procedimiento analítico es. DE. demostrar la "Idoneidad para el fin previsto" y la intención de la medición analítica. CA. es generar datos precisos y confiables2 .. IO. TE. Lo anterior ha sido expresado claramente por la USP, en la cual manifie sta. BL. textualmente que, “la validación de un procedimiento analítico es el proceso que. BI. establece, mediante estudios en laboratorio, que las características de desempeño del procedimiento cumplen los requisitos para las aplicaciones analíticas previstas”. Las características de desempeño analítico habituales que deben considerarse en la validación de los tipos de procedimientos descritos en este documento se indican en la Tabla 13,4,5 .. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Exactitud Precisión Especificidad Límite de detección Límite de cuantificación Intervalo. IC. A. Robustez. UI. M. Tabla 1. Características analíticas típicas para la validación.. O. Q. Mediante la validación del método se determina si los parámetros de calidad. BI. satisfacen los requerimientos de una aplicación analítica concreta y objetiva. Para. A. Y. ello, se requiere experimentación y comparación con valores de referencias bien. RM. AC I. conocidos3,4 .. FA. La validación de procedimientos farmacopeicos puede involucrar algunas o todas las. DE. características analíticas típicas sugeridas que se usan en la validación de métodos,. CA. según se especifican en la Tabla 1 y se categorizan por tipo de método analítico en la. TE. tabla 2, para ello es necesario la determinación y evaluación de dichas características. BL. IO. que definen la calidad del método3,4 .. BI. La exactitud de un procedimiento analítico es la proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos mediante ese procedimiento y el valor verdadero. La exactitud de un procedimiento analítico debe establecerse en todo su intervalo. Este test evalúa la especificidad del método en la presencia de los excipientes bajo las condiciones de trabajo observadas para el análisis de un producto. Para el análisis de un producto farmacéutico la exactitud es evaluada por el análisis de una mezcla con cantidades conocidas de componentes3,4,5 .. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La precisión de un procedimiento analítico es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales. cuando se aplica el procedimie nto. repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea. La precisión de un procedimiento analítico habitualmente se expresa como la desviación estándar o la desviación estándar relativa (coeficiente de variación) de una serie de mediciones3,4,5 . Además de ello, la precisión puede ser una medida del grado de reproducibilidad o. IC. A. de repetitividad del procedimiento analítico en condiciones normales de operación.. UI. M. En este contexto, la reproducibilidad se refiere al uso del procedimiento analítico en. O. Q. diferentes laboratorios, como por ejemplo en un estudio en colaboración. La. BI. precisión intermedia (también conocida como tolerancia o fortaleza) expresa la. A. Y. variación dentro de un laboratorio, por ejemplo, en diferentes días, con diferentes. RM. AC I. analistas o con equipos diferentes dentro del mismo laboratorio 3,4,5 .. FA. Los documentos de ICH definen especificidad como la capacidad de evaluar de. DE. manera inequívoca el analito en presencia de aquellos componentes cuya presencia. CA. resulta previsible, tales como impurezas, productos de degradación y componentes. TE. de la matriz. La falta de especificidad de un procedimiento analítico individual puede. BL. IO. compensarse usando otros procedimientos analíticos complementarios. Para las. BI. pruebas que se indican a continuación, la definición anterior tiene las siguie ntes implicancias: •. Pruebas de Identificación: garantizan la identidad del analito.. •. Pruebas de Pureza: garantizan que todos los procedimientos analíticos efectuados permiten declarar con exactitud el contenido de impurezas de un analito (por ejemplo, prueba de sustancias relacionadas, límite de metales pesados, impurezas orgánicas volátiles).. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. •. Valoraciones: proporcionan un resultado exacto, que permite una declaración exacta del contenido o potencia del analito en una muestra3,4,5 .. El límite de detección es una característica de las pruebas de límite. Es la cantidad mínima de analito que puede detectarse en una muestra, aunque no necesariame nte cuantificarse, en las condiciones experimentales indicadas. Las pruebas de límite simplemente comprueban que la cantidad de analito se encuentra por encima o por. A. debajo de un nivel determinado. El límite de detección se expresa habitualme nte. UI. M. IC. como concentración de analito (p.ej., porcentaje, partes por billón) en la muestra3,4,5 .. O. Q. El límite de cuantificación es una característica de las valoraciones cuantitativas de. BI. compuestos que se encuentran en baja concentración en la matriz de una muestra,. A. Y. tales como: impurezas en fármacos a granel y productos de degradación en productos. y exactitud. RM. con precisión. aceptables en las condicio nes. FA. puede determinar. AC I. farmacéuticos terminados. Es la mínima cantidad de analito en una muestra que se. DE. experimentales indicadas. El límite de cuantificación se expresa habitualmente como. CA. concentración de analito (p.ej., porcentaje, partes por billón) en la muestra 3,4,5 .. TE. La linealidad de un procedimiento analítico es su capacidad para obtener resultados. BL. IO. de prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por medio de una. BI. transformación matemática bien definida, a la concentración de analito en muestras dentro de un intervalo dado. En esta sección, la "linealidad" se refiere a la linealidad de la relación entre la concentración y la medida de valoración3,4,5 . En algunos casos, para lograr la linealidad, puede ser necesario transformar la concentración y/o la medida. (Notar que los factores de corrección usados en el análisis de regresión pueden cambiar cuando se aplica la transformación.) Las transformaciones posibles pueden incluir el logaritmo, la raíz cuadrada, o el. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. recíproco, aunque otras transformaciones son aceptables. Si no se puede lograr la linealidad, se puede utilizar un modelo no lineal. El objetivo es obtener un modelo que describa con precisión la relación de concentración en función de la respuesta, ya sea lineal o no lineal3,4,5 . El intervalo de un procedimiento analítico es la amplitud entre las concentracio nes inferior y superior del analito (incluyendo estos niveles) en la cual se puede. IC. A. determinar al analito con un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad. UI. M. utilizando el procedimiento según se describe por escrito. El intervalo se expresa. O. Q. normalmente en las mismas unidades que los resultados de la prueba (p.ej.,. Y. BI. porcentaje, partes por millón) obtenidos mediante el procedimiento analítico 3,4,5 .. AC I. A. La robustez de un procedimiento analítico es una medida de su capacidad para no ser. RM. afectado por variaciones pequeñas, aunque deliberadas, en los parámetros del. FA. procedimiento indicados en la documentación, y provee una indicación de su aptitud. DE. durante condiciones normales de uso. La robustez puede determinarse durante la. CA. etapa de desarrollo del procedimiento analítico 3,4,5 .. IO. TE. Los requisitos de las pruebas farmacopeicas varían desde determinaciones analíticas. BL. muy rigurosas hasta evaluaciones subjetivas de atributos. Considerando esta amplia. BI. variedad, es lógico que diferentes procedimientos de prueba requieran diferentes esquemas de validación. Este capítulo cubre sólo las categorías de prueba más habituales para las que se exigen datos de validación. Estas categorías se indican a continuación: Categoría I: Procedimientos analíticos para la cuantificación de los componentes principales de fármacos a granel o ingredientes activos (incluyendo conservantes) en productos farmacéuticos terminados.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Categoría II: Procedimientos analíticos para la determinación de impurezas en fármacos a granel o productos de degradación en productos farmacéuticos terminados. Estos procedimientos incluyen análisis cuantitativos y pruebas de límite. Categoría III: Procedimientos analíticos para la determinación de las características de desempeño (p.ej. disolución, liberación de fármacos, etc.).. A. Categoría IV: Pruebas de identificación.. M. IC. Para cada categoría, se requiere diferente información analítica. En la Tabla 2 se. TABLA 2. Datos requeridos para la validación.. BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC I. A. Y. BI. O. Q. UI. indican los datos que normalmente se requieren para cada una de estas categorías 3 .. BI. Para cada categoría se necesita diferente información analítica, el método que fue objeto de estudio en el presente trabajo de investigación corresponde a la categoría I, dado que es la cuantificación de un componente principal de un producto farmacéutico3,5 . El presente trabajo de investigación incluye en su desarrollo la espectroscopia ultravioleta visible, que es una técnica espectroscópica de transición electrónica en la que la interacción entre la radiación incidente y los electrones resulta en la promoción de un estado basal a un estado de energía superior de uno o más de los 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. electrones externos o de unión. Las técnicas que se emplean frecuentemente en el análisis farmacéutico incluyen la espectroscopia de absorción atómica, en el espectro UV, en el visible y en el IR6 . Para realizar este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantida d de luz absorbida por la misma6 .. IC. A. Los benzodiacepinas (BZD) son fármacos ansiolíticos, hipnóticos y relajantes. UI. M. musculares, que se incluyen todavía entre los más utilizados en el mundo occidental.. O. Q. Los primeros benzodiacepinas (BZD) desarrolladas en los años sesenta se utilizaro n. A. Actualmente están comercializadas varias decenas para el. AC I. ácido barbitúrico.. Y. BI. como fármacos de acción tranquilizantes y ansiolítica, relegando a los derivados del. RM. tratamiento para la ansiedad generalizada las crisis de pánicos, la depresión, algunas. FA. formas de epilepsias, trastornos del sueño, los espasmos musculares y como. DE. anestésicos. En general, no están exentas de efectos secundarios, como la producción de. CA. de fatiga, de interacciones adversas con el etanol y, fundamentalmente,. PROBLEMA:. BL. II.. IO. TE. dependencia física6,7,8,9 .. BI. ¿Cumple el método analítico espectrofotométrico UV/VIS para la cuantificación de alprazolam 0,5 mg en comprimidos, con los parámetros de validación establecidos? III.. OBJETIVOS:. OBJETIVO GENERAL ➢ Validar el método analítico. por espectrofotometría. UV/VIS para la. cuantificación de alprazolam 0,5 mg en comprimidos.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. OBJETIVOS ESPECIFICOS: ➢ Determinar los parámetros para la validación del sistema: selectividad, linealidad, exactitud, precisión para la cuantificación de alprazolam tableta 0,5 mg en comprimidos por espectrofotometría UV/VIS. ➢ Verificar si los parámetros de validación. cumplen con los criterios. IC. MATERIAL Y MÉTODO. Q. UI. M. IV.. A. establecidos en guías originales.. Y. 1.1 MATERIAL DE ESTUDIO:. BI. O. 1. MATERIAL. AC I. A. ➢ ALPAX® COMPRIMIDOS 0,5 mg de Laboratorio. RM. Farmindustria.. FA. 1.2 MATERIAL QUÍMICO. DE. ➢ Alprazolam de estándar de referencia secundaria. CA. ➢ Ácido clorhídrico grado ACS.. BI. BL. IO. TE. ➢ Peróxido de Hidrogeno 30 % v/v grado ACS. ➢ Hidróxido de sodio grado ACS. ➢ Agua destilada ultra pura.. 1.3 MATERIAL DE LABORATORIO ➢ Vasos de Precipitación 50 mL, 100 mL. ➢ Pipetas 1 mL, 2 mL, 5 mL ➢ Mortero y pilon de porcelana ➢ Matraces aforados 50 mL.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ➢ Espátulas ➢ Pizetas 1.4 EQUIPOS DE LABORATORIO ➢ Baño de Ultrasonido BRANSON 1510 ➢ Balanza analítica METTLER TOLEDO. Modelo: AB2004. ➢ Espectrofotómetro PERKIN ELMER Lambda 25 UV/VIS. A. Spectrometer.. M. IC. ➢ Baño Maria. Q. UI. ➢ Lámpara UV-Vis. Y. BI. O. ➢ Agitador Magnético.. AC I. A. 2. MÉTODO 4, 5, 10, 11, 12. RM. 2.1 RECOLECCION DE DATOS. DETERMINACION DEL PESO PROMEDIO DE TABLETAS. FA. 2.1.1. DE. Se registró el peso individual de 20 tabletas y se procedió a calcular el. CA. promedio de los valores obtenidos. (VER ANEXO N°1) MÉTODO ANALÍTICO POR ESPECTOFOTOMETRIA UV-VIS. IO. TE. 2.1.2. BL. DESARROLLADO4, 5, 10, 11, 12. BI. a) Condiciones espectrofotométricas: Equipo. : Espectrofotómetro UV/VIS. Celda. : 10 mm. Longitud de Onda : 221 nm Blanco. : Agua Purificada. Diluyente. : Agua Purificada. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. b) Preparación del Estándar: Se pesaron 6,25 mg de alprazolam estándar, se llevaron a matraces aforados de 50 mL, se adicionaron 30 mL de agua purificada y se procedió a sonicar por 10 minutos, se enrazo a volumen con agua, se homogenizo y filtro con papel Whatman N o 40. Se tomó 2 mL de la solución y se llevó a matraces aforados de 50 mL, enrasamos. A. a volumen con agua y homogenizamos. (Concentración final =. M. IC. 0,005 mg/mL).. Q. UI. La solución preparada se analizó de acuerdo con las condiciones. A. Y. BI. O. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a.. AC I. c) Preparación de la Muestra:. RM. Se tomó no menos de 20 tabletas, se trituro, homogenizo y peso 6,25. FA. mg de alprazolam (calculado a partir del peso promedio de las. DE. tabletas), se llevó a matraces aforados de 50mL, se adiciono 30 mL. CA. de agua purificada y sónico por 10 minutos, se enraso a volumen con. IO. TE. agua, se homogenizo y filtro con papel Whatman N o 40. Se tomó 2. BI. BL. mL de la solución y se llevó a matraces aforados de 50 mL, se enraso a volumen con agua y se homogenizo. (Concentración final = 0,005 mg/mL). La solución preparada se analizó de acuerdo con las condiciones espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2 VALIDACION DEL MÉTODO ANALÍTICO. 4, 5, 10, 11, 12. La validación del método analítico se realizó en base a los procedimiento s contemplados en la Farmacopea Americana (USP) y ciertas recomendacio ne s de la Asociación Española Farmacéutica para la industria (AEFI).. 2.2.1. 4, 5, 10, 11, 12. ENSAYO DE ESPECIFICIDAD. A. Se procedió a evaluar su especificidad sometiendo a situaciones de. M. IC. estrés para generar compuestos de degradación que puedan interferir en. BI. O. Q. UI. el análisis del analito.. ENSAYOS CON EL ESTANDAR. A. Y. 2.2.1.1. AC I. A. Degradación Acida. FA. RM. Pesamos 6,25 mg de alprazolam estándar, llevamos a. DE. matraces aforados de 50 mL, adicionamos 30 mL de agua. CA. purificada y sonicamos por 10 minutos, enrasamos a. BI. BL. IO. TE. volumen con agua, homogenizamos y filtramos con papel Whatman N o 40. Tomamos 2 mL de la solución y lleva mos a matraces aforados de 50 mL, adicionamos 5 mL de ácido clorhídrico. 0,01N, enrasamos a volumen con agua y. homogenizamos.. La solución preparada se analizó. de. acuerdo con las condiciones espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a. por triplicado.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. B. Degradación Alcalina Pesamos 6,25 mg de alprazolam estándar, llevamos a matraces aforados de 50 mL, adicionamos 30 mL de agua purificada y sonicamos por 10 minutos, enrasamos a volumen con agua, homogenizamos y filtramos con papel Whatman N o 40. Tomamos 2 mL de la solución y lleva mos. IC. A. a matraces aforados de 50 mL, adicionamos 5 mL de. La solución preparada se analizó. de. O. Q. homogenizamos.. UI. M. hidróxido de sodio 0,01N, enrasamos a volumen con agua y. BI. acuerdo con las condiciones espectrofotométricas indicadas. FA. RM. C. Oxidación. AC I. A. Y. en el punto 2.1. 2.a. por triplicado.. DE. Pesamos 6,25 mg de alprazolam estándar, llevamos a. CA. matraces aforados de 50 mL, adicionamos 30 mL de agua. BI. BL. IO. TE. purificada y sonicamos por 10 minutos, enrasamos a volumen con agua, homogenizamos y filtramos con papel Whatman N o 40. Tomamos 2 mL de la solución y lleva mos a matraces aforados de 50 mL, adicionamos 5 mL de peróxido de hidrogeno 3% v/v, enrasamos a volumen con agua y homogenizamos. La solución preparada se analizó de acuerdo con las condiciones espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a. por triplicado.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. D. Fotólisis Pesamos 6,25 mg de alprazolam estándar, llevamos a matraces aforados de 50 mL, adicionamos 30 mL de agua purificada y sonicamos por 10 minutos, enrasamos a volumen con agua, homogenizamos y filtramos con papel Whatman N o 40. Tomamos 2 mL de la solución y lleva mos. IC. A. a matraces aforados de 50 mL, enrasamos a volumen con. UI. M. agua y homogenizamos. Sometimos por 6 horas a luz. O. Q. ultravioleta. La solución preparada se analizó de acuerdo. BI. con las condiciones espectrofotométricas indicadas en el. FA. RM. E. Termólisis. AC I. A. Y. punto 2.1. 2.a. por triplicado.. DE. Pesamos 6,25 mg de alprazolam estándar, llevamos a. CA. matraces aforados de 50 mL, adicionamos 30 mL de agua. BI. BL. IO. TE. purificada y sonicamos por 10 minutos, enrasamos a volumen con agua, homogenizamos y filtramos con papel Whatman N o 40. Tomamos 2 mL de la solución y lleva mos a matraces aforados de 50 mL, enrasamos a volumen con agua y homogenizamos.. Sometimos. por 6 horas a. temperatura de 65 ºC. La solución preparada se analizó de acuerdo con las condiciones espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a. por triplicado.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.1.2. ENSAYO CON LAS TABLETAS DE ALPRAZOLAM.. A. Degradación Acida Pesamos 9 mg de polvo de muestra (equivalente a 6,25 mg de alprazolam), llevamos a matraces aforados de 50 mL, adicionamos 30 mL de agua purificada y sonicamos por 10. IC. A. minutos, enrasamos a volumen con agua, homogenizamos y. UI. M. filtramos con papel Whatman N o 40. Tomamos 2 mL de la. O. Q. solución y llevamos a matraces aforados de 50 mL,. BI. adicionamos 5 mL de ácido clorhídrico 0,01N, enrasamos a. analizó. de. acuerdo. AC I. se. A. Y. volumen con agua y homogenizamos. La solución preparada con. las. condiciones. FA. RM. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a. por. CA. DE. triplicado.. BI. BL. IO. TE. B. Degradación Alcalina Pesamos 9 mg de polvo de muestra (equivalente a 6,25 mg de alprazolam), llevamos a matraces aforados de 50 mL, adicionamos 30 mL de agua purificada y sonicamos por 10 minutos, enrasamos a volumen con agua, homogenizamos y filtramos con papel Whatman N o 40. Tomamos 2 mL de la solución y llevamos a matraces aforados de 50 mL, adicionamos 5 mL de de hidróxido sodio 0,01N, enrasamos a volumen con agua y homogenizamos. preparada se analizó. La solución. de acuerdo con las condiciones. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a. por triplicado.. C. Oxidación Pesamos 9 mg de polvo de muestra (equivalente a 6,25 mg de alprazolam), llevamos a matraces aforados de 50 mL,. IC. A. adicionamos 30 mL de agua purificada y sonicamos por 10. UI. M. minutos, enrasamos a volumen con agua, homogenizamos y. O. Q. filtramos con papel Whatman N o 40. Tomamos 2 mL de la. BI. solución y llevamos a matraces aforados de 50 mL,. A. Y. adicionamos 5 mL de peróxido de hidrogeno 3% v/v,. RM. preparada se analizó. de acuerdo. con las. FA. solución. AC I. enrasamos a volumen con agua y homogenizamos. La. DE. condiciones espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1.. TE. CA. 2.a. por triplicado.. BI. BL. IO. D. Fotólisis Pesamos 9 mg de polvo de muestra (equivalente a 6,25 mg de alprazolam), llevamos a matraces aforados de 50 mL, adicionamos 30 mL de agua purificada y sonicamos por 10 minutos, enrasamos a volumen con agua, homogenizamos y filtramos con papel Whatman N o 40. Tomamos 2 mL de la solución y llevamos a matraces aforados de 50 mL, enrasamos. a volumen. con agua y homogeniza mos.. Sometimos por 6 horas a luz ultravioleta. La solución. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. preparada se analizó. de acuerdo con las condiciones. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a. por triplicado.. E. Termólisis Pesamos 9 mg de polvo de muestra (equivalente a 6,25 mg. IC. A. de alprazolam), llevamos a matraces aforados de 50 mL,. UI. M. adicionamos 30 mL de agua purificada y sonicamos por 10. O. Q. minutos, enrasamos a volumen con agua, homogenizamos y. BI. filtramos con papel Whatman N o 40. Tomamos 2 mL de la. a volumen. AC I. enrasamos. A. Y. solución y llevamos a matraces aforados de 50 mL, con agua y homogeniza mos.. FA. RM. Sometimos por 6 horas a temperatura de 65 ºC. La solución de acuerdo con las condiciones. DE. preparada se analizó. CA. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a. por. IO. TE. triplicado.. ENSAYO DE LINEALIDAD. BI. BL. 2.2.2. 4, 5, 10, 11, 12. Primero se determinó la linealidad del sistema, en el cual solo se trabaja con estándares, por lo tanto, lo único que se está validando es el sistema. Seguidamente se determinó la linealidad de la muestra.. 2.2.2.1. LINEALIDAD DEL SISTEMA Para la evaluación de este parámetro se trabajó tres curvas de calibración,. pesando para cada una, cinco estándares a. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. concentraciones distintas de analito, de tal forma que se alcance soluciones a 80%, 90%, 100%, 110% y 120% respectivamente.. a). Procedimiento Se realizaron pesadas independientes aproximadame nte. A. de 5 mg; 5,625 mg; 6,25 mg; 6,875 mg; 7,500 mg de. M. IC. alprazolam estándar, llevamos por separado a matraces. Q. UI. aforados de 50 ml, adicionamos 30 ml de agua purificada. BI. O. a cada matraz aforado y sonicamos por 10 minutos,. A. Y. luego llevamos a volumen con agua, homogenizamos y. AC I. filtramos con papel Whatman N°40. Procedimos a medir. RM. 2 ml de cada solución anterior y transferimos por. FA. separado matraces aforados de 50 ml, enrasamos con. IO. TE. CA. DE. agua purificada y homogenizamos. Las concentraciones. que se obtuvieron fueron las. siguientes: 0,004 mg/ml; 0,0045 mg/ml; 0,005 mg/ml;. BL. 0,0055 mg/ml y 0,006 mg/ml respectivamente. La. BI. solución preparada se analizó. de acuerdo con las. condiciones espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a. por triplicado.. 2.2.2.2. LINEALIDAD DE LA MUESTRA Para. la. evaluación. de. este. parámetro. se. pesó. independientemente muestras patrones, de manera que se. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. obtuvo 5 niveles de concentraciones diferentes: 80%, 90%, 100%, 110% y 120%.. a). Procedimiento Se realizaron pesadas independientes de 7,2 mg; 8,134 mg; 9 mg; 9,9 mg y 10,8 mg de polvo de muestra (pesos. A. equivalentes para obtener concentraciones deseadas a. M. IC. 80%, 90%, 100%, 110% y 120%) se llevaron por. Q. UI. separado a matraces aforados de 50 ml, se adicionaro n. BI. O. 30 ml de agua purificada a cada matraz aforado y. A. Y. sonicamos por 10 minutos, luego se llevaron a volume n. AC I. con agua, homogenizamos y filtramos con papel. RM. Whatman No 40. Procedimos a medir 2 ml de cada. FA. solución anterior y transferimos por separado matraces. BI. BL. IO. TE. CA. DE. aforados de 50 ml, enrasamos con agua purificada y homogenizamos. Las concentraciones que se obtuvieron fueron las siguientes: 0,004 mg/ml; 0,0045 mg/ml; 0,005 mg/ml; 0,0055 mg/ml y 0,006 mg/ml respectivamente. La solución preparada se analizó de acuerdo con las condiciones espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a. por triplicado.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.3. ENSAYO DE EXACTITUD. 4, 5, 10, 11, 12. Se utilizó el método de adición de patrón, el cual consiste en agregar cantidades conocidas de un analito. patrón a tres niveles. de. concentración dentro del rango a estudiar. Las adiciones de los estándares se hicieron a tres niveles de concentración: 80%, 100% y 120%.. A. a) Preparación de las muestras. M. IC. Muestra 80%:. UI. Se pesaron 3 mg de polvo de muestra y se adicionaron 1 mg. O. Q. de alprazolam estándar, se llevaron a matraces aforados de 100. BI. mL, se adicionaron 30 mL de agua purificada y se sónico por Luego se enrazo a volumen con agua, se. homogenizo. y se filtró. AC I. A. Y. 10 minutos.. con papel Whatman. No 40.. (Concentración final = 0,04 mg/mL). La solución preparada analizó. RM. se. de. acuerdo. con. las. condiciones. FA. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a., por. CA. DE. triplicado.. BI. BL. IO. TE. Muestra 100%: Se pesaron 3 mg de polvo de muestra y se adicionaron 2 mg de alprazolam estándar, se llevaron a matraces aforados de 100 mL, se adicionaron 30 mL de agua purificada y se sónico por 10 minutos.. Luego se enrazo a volumen con agua, se. homogenizó. y se filtró. con papel Whatman. No 40.. (Concentración final = 0,05 mg/mL). La solución preparada se. analizó. de. acuerdo. con. las. condiciones. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a., por triplicado.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Muestra 120%: Se pesaron 3 mg de polvo de muestra y se adicionaron 3 mg de alprazolam estándar, se llevaron a matraces aforados de 100 mL, se adicionaron 30 mL de agua purificada y se sónico por 10 minutos. Luego se enrazo r a volumen con agua, se homogenizó. y se filtró. con papel Whatman. No 40.. de. acuerdo. con. IC. analizó. las. condiciones. M. se. A. (Concentración final = 0,06 mg/mL). La solución preparada. Q. UI. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.1. 2.a., por. Y. BI. O. triplicado.. 4, 5, 10, 11, 12. A. ENSAYO DE PRECISIÓN. AC I. 2.2.4. FA. RM. Se evaluó en términos de repetibilidad y precisión intermedia.. CA. DE. 2.2.4.1 REPETIBILIDAD. BI. BL. IO. TE. A. REPETIBILIDAD DEL SISTEMA Se prepararon 6 soluciones estándar de acuerdo con el punto 2.1.2.b. y. de. acuerdo. con. las. condicione s. espectrofotométricos en el punto 2.1. 2.a, se realizó 3 lecturas de cada uno.. B. REPETIBILIDAD DEL MÉTODO A partir de la trituración, homogenización de las tabletas de alprazolam a analizar, se prepararon 6 muestras individua le s de concentración aproximada a 100% de acuerdo con el punto. 2.1.2.c. y. de acuerdo. con. las. condicione s. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. espectrofotométricas descritas en el punto de 2.1. 2.a se realizó 3 lecturas a cada una.. 2.2.4.2 PRECISIÓN INTERMEDIA El análisis se llevó acabo por 2 analistas en días diferentes. Igual que en la repetibilidad partimos de la triturac ió n,. individuales. IC. 1 determinaciones. de concentració n. M. realizó. A. homogenización de las tabletas de alprazolam a analizar y se. O. 2.1.2.c y de acuerdo con las. BI. acuerdo con el punto. Q. UI. aproximada a 100%, procediendo a sus preparaciones de. descritas en el punto. A. Y. características espectrofotométricas. RANGO 4, 5, 10, 11, 12. FA. 2.2.5. RM. AC I. 2.1.2.a, realizando 3 lecturas.. DE. Cumplidas las especificaciones de Linealidad del sistema, Linealidad. CA. del Método, Precisión y la Exactitud, se estableció que el rango de este. IO. TE. método analítico es de 80 % a 120 %, verificándose que el método. BI. BL. analítico funciona correctamente cuando se aplican a muestras que contienen principio activo a concentraciones iguales a los extremos superior e inferior, así como dentro del intervalo de concentració n definido.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.3 ANÁLISIS DE SELECTIVIDAD. 4,13,14,15. a) Identificación del pico de alprazolam: Criterio de aceptación: Los espectros de absorción UV de la preparación muestra y preparación estándar presentan máximos y mínimos a longitudes de onda semejantes. b) Degradación forzada de muestras. IC. A. Criterio de análisis: Comparar los espectros de absorción UV de la. UI. M. preparación estándar versus las soluciones sometidas a degradación.. O. Q. Establecer las limitaciones del método a las sustancias que en contacto. A. Y. BI. con la muestra producen una degradación marcada del analito.. RM. AC I. 2.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LINEALIDAD 4,13,14,15. FA. Las características de la recta absorbancia-concentración del estándar y la. DE. muestra fueron, sujetas de análisis por el método de mínimos cuadrados. CA. así:. TE. Calculo de la recta de regresión. BI. BL. IO. Ecuación de la recta:. 𝐲 = bX + a. Dónde: X: Concentración de analito. Y: Absorbancia del analito. b: Valor de la pendiente de la recta. a: Termino independiente (intercepto, estimador de la ordenada de origen).. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. “b” se obtiene:. 𝒃=. ∑𝑿𝒊∑𝒀𝒊 𝒏 ( )𝟐 ∑𝑿𝒊 ∑𝑿𝒊𝟐 𝒏. ∑𝑿𝒊𝒀𝒊 −. BI. O. Q. UI. M. IC. ∑𝒀𝒊 − 𝒃 ∑𝑿𝒊 𝒏. 𝒂=. A. “a” se obtiene:. A. Y. Coeficiente de correlación "r". AC I. El coeficiente de correlación "r" refleja el grado de relación o ligazó n. RM. existente entre las variables X (concentración) e Y (respuesta). Si es. FA. cercano a la unidad significa que existe correlación con una probabilidad. 𝒓=. ∑𝒙𝒚 −. ∑𝒙∑𝒚 𝒏. ( )𝟐 ( )𝟐 √(∑𝒙𝟐 ∑𝒙 ) (∑𝒚𝟐 ∑𝒚 ) 𝒏 𝒏. BL. IO. TE. CA. DE. elevada.. BI. Criterio de aceptación: r no debe ser significativamente diferente de 1. Valores mayores a 0,995 se consideran como aceptables.. Coeficiente de determinación 𝒓𝟐: 𝒓𝟐 = (𝒓)𝟐 Es el cuadrado del coeficiente de correlación "r", e indica la proporción de la varianza total de "Y".. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Criterio de aceptación: 𝒓𝟐 no debe ser significativamente diferente de 1. Valores mayores a 0,990 se consideran como aceptables.. Test de hipótesis para demostrar regresión lineal en función del coeficiente de correlación "r". IC. A. HO: no hay correlación entre X e Y. UI. M. |𝒓|√(𝒏 − 𝟐) √( 𝟏 − 𝒓 𝟐 ). BI. O. Q. 𝒕𝐞𝐱𝐩(𝒓) =. AC I. A. Y. Criterio de aceptación: Si el valor de 𝒕𝐞𝐱𝐩(𝒓) obtenido es mayor que el "t". RM. de tabla calculado para (n - 2) grados de libertad y un nivel de significa c ió n. FA. del 95% (probabilidad α = 0,05), entonces existe correlación linea l. CA. DE. significativa.. TE. Dónde:. BL. IO. r: coeficiente de correlación lineal.. BI. n: número de mediciones. Factores de respuesta (f) Se define obteniendo el valor de la pendiente (f) por cada punto 𝒇=. 𝒀 𝒙. Dónde: X: concentración de analito. Y: absorbancia. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En una calibración lineal los factores de respuesta son semejantes entere sí por este motivo se considera CVFR. Esto se halla según la fórmula:. 𝒂 = 𝑪𝑽𝑭𝑹 = 𝑺𝒇( 𝟏𝟎𝟎⁄𝑭) Dónde: 𝑆𝑓= Desviación estándar de los factores de respuesta.. IC. A. 𝐹= Promedio de los factores de repuesta.. Q. UI. M. Criterio de aceptación: Menor 2%. 4,13,14,15. BI. O. 2.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE EXACTITUD. A. Y. Prueba t de Student para determinar exactitud:. FA. RM. AC I. La exactitud se determina mediante la aplicación del test “t” de Student:. (𝟏𝟎𝟎 − 𝑹)√ 𝒏 𝑹𝑺𝑫. CA. DE. 𝒕(𝒆𝒙𝒑) =. IO. TE. Dónde:. BL. t (exp): Valor de t obtenido experimentalmente. BI. R: Porcentaje de recuperación promedio n: Número de datos o mediciones (9) RSD: desviación estándar relativa del total de mediciones. Criterio de aceptación: Si el "t” experimental, t(exp), es menor al "t" de tablas para (n-1) grados de libertad y un nivel de significación del 95 % (α= 0,05), entonces no existe diferencia significativa entre la recuperación media y la cantidad añadida de analito.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE PRECISIÓN. 4,13,14,15. La precisión está relacionada con la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio o central y corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales cuando el análisis se aplica repetidamente a múltip les alícuotas de una muestra homogénea.. IC. A. La precisión se expresa matemáticamente como la desviación estándar (s). UI. M. o como la desviación estándar relativa (DSR). El estimador de la desviación. O. Q. estándar se calcula como:. AC I. A. Y. BI. ∑𝒏 (𝒙 − 𝒙𝑷 )𝟐 𝑺 = √ 𝒊=𝟏 𝒊 𝒏 −𝟏. FA. RM. Dónde:. DE. n: Número de medidas. CA. Xi: Valor medido por el ensayo i. BL. IO. TE. Xp: Estimador de la media proporcional μ. BI. 𝑿𝒑 =. ∑𝒏𝒊=𝟏 𝒙𝒊 𝒏. La desviación estándar relativa (DSR) se calcula como:. 𝑫𝑺𝑹 =. 𝑺. 𝟏𝟎𝟎 𝒙𝒑. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Evaluar la precisión del método a nivel de repetibilidad y precisión intermedia: ➢ Repetibilidad: Evaluar los resultados obtenidos por un mismo analista, el mismo día y en la misma serie de análisis. ➢ Precisión intermedia: Evaluar los resultados obtenidos en el análisis de la. A. misma muestra por los tres analistas.. M. IC. Criterio de aceptación:. Q. UI. Precisión del sistema: DSR no mayor de 2,0%. BI. O. Precisión del método. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC I. A. Y. Repetibilidad: DSR no mayor de 2,0%. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.7 ESPECIFICACIONES Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN SE MUESTRAN A CONTINUACIÓN PARÁMETRO. 4, 13, 14,15 .. ESPECIFICACIÓN ➢ Los espectros de absorción UV de la. SELECTIVIDAD. preparación muestra y preparación estándar presentan máximos y mínimos a longitud de. IC. A. onda semejantes.. O. Q. Y=bx + a. UI. ➢ r2 no menor a 0,990. M. LINEALIDAD. BI. ➢ Test de linealidad. Y. CV Factor de respuesta menor de 5%. AC I. A. DS de la pendiente (b) menor a 2% T student exp mayor que t tablas. RM. ➢ Test de proporcionalidad. FA. T student exp menor t tablas. BL. IO. TE. EXACTITUD. BI. Gexp < G tabla. No Se Rechaza la Ho. CA. DE. ➢ Test de Cochran. ➢ Porcentaje recuperado de 98%-102% de lo declarado ➢ CV no mayor a 2% ➢ Test de t student exp menor t tablas. PRECISION ➢ Repetibilidad Repetibilidad del sistema: CV no mayor a 2% Repetibilidad del método: CV no mayor a 2% ➢ Precisión intermedia CV entre 2 analistas no mayor a 2%. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V.. RESULTADOS. TABLA 1: Selectividad de la técnica analítica de cuantificación de alprazolam 0,5 mg comprimidos-Evaluación del estándar.. SELECTIVIDAD. ESPECIFICACIONES. RESULTADOS. CONFORME. M. IC. A. Los espectros de absorción UV de la preparación de la muestra y estándar presentan máximos y mínimos a longitud de onda semejantes.. A. Y. BI. O. Q. UI. IDENTIFICACIÓN. AC I. TABLA 2: Influencia de la degradación forzada en la estabilidad del estándar de. DE. FA. RM. alprazolam 0,5 mg por el método espectrofotométrico UV/VIS.. ABSORBANCIA. RESULTADO. 0,8769. % DE INTERFERENCIA -----------. 0,6139. 29,99. INESTABLE. FOTÓLISIS. 0,6955. 18,14. INESTABLE. DEGRADACIÓN ALCALINA DEGRADACIÓN ACIDA. 0,8822. 0,60. ESTABLE. 0,4194. 52,17. INESTABLE. OXIDACIÓN. 2,6995. 207,84. INESTABLE. TE. CA. PARÁMETRO. BL. BI. TERMÓLISIS. IO. ESTÁNDAR. ----------. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA 3: Influencia de la degradación forzada en la estabilidad de la muestra de alprazolam 0,5 mg comprimidos por el método espectrofotométrico UV/VIS.. ABSORBANCIA. % DE INTERFERENCIA. RESULTADO. MUESTRA. 0,9225. ------. ------. TERMÓLISIS. 0,5786. 37,27. INESTABLE. FOTOLISIS. 0,8499. 7,86. INESTABLE. DEGRADACIÓN ALCALINA. 0,9197. 0,30. DEGRADACIÓN ACIDA OXIDACIÓN. 0,6201. 32,78. 3,5324. 282,91. M. IC. A. PARÁMETRO. ESTABLE. Q. UI. INESTABLE. A. Y. BI. O. INESTABLE. AC I. TABLA 4: Linealidad de la técnica analítica de cuantificación de alprazolam 0,5 mg. RESULTADOS. Y = bX + a. Y = 0,0171X + 0,02812. Mayor a 0,990 Mayor a 0,990. r = 0,9975 r2 = 0,9951. No mayor a 2%. CV% = 1,2129 t exp = 51,1452. t experimental de b. t exp. > t tabla (t tabla= 2,160) t exp. > t tabla. t experimental de a. (t tabla= 2,160)* t exp. < t tabla. t exp = -1,6624. (t tabla= 2,160)* G exp < G tabla. 0,01748. CA. Ecuación de la recta. DE. ESPECIFICACIONES. FA. RM. por el método espectrofotométrico UV/VIS – Linealidad del sistema.. IO. TE. Coeficiente de correlación Coeficiente de determinación. BI. BL. Coeficiente de variación de los factores respuesta Pruebas de t de Student. Test de Cochran (Homogenidad de varianzas). t exp = 51,1452. G tabla = 0,6838. *Tabla t de Student para: p=0,05 y n-2g.l. *Tabla t de Student para: p=0,05; k= 5 y n= 3.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. FIGURA 1: Curva de linealidad del sistema: Concentración de alprazolam 0,5 mg (mg/ml) vs. Absorbancia.. LINEALIDAD DEL SISTEMA 1.2. y = 0,0171x - 0,0281 R² = 0,9951. 1 0.8. IC. A. 0.6. M. 0.4. 0 20.0. 30.0. 40.0. 50.0. BI. 10.0. 60.0. 70.0. Y. 0.0. O. Q. UI. 0.2. AC I. A. TABLA 5: Linealidad de la técnica analítica de cuantificación de alprazolam 0,5 mg. RESULTADOS Y = bX + a. Y = 0,0108X + 0,0719. Mayor a 0,990. r = 0,9995. Mayor a 0,990. r2 = 0,9990. No mayor a 2%. CV% = 1,7856 t exp = 113,9428. t experimental de b. t exp. > t tabla (t tabla= 2,160) t exp. > t tabla. t experimental de a. (t tabla= 2,160)* t exp. < t tabla. t exp = -13,7317. (t tabla= 2,160)* G exp < G tabla. 0,0052. CA. Ecuación de la recta. DE. ESPECIFICACIONES. FA. RM. por el método espectrofotométrico UV/VIS – Linealidad del método.. TE. Coeficiente de correlación. IO. Coeficiente de determinación. BI. BL. Coeficiente de variación de los factores respuesta Pruebas de t de Student. Test de Cochran (Homogenidad de varianzas). t exp = 113,9428. G tabla = 0,6838. *Tabla t de Student para: p=0,05 y n-2g.l. *Tabla t de Student para: p=0,05; k= 5 y n= 3.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. FIGURA 2: Curva de linealidad del método: Concentración de alprazolam 0,5 mg (mg/ml) vs. Absorbancia.. LINEALIDAD DEL MÉTODO 0.8000 y = 0,0109x + 0,072 R² = 0,999. 0.7000 0.6000. IC. A. 0.5000. M. 0.4000. UI. 0.3000. O. Q. 0.2000. BI. 0.1000 10.0. 20.0. 30.0. 40.0. 50.0. 60.0. 70.0. RM. AC I. A. 0.0. Y. 0.0000. EXACTITUD ESPECIFICACIONES. RESULTADOS. 98,00-102,00%. 98,84%. TE. CA. DE. FA. TABLA 6: Exactitud de alprazolam por el método espectrofotométrico UV/VIS.. IO. Porcentaje de recuperación promedio. texp .<ttabla. BL. Prueba t de Student. BI. (ttabla=2,306). Coeficiente de variación. No mayor a 2%. 1,607 1,257. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA 7: Precisión de alprazolam por el método espectrofotométrico UV/VIS.. PRECISIÓN ESPECIFICACIONES. RESULTADOS. > a 2%. 1,1844. PRECISIÓN SISTÉMICA Coeficiente de variación de 5 absorbancias del estándar. > a 2%. 1,9923. UI. M. Coeficiente de variación. IC. A. PRECISIÓN DEL MÉTODO. O. > a 2%. 1,79. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC I. A. Y. BI. Coeficiente de variación. Q. PRESICION INTERMEDIA. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(45) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI.. DISCUSIÓN. Uno de los principales retos actuales, en cuanto al desarrollo de medicamentos es lograr un producto estable, homogéneo, efectivo y que sus propiedades se mantenga n en el tiempo. Para determinar el cumplimiento de estas condiciones es que se emplean las pruebas fisicoquímicas de control de calidad de medicamentos; y con el fin de garantizar la eficiencia de las pruebas de control de calidad es que se hace. IC. A. necesario validar los métodos, cuando estos no son oficiales 12 .. UI. M. En la tabla 1 se presenta el parámetro de selectividad los cueles muestran. O. Q. conformidad entre las lecturas máximos en la comparación del estándar y la muestra,. Y. BI. lo que indica que los componentes de los excipientes no interfieren en la respuesta. AC I. A. obtenida por este método analítico. En la tabla 2 y 3 se representa los resultados. RM. obtenidos del estándar y muestra respectivamente, los cuales fueron sometidos a. FA. diferentes condiciones de estrés (hidrolisis acida, hidrolisis alcalina, oxidación, calor. DE. y luz), tanto para el estándar como la muestra se evidencia inestabilidad al someter a. CA. hidrolisis acida, oxidación, calor y luz; pero son estables a hidrolisis alcalina. Ambas. TE. tablas se evidencian que los excipientes de la formulación o los posibles productos. BL. IO. de degradación interfieren en la degradación del principio activo 4 .. BI. La validación de un método analítico debe iniciar con el análisis de selectividad o especificidad, ya que este parámetro nos demuestra que el método es capaz de discriminar entre el analito, sustancias de composición similar y otras sustancias que pueden estar presentes en la muestra,. como excipientes. o productos de. degradación4,16. El grado de selectividad asociado a un método analítico adquiere mayor relevanc ia si su finalidad es evaluar la estabilidad del principio activo a de la fórmula. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(46) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. farmacéutica; este es el parámetro que debe revisarse en mayores ocasiones, pues está vinculado al origen de la muestra, la optimización de la preparación, la especificidad de la media y las condiciones instrumentales 4,16. La linealidad es la capacidad (dentro de un intervalo dado) para proporcionar resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito en las muestras de examen. En la tabla 4 y 5 se representa los resultados de la linealidad del. IC. A. estándar y la muestra, en el cual se obtuvo un coeficiente de correlación (r) igual a. UI. M. 0,9975 (estándar) y (r) igual 0,9995 (muestra), el cual es mayor al valor mínimo que. O. Q. es aceptable de 0,990; lo que nos indica una correlación lineal significativa entre la. BI. concentración y absorbancia que reporta el analito en el análisis. Pero como la. A. Y. información obtenida mediante el cálculo del coeficiente de correlación es limitado. AC I. y no justifica por si sola la linealidad, hallamos el coeficiente de determinación (r 2 ),. RM. que aporta una mayor significancia estadística ya que expresa la proporción de la. DE. FA. variación del método, es así que obtuvimos un (r2 ) igual a 0,9951 (estándar) y (r2 ). CA. igual a 0,9990 (muestra), lo cual indica una probabilidad mayor a 99% de que el 18 .. TE. porcentaje de variación de respuesta es producida por la concentración17,. BL. IO. Así mismo se determinó el coeficiente de variación de los factores de respuesta. BI. (CV%), que fue de 1,2129 (estándar) y 1,7856 (muestra), menor al 2%; lo que indicó la linealidad entre la relación absorbancia/concentración, reflejando la sensibilidad de la calibración17,. 18 .. Se aplicó también una prueba t-student para comprobar que la regresión es lineal con la finalidad de evaluar la existencia de una pendiente significativamente diferente de cero, el valor t exp que fue de 51,1452 (estándar) y 113,9428 (muestra) cumpliéndose. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(47) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. así el criterio de aceptación de que la pendiente distinta de cero (t exp. > t tabla) ; corroborando linealidad. 4,20 .. Del mismo modo, se halló un t experimental de la pendiente b igual a 51,1452 (estándar) y 113,9428 (muestra) mayor al de tabla (2,160), resultado que está relacionado con la sensibilidad del método de forma que a mayor pendiente mayor sensibilidad (respuesta del método frente a los cambios de la concentración del. IC. A. analito). lo que nos indica una probabilidad del 95% que b (pendiente de la recta) sea. UI. M. diferente de cero. El t experimental del término independiente a fue de -13,73. O. Q. (muestra) que es menor al t de tabla (2,160), sin embargo, para el estándar fue -1,6624. BI. que cumple con el criterio de aceptación del intercepto (a) cercano a cero (t exp. < t. A. Y. tabla). Este es el valor indicativo del error sistemático. A menor valor entonces menor. AC I. error para las mediciones repetidas que se realizan exactamente de la misma. FA. RM. forma4,15,22 .. DE. También se aplicó el test de Cochran el cual indica si la concentración tiene. CA. influencia en la variabilidad de resultados.. IO. TE. Uno de los criterios de calidad que tiene gran relevancia la estandarización y. BL. validación de un método analítico es la exactitud, ya que este parámetro refleja de. BI. manera evidente, el grado de concordancia entre un valor real (medido) y un valor teórico (verdadero) y generalmente se sustenta a través del porcentaje de recuperación. En la tabla 6 se evidencia los resultados del parámetro de exactitud, cuya finalidad es comprobar que el método tiene la capacidad de revelar dentro de un límite aceptable la cantidad de sustancia de interés que esté presente en la muestra, teniendo como resultado un porcentaje de recuperación promedio de 98,48 % dentro de las especificaciones (98,00% -102,00%), al aplicar la prueba t-estudent para. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.