UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERU FACULTAD DE ZOOTECNIA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERU FACULTAD DE ZOOTECNIA

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“EVALUACIÓN DE DOS DILUTORES COMERCIALES EN SEMEN CONGELADO DE TOROS EN EL BANCO NACIONAL”

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TESIS PRESENTADO POR:

RONALD EDUARDO DAMAS HUAMAN PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE

INGENIERO ZOOTECNISTA

HUANCAYO – P E R Ú

2010

2 ASESOR: ING. SAÚL ESPINOZA MOLINA

3 A MI PAPA, GODOFREDO DAMAS,

Y MAMA, FLORINDA HUAMAN, POR SU APOYO, AMOR Y COMPRENSIÓN.

A MIS HERMANOS: IVÁN E IRIS

CON MUCHO CARIÑO.

4

AGRADECIMIENTOS

Dejo constancia de mi sincero agradecimiento al Ing. M.Sc. Próspero Cabrera Villanueva, Jefe del Banco Nacional de Semen por su apoyo y haberme permitido hacer el trabajo de investigación en las instalaciones BNS, también por sus acertados consejos y enseñanzas para que la investigación se desarrolle adecuadamente.

Al Ing. Saúl Espinoza Molina por haberme asesorado el presente trabajo de tesis , por sus consejos y enseñanzas y apoyo constante durante mis estudios de pregrado.

A mis profesores de la Facultad de Zootecnia de la UNCP, quienes con sus sabias enseñanzas, han permitido que suba un escalón más en el mundo académico científico de la Zootecnia.

Al Banco Nacional de Semen, institución que me brindó todas las facilidades para la realización del presente trabajo de tesis.

A mis compañeros, con quienes compartí experiencias y muchas vivencias.

A mis familiares y a todas las personas que de una u otra forma han colaborado conmigo para que mi trabajo de tesis llegue a un final feliz.

5

INDICE

Páginas

RESUMEN INTRODUCCIÓN

II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 La célula espermática 14

2.2 Características macroscópicas y microscópicas del semen 15

2.2.1 Características macroscópicas 15

2.2.2 Características microscópicas 18

2.3 Prueba de funcionalidad espermática 20

2.3.1 Test de endósmosis 20

2.4 Características de los espermatozoides en semen refrigerado 22 2.5 Características de los espermatozoides en semen congelado-

Descongelado 23

2.6 Dilutores para semen bovino 25

2.6.1 Características de los dilutores 25

2.6.2 Dilutores más usados para preservación de espermatozoides 28 2.7 Uso de dilutores en semen bovino y respuestas en las características

seminales. 30

III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Lugar de ejecución y duración 34

3.2 De los animales del experimento 34

3.3 Alimentación de los animales 35

3.4 Instalaciones 35

3.5 Variables en estudio 36

3.6 Métodos de evaluación 37

3.6.1 Colección de semen 38

6

3.6.2 Evaluación del semen 38

3.5.2.1 Evaluaciones macroscópicas 38

3.5.2.2 Evaluaciones microscópicas 39

3.5.3 Determinación de la integridad de membrana citoplasmática

en los espermatozoides 41

3.5.4 De los dilutores y procesamiento de semen 43

3.5.4.1 Preparación del dilutor 43

3.5.4.2 Protocolo de dilución 44

3.5.4.3 Envasado del semen en pajillas 44

3.5.4.4 Equilibrio o ambientación de las pajillas 44 3.5.4.5 Congelamiento y descongelamiento 45

3.6 Diseño estadístico 45

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Características del semen colectado 49

4.2 Porcentaje de endosmosis positiva en semen puro 51 4.3 Características del semen refrigerado post estabilización térmica

con los diferentes dilutores. 54

4.4 Características del semen congelado post descongelado con los

diferentes dilutores. 57

4.5 Efecto de los dilutores sobre la MIP en semen post refrigerado

y post congelado. 61

4.4 Efecto de los dilutores sobre la vitalidad, en semen post refrigerado

y post congelado. 63

4.5 Efecto de los dilutores sobre la prueba de Host, en semen post

refrigerado y post congelado. 66

4.6 Regresión y correlación entre las características evaluadas 70

CONCLUSIONES 72

7

RECOMENDACIONES 74

REFERENCIAS BIBLIOGRAFIAS 75

ANEXOS 82

INDICE DE CUADROS

Cuadro Descripción Pagina

1 Composición química de la solución hipo osmótica a 100 mOsmol/l con citrato de sodio y fructuosa.

41

2 Composición química del medio de lavado con citrato de sodio al 2.9%

con 2% (v/v) de suero bovino.

42

3 Características seminales promedio de los toros evaluados en semen puro

52

4

Características seminales promedio de los toros evaluados en semen

puro por razas ⁵³

5

Porcentaje de Motilidad individual progresiva (MIP), vitalidad y endosmosis positiva con los diferentes dilutores y toros al Post refrigerado.

56

6

Porcentaje de Motilidad individual progresiva (MIP), vitalidad y endosmosis positiva con los diferentes dilutores y toros al Post congelado.

59

7 Motilidad individual progresiva en diferentes tiempos de conservación del semen del toro.

63

8 Porcentajes de espermatozoide vivos en diferentes momentos de conservación y tipo de dilutor.

65

9 Porcentajes de endosmosis positiva en diferentes momentos de conservación y tipo de dilutor.

68

10 Regresiones lineales de las características principales ⁷⁰

8

INDICE DE GRAFICOS

Grafico Descripción Pagina

1 Flujograma de metodología ³⁷

2

Comparación de motilidad, vitalidad e integridad de membrana (Host) en

semen post refrigerado. 57

3

Comparación de motilidad, vitalidad e integridad de membrana (Host) en

semen post congelado. 61

4 Comparación de Motilidad en semen post refrigerado y post congelado. 63 5

Comparación de vitalidad en semen puro, Post-refrigerado y Post-

congelado. 66

6 Comparación de integridad de membrana en semen puro, refrigerado y

congelado. ⁶⁹

9

RESUMEN

Con la finalidad de analizar el efecto de dos dilutores comerciales (Bioxcell y AndroMed) sobre la viabilidad espermática post refrigerado y post descongelado, a través de observaciones de motilidad, vitalidad y prueba de Host, se condujo la presente investigación en el Banco Nacional de Semen, del Programa de Investigación y Proyección Social en Mejoramiento Animal de la UNALM, habiéndose empleado 5 toros ( 2 Holstein y 3 Brown Swiss de 3 a 4 años de edad), alimentados a base a maíz chala (Zea mays) y suplemento concentrado. El semen colectado en vagina artificial fue evaluado macro y microscópicamente y luego diluido con diluyentes Bioxcell (T1) y AndroMed (T2). Se envasó el semen diluido en pajillas de 0,5 ml, con concentración de 25 x 10⁶ espermatozoides por pajilla los cuales al congelado fueron colocados sobre vapores de nitrógeno liquido bajando la temperatura de 5 ºC a 0 ºC en un minuto y luego rápidamente se bajo a - 20 ºC por cada minuto hasta llegar a - 140 ºC en 7 minutos, luego de llegar a - 140 ºC, se sumergió rápidamente las pajillas en el nitrógeno líquido y se descongeló pajillas a 38 ºC en termo descongelador, por espacio de 15 segundos, para luego hacer las evaluaciones respectivas. Los datos fueron analizados empleando el paquete estadístico SAS (Statistical Análisis System) Versión 8. Los valores de las características seminales del semen puro fueron: color blanco cremoso, lechoso, amarillo cremoso, pH 7; con volumen seminal para Holstein y Brown Swiss de 5,30 ± 1,3 ml y 6,52 ± 2,15 ml; motilidad masal de 3,90 ± 0,64 y 4,33

± 0,55; concentración espermática de 1 100 x 10⁶ y 1 150 x 10⁶ por ml; porcentaje de espermatozoides vivos 82,94 ± 5,21 % y 85,59 ± 3,15 % y Host en semen puro de 80,43 ± 6,66 % y 82,88 ± 6,10 %. A la evaluación de motilidad individual progresiva en semen al post refrigerado, con el dilutor Bioxcell se obtuvo 85,64 ± 2,32 % y con AndroMed 86,54 ± 2,24 %, que a la prueba de comparaciones de medias se encontró diferencias significativas (P<0,05), mientras al post congelado con Bioxcell se obtuvo 63,70 ± 1,85 % y con AndroMed 65,04 ± 2,05 %, que a la prueba de t Student, se

10 encontró diferencias altamente significativas (P<0,01) entre dilutores. Con la prueba de vitalidad con el dilutor Bioxcell se obtuvo 77,38 ± 4,31 % de espermatozoides vivos y con AndroMed 78,85 ± 4,52%, encontrándose diferencias estadísticas significativas (P<0,05), mientras al post congelado con Bioxcell se obtuvo 60,73 ± 5,07 % y con AndroMed 63,47 ± 4,61 % de espermatozoides vivos, que a la prueba de comparaciones de medias, se encontró diferencias altamente significativas (P<0,01) entre dilutores y con la prueba hipo osmótica (Test de Host), que permitió evidenciar espermatozoides con membrana intacta y osmóticamente activa, al post refrigerado con el dilutor Bioxcell se obtuvo 66,00 ± 4,98 % y con AndroMed 67,90 ± 5,40 % de espermatozoides que reaccionaron positivamente al test de Host, a la prueba de mediad t Student, se encontró diferencias estadísticas significativas (P<0,05), mientras al post congelado con Bioxcell se obtuvo 43,44 ± 3,29 % y con AndroMed 45,93 ± 3,61

% que al prueba de medias se encontró diferencias altamente significativos (P<0,01) entre dilutores. Además con el semen puro al post congelado con Bioxcell se perdió 39% de espermatozoides viables y con AndroMed 36%, con mejor efecto al post refrigerado y post congelado del dilutor AndroMed.

Al hacer las regresiones lineales entre las características evaluadas, con el Test de Host se obtuvo regresiones lineales altamente significativas (P<0,01), con coeficientes de regresión y determinación de medios a altos, mayores que cuando se hace la regresión lineal con la prueba de MIP y vitalidad, entonces la prueba de Host sería un buen indicador de la calidad seminal y se podría predecir mejor, espermatozoides hábiles al post congelado. En semen puro se encontró una correlación alta, positiva y altamente significativa (P<0,01) entre porcentaje de espermatozoides vivos y porcentaje de espermatozoides con membrana intacta (test de Host). También se observó correlaciones positivas moderadas y significativas al post refrigerado y al post congelado entre MIP, Vitalidad y espermatozoides que reaccionan positivamente al test de Host.

11

INTRODUCCIÓN

La Inseminación Artificial (IA) es un procedimiento biotecnológico reproductivo, que implica la maximización de la capacidad reproductiva de los toros como reproductores de élite y ha demostrado ampliamente su gran aporte al mejoramiento genético del ganado bovino productor de leche en diferentes partes del mundo; es así que actualmente existen muchas ganaderías del Perú que lo aplican. Sin embargo, aún subsisten algunos factores que atentan contra el éxito de la técnica, entre las que se pueden mencionar la calidad de semen, que está relacionada con la capacidad reproductiva del macho, manejo del semen y el procesamiento y conservación que se realizan en las centrales de inseminación.

En el procesamiento de semen, en la etapa de dilución, se utilizan diluyentes seminales que contienen diversos insumos tales la glucosa como fuente de energía, yema de huevo para proteger del choque térmico, amortiguadores para mantener el pH cercano a neutro, antibióticos como penicilina, estreptomicina y otras combinaciones de antibióticos para evitar la proliferación de microorganismos , todo a una presión osmótica aproximada a 300 mOsm, equivalente a la del s emen (Hafez, 2000). Por décadas el dilutor principal comúnmente usado para congelamiento de semen a largo plazo han sido, tris - yema – glicerol, que en los últimos años se está dejando de lado su uso en las centrales de inseminación artificial, por ser difíciles para estandarizar, por argumentos de su composición y constante riesgo de contaminación por bacterias a causa de la yema de huevo (Van Wagtendonk et al., 2000).

La conservación de los espermatozoides y su capacidad de fertilidad exige la reducción o interrupción del metabolismo celular. Este objetivo se consigue por medio de la refrigeración o de la congelación, utilizando temperaturas reducidas que

12 depriman el metabolismo. La refrigeración permite mantener la longevidad y la capacidad fecundante de los espermatozoides por algunos días, sin que su metabolismo sea completamente abolido (Maxweell y Stojanov, 1996). La congelación tiene, en comparación con la refrigeración, la ventaja de preservar el material genético por un periodo de tiempo indefinido. Sin embargo, es un proceso que destruye un porcentaje considerable de espermatozoides. Watson (1995) observó que la supervivencia post-descongelación se encontraba limitada al 50% de la población inicialmente viable, incluso con la aplicación de mejores técnicas de preservación. De ahí la necesidad de desarrollar técnicas de crio preservación más eficaces, dilutores mas adecuados y mejores metodologías para evaluar el espermatozoide crio preservado, con el objetivo de mejorar la viabilidad y la motilidad del semen preservado y, consecuentemente, la fertilidad.

La reducción de la fertilidad asociada al semen congelado es atribuida en gran parte a la alteración de la estructura y función de las membranas durante los procesos de refrigeración, congelación y descongelación ya que para poder interactuar con el oocito, los espermatozoides deben estar vivos, mótiles y poseer la membrana plasmática y acrosoma intactas y funcionales (Stornelli et al., 2005).

Entonces una nueva generación de dilutores están saliendo al mercado (Bioxcell, AndroMed y otros) libres de componentes de origen animal, siendo de mucha importancia probar su efecto en la criopreservación del semen y mejorar la motilidad y viabilidad espermática post descongelado.

Bajo el enfoque anterior, nos planteamos el siguiente problema de investigación:

¿Cuál de los dilutores comerciales conservara mejor el semen al post congelado evaluados a través de la prueba de motilidad, vitalidad e integridad de membrana (test de Host)?

13 La hipótesis de investigación propuesta es que estos dilutores mejoraran la viabilidad espermática al post-congelado, donde al menos uno de ellos tendrá mejor efecto sobre la viabilidad espermática.

Considerando el problema e hipótesis se determinaron los siguientes objetivos:

Objetivo general:

- Evaluar el efecto de dos dilutores comerciales (Bioxcell y AndroMed) sobre la viabilidad espermática en semen congelado de toros del Banco Nacional.

Objetivos específicos:

- Determinar el efecto de los dilutores comerciales (Bioxcell y AndroMed)

sobre la prueba de motilidad individual progresiva del semen de toros al post refrigerado y post congelado.

- Determinar el efecto de los dilutores comerciales (Bioxcell y AndroMed)

sobre la prueba de vitalidad del semen de toros al post refrigerado y post congelado.

- Determinar el efecto de los dilutores comerciales (Bioxcell y AndroMed)

sobre la prueba de integridad de membrana espermática (Test de Host) del semen de toros al post refrigerado y post congelado.

- Determinar las correlaciones y regresiones entre las características macroscópicas y microscópicas del semen de toros del Banco Nacional.

14

II.

REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 La célula espermática

El espermatozoide es una célula altamente especializada, cuya función es la de fecundar el oocito; está compuesto de una cabeza y cola que le permite la motilidad (Illera, 1994). La cabeza compuesta de cromatina condensada y pequeñas proteínas (protaminas) contiene el núcleo, con un numero haploide de cromosomas, cuyo DNA representa el material genético del macho que será depositado en el oocito y un acrosoma provisto de las enzimas hidrolíticas necesarias para poder penetrar por las envolturas que rodean al oocito, durante la fecundación. La cola incluye: región del cuello que está unida a la cabeza en la llamada fosa de implantación, la pieza intermedia provista de mitocondrias y rica en fosfolipidos, la pieza principal que contiene la vaina fibrosa y la pieza terminal.

(Illera, 1994; Hafez, 2000).

La membrana espermática es una estructura dinámica que participa en el reconocimiento y transporte de moléculas. Estas funciones, permiten que el

15 espermatozoide adapte su metabolismo al medio circundante, proporcionando así un sistema molecular para el reconocimiento del oocito (Hammerstedt et al., 1990), y esta compuesto aproximadamente de un 55 % de proteínas, 25% de fosfolípidos, 13 % de colesterol, 4% de otros lípidos y 3 % de hidratos de carbono (Guyton, 2006). Hay que tener en cuenta que el tamaño de partícula, la polaridad y la carga iónica determinan el paso a través de las membranas y de esa forma, pequeñas moléculas como las de agua (PM: 18), etanol (PM: 46), glicerol (PM: 92) y oxígeno pasan a través de la membrana mientras que la glucosa (PM: 180) no lo hace directamente. Cuanto menos polar es una molécula más rápido puede pasar la membrana (Lozano et al., 2006). Los lípidos (colesterol y ácidos grasos) como componentes más abundantes de la membrana plasmática, determinan la fluidez y resistencia de la membrana durante los procesos de criopreservación. El empaquetamiento y la posición de estas moléculas en las bicapas determinarán la rigidez de las membranas y por tanto el transporte de moléculas. Este transporte a través de las membranas es el punto crítico para la supervivencia celular post descongelación (Mathews, 2003).

2.2 Características macroscópicas y microscópicas del semen

Una vez realizada la colección, se evalúa el semen para poder determinar su calidad.

2.2.1 Características macroscópicas a) Volumen del eyaculado

Baracaldo et al., (2007), menciona que el volumen promedio de eyaculado de un toro adulto es de 4,5 ml con variación de 0,5ml a 15 ml, y este varía según su edad. Mientras que (Cabrera y Mellisho, 2001) utilizando toros de la raza Holstein, Brown Swiss y Simmental, de 2,5 a 6

16 años de edad, de un total de 142 colecciones los cuales incluían tres saltos, obtuvieron material seminal con volúmenes promedios de 12,94, 12,1, 14,8 ml respectivamente, con frecuencia de una colección por semana, pero Rado (2006), en su tesis realizada en el Banco Nacional de Semen en toros evaluados en dos épocas del año, obtuvo volúmenes de semen para Holstein 5,311 ± 0,228 ml, Brown Swiss 7,213 ± 0,231 ml, Simmental 3,904 ± 0,327 ml y en promedio para distintas épocas obtuvo 4,960 ± 0,217 ml en la primera época y 5,698 ± 0,227 ml en la segunda época encontrando diferencia estadística significativa entre razas y eyaculados de las dos épocas del año.

b) Color

Arauco (1995), menciona que el material seminal es blanco lechoso, ligeramente amarillo o grisáceo, debido al tipo de alimentación en cuyo caso es considerado normal. (Hafez, 2000) menciona que el color amarillo es debido a la presencia inocua de de riboflavina, así mismo Alvarado et al., (2005), mencionan que el material seminal de toros de la raza Holstein es por lo general blanco cremoso, el cual depende de la alimentación del animal.

c) pH

Arauco (1995), menciona que se su determinación se hace utilizando soluciones de papel reactivo que se basa en el cambio de color, también se usa fenolftaleína y potenciómetros como el de Beckman; el pH seminal es de 6,5 a 7,0. Cabrera y Mellisho (2001), obtuvieron resultados de 7,03 en promedio en toros Holstein, mientras que Necmettin (2001) trabajando con dos toros de la raza Holstein en

17 Alemania, de un total de 20 eyaculados, obtuvo mediante la ayuda de vagina artificial un pH promedio de 6,72 ± 0,05.

d) Concentración espermática

Hidalgo et al. (2007), menciona que existe una variabilidad muy grande en la concentración de un eyaculado a otro, y de un toro a otro, y existe métodos para evaluar concentración como la espectrofotometría, la colorimetría, la citometría de flujo y el uso de cámara de recuento celular, como las de Bürker, Neubauer o Thoma. Así mismo (Hafez, 2000) menciona que la concentración espermática es de 2 x 10⁸ espermatozoides/ml en toros jóvenes y 1,8 x 10⁹ espermatozoides /ml en los maduros; en cambio Cabrera y Mellisho ( 2001) utilizando toros de la raza Holstein, Brown Swiss y Simmental, de 2,5 a 6 años de edad, de un total de 142 colecciones los cuales incluían tres saltos, con frecuencia de una colección por semana obtuvieron de 850 – 1 100 x 10⁶ millones de espermatozoides/ml, mientras que Necmettin (2001) trabajando con dos toros de la raza Holstein en Alemania, de un total de 20 eyaculados, obtuvo mediante la ayuda de vagina artificial una concentración espermática promedio de 1 083 x 10⁶ espermatozoides por ml y Rado (2006), en su tesis realizada en el Banco Nacional de Semen en toros evaluados en dos épocas del año, obtuvo concentración promedio de 1 168,640 ± 20,629 millones de espermatozoides para la primera época y de 1 078,640 ± 21,593 millones de espermatozoides/ml para la segunda época (verano y invierno).

Así mismo también Decuadro (2001a), afirma que la concentración por dosis esta normalmente de 15 a 25 x 10⁶ espermatozoides. Pero Tecnologías IMV de Francia, han desarrollado un nuevo dilutor Bioxcell

18 para reducir la concentración de esperma por dosis, hasta 5-6 x 10⁶ espermatozoides por dosis.

2.2.2 Características microscópicas a) Motilidad

Es el movimiento que tienen los espermatozoides e indica el grado de energía y vigor de éstos, se determina con microscopio a 100 aumentos el cual es una de las pruebas más utilizadas en la valoración de la calidad del semen de forma subjetiva. Para estimar la motilidad masal se estima por el vigor del movimiento de las ondas en una escala del 0 al 5, mientras que la motilidad individual se estima visualizando el movimiento progresivo de cada uno de los espermatozoides, considerándose un 60%

como recomendable para lograr buenas tasas de fertilidad, siendo esta observación subjetiva (Hafez, 2000).

Necmettin (2001) trabajando con dos toros de la raza Holstein en Alemania, de un total de 20 eyaculados, obtuvo 75,25 ± 1,33 % de motilidad progresiva individual post colección mediante la ayuda de vagina artificial.

Pesch et al., (2007), mencionan que recientes investigaciones recomiendan para inseminación en vacunos, un mínimo de 50% de espermatozoides que deben mostrar motilidad individual progresiva después de congelar y descongelar, con un mínimo en la dosis de 16 x 10⁶ espermatozoides.

19 b) Anormalidades espermáticas

El examen morfológico del semen es una prueba de control de calidad.

Cada eyaculado contiene una serie de espermatozoides anormales, pero si la proporción de estos es muy alta entonces nos encontraremos ante un semen de muy baja fertilidad. Para el examen rutinario de la morfología de los espermatozoides se puede utilizar la tinción de eosina- nigrosina (Sepúlveda, 1999).

Hafez (2000), afirma que si la proporción de anormales es más de 20%, entonces nos encontramos ante un semen de baja fertilidad. Entre las anormalidades más frecuentes que se encuentran en un eyaculado tenemos: espermatozoides sin cola, cabeza grande, cabeza pequeña, cola reducida, cabeza adelgazada, rotura de cuello y acrosoma anormal.

Necmettin (2001) trabajando con dos toros de la raza Holstein en Alemania, de un total de 20 eyaculados, obtuvo 20,68 ± 1,67 % de anormalidades, mediante la ayuda de vagina artificial. Rado (2006), en su tesis realizada en el banco nacional de semen en toros evaluados en dos épocas del año, obtuvo porcentajes de espermatozoides anormales para Holstein, Brown Swiss, y Simmental de 7,750 ± 1,299%, 19,00 ± 1,319%, 15,550 ± 1,865% respectivamente, con promedios por época de 19,075 ± 1,238% para la primera época y 8,075 ± 1,295% en la segunda época.

c) Porcentajes de espermatozoides vivos y muertos

Este se puede estimar por tinción supra vital con una mezcla de colorantes, como eosina- nigrosina. Las células que están vivas cuando se aplica la tinción excluyen el colorante, mientras que las que estaban

20 muertas se tiñen de rojo con la eosina según se aprecia contra el fondo oscuro de nigrosina (Hafez, 2000; Alvarado et al., 2005).

Necmettin (2001) trabajando con dos toros de la raza Holstein en Alemania, de un total de 20 eyaculados, obtuvo 18,95 ± 1,01 % de espermatozoides muertos, mediante la ayuda de vagina artificial, es decir 81,05 % de espermatozoides vivos.

2.3 Prueba de funcionalidad espermática

La funcionalidad e integridad de la membrana espermática, son vitales para la viabilidad del espermatozoide (Lechniak et al., 2002), para el metabolismo del espermatozoide, además para una adecuada capacitación y reacción del acrosoma y por lo tanto, para la fertilidad del macho Yanagimachi (1993) citado por Sánchez et al., (2002). La integridad de membrana es el requerimiento mínimo para que el espermatozoide sea móvil (De Leeuw et al., 1991). El test de endosmosis tiene la ventaja de no solo indicar si la membrana está intacta, sino también de indicar si es osmóticamente activa y podría usarse para predecir la capacidad fertilizante de semen post descongelado, dado que el daño de la membrana es un factor más importante (Colembrander, 2003). Esta prueba fue aplicada en el semen de toro por (Correa y Zavos en 1994); (Correa et al., 1997).

Además Tamuli y Watson (1992), mencionan que en condiciones fisiológicas la fecundación no ocurre si la membrana plasmática del espermatozoide es bioquímicamente inactiva, aun cuando permanezca estructuralmente intacta, por lo tanto la prueba hipo-osmótica es un indicador preciso, porque

21 permite distinguir el adecuado funcionamiento de la membrana espermática, a diferencia de las tinciones vitales, que solo nos ayuda a ver la integridad morfológica de la membrana (Brito et al., 2003).

La prueba de permeabilidad de membrana vía endósmosis o hipo-osmotic- swelling test (HOST test), está basada en las propiedades físicas y bioquímicas de la membrana plasmática. Consiste en someter a los espermatozoides a un medio de presión hipo-osmótica (más baja que la fisiológica), lo que causa una entrada de agua en la célula en un intento de equilibrar la presión osmótica interna con la del medio externo (Pérez et al., 1999).

Endósmosis positiva es cuando por microscopia de contraste de fases (40X) se aprecia, como el flagelo del espermatozoide en un medio hipo osmótico (100 mOsm/ml) se torciona helicoidalmente en curva por la entrada de agua, que provoca un hinchamiento y enrollamiento del flagelo(Vázquez et al., 1997, Pérez et al. 1999, Ducci, 2002), mientras que los espermatozoides no viables, mantienen sus colas rectas debido a un desequilibrio osmótico entre el medio extracelular y el intracelular (Vázquez et al., 1997).

Bedoya et al. (2003), en evaluaciones sobre integridad funcional de la membrana plasmática de espermatozoides bovinos mediante el test-hipo osmótico, en Colombia, pudo evidenciar que hay una asociación positiva entre los espermatozoides con integridad funcional de la membrana plasmática y porcentajes de espermatozoides vivos y morfológicamente normales así mismo encontró correlaciones negativas entre porcentajes de espermatozoides que no reaccionaron a la prueba de Host y porcentajes de anormalidades. Omega et al. (2005), en su trabajo de investigación con 7

22 toros Holstein, encuentra en semen fresco un 67,6 ± 0,6 % con reacción positiva a la prueba de Host.

Catena et al. (1999), recomiendan como mínimo un 40% de espermatozoides reaccionantes al test de Host. Para tal efecto, se contarán un mínimo de de 200 espermatozoides por lámina, expresando los resultados en porcentaje de espermatozoides con reacción positiva a la prueba de Host (Santiani et al., 2002).

2.4 Características de los espermatozoides en semen refrigerado

Los principales daños celulares inducidos por la refrigeración incluyen alteraciones morfológicas como ruptura de la membrana plasmática (principal estructura afectada durante la refrigeración), degeneración acrosomal y lesiones en las mitocondrias (De Leeuw et al., 1990).

En el toro, la dilución y refrigeración a 5ºC provocan edema del acrosoma en el 50% de los espermatozoides (Jones et al., 1979). La actividad respiratoria del espermatozoide disminuye, así como la glucolisis, lo que provoca una reducción en los niveles de ATP y por ello, la pérdida de la motilidad. Por otra parte, el ADN sufre degeneración. Las alteraciones bioquímicas del espermatoz oide están causadas sobre todo por la pérdida de la selectividad de la membrana y por la pérdida de enzimas y de fosfolípidos (De Leeuw et al,. 1990).

Existe variación en distintas especies en la reacción al shock del frio, pero todavía no existe prueba funcional (Althouse et al., 2005). Inevitablemente la crio preservación de semen resulta en una reducción de la calidad seminal principalmente debido a la exposición al shock del frio ocurriendo cuando la

23 temperatura es disminuida de 15ºc a 4ºc, así como también como daños al congelamiento (Pegg, 2002). Entre otros efectos, este resulta en la pérdida de la motilidad e integridad de membrana (Busch et al., 1982). Funcionalmente, el tiempo necesario para la capacitación espermática en el tracto genital femenino es reducido (Watson, 1995).

Durante la refrigeración, los distintos lípidos que forman parte de la composición de la membrana espermática, van a tener diferentes temperaturas de fase de transición. Algunos lípidos pasan al estado gel y otros permanecen en estado líquido en un ambiente lipídico no fisiológico lo que origina un cambio en su funcionalidad que conlleva a una alteración de la integridad estructural o en el metabolismo iónico (Woelders, 1997).

La disminución de temperatura desde 25ºC a 10ºC reduce en un 60% la actividad de las bombas dependientes de ATP y la difusión facilitada o cotransporte (transporte concomitante de dos moléculas a través de la membrana dependiente una de ellas de ATP y/o iones H+); en consecuencia, los procesos de difusión y ósmosis son los que predominan en los momentos de estrés osmótico (Mendoza et al., 2000).

2.5 Características de los espermatozoides en semen congelado - descongelado

Las membranas celulares son las estructuras que sufren mayor daño en los procesos de congelación, en general, debido a la pérdida de fluidez de sus componentes lipídicos (Seidel, 2006). Así mismo, el contenido elevado en ácidos grasos insaturados de los fosfolípidos hace al espermatozoide más susceptible a

24 las lesiones de peroxidación, que además de afectar a la motilidad, también afectan al metabolismo, la ultra-estructura y la fertilidad (White, 1993).

La transición de lípidos fluidos a sólidos se da a una temperatura de 10°C a -16°C alterando de esta manera las funciones de la membrana y dándole un alto grado de fragilidad, durante la deshidratación celular, en el proceso de congelación puede haber pérdida de lípidos, lo cual afectaría la integridad de la membrana plasmática por pérdida de su capacidad de expansión durante la rehidratación al volver a condiciones isotónicas (Seidel, 2006).

La bajas temperaturas (asociadas al aumento de la rigidez de la membrana) y la rapidez (décimas de segundo) con la que suceden los cambios osmóticos en los procesos de congelación y descongelación hacen muy difícil el movimiento de moléculas a través de la membrana mediante procesos de transporte activo (dependientes de ATP) (Mendoza et al., 2000). Sin embargo, en la especie bovina, se ha sugerido que puede producirse ruptura de la membrana plasmática que cubre el acrosoma y de la membrana acrosomal externa, con dispersión del contenido acrosomal en una elevada proporción de espermatozoides (Jones et al., 1979).

El congelamiento posee varios obstáculos que necesitan ser superados: la formación intracelular de cristales de hielo, que llevan a la destrucción del citoesqueleto; la formación extracelular de hielo, resultando en el incremento de solutos y de ahí una osmolaridad incrementada, llevándolo a la pérdida de agua celular (exósmosis). El período de adaptación a 5 ºC debe ser mantenido en corto periodo de tiempo posible y la temperatura hasta -196 ºC debe ser alcanzado paso a paso con un cambio de temperatura rápido (Tyler et al., 1996).

25 El proceso de descongelado también afecta la calidad seminal y un adecuado protocolo tiene que ser seguido. El descongelado a 70 ºC por 5 segundos ha mostrado ser superior al descongelado a 37 ºC por 20 segundos (Pegg, 2002), sin embargo por razones prácticas el último procedimiento es comúnmente aplicado.

Entonces en el congelado y descongelado de pajilla se pierde alrededor de 20%

de motilidad, a pesar de considerables progresos en los últimos años; la crio preservación todavía impone una gran estrés sobre los espermatozoides. Los factores responsables del daño espermático, son por oxidación de la membrana lipídica del esperma y daños de permeabilidad selectiva en los mecanismos de la membrana. (Silva et al., 2006).

El porcentaje de espermatozoides en muestras de semen congelado y descongelado se expone a una disminución de la capacidad fertilizante; este incremento es firmemente debido a la disminución del espacio de vida en el tracto genital y a una disminución en la capacidad para interactuar con el epitelio oviductual (Pesch et al., 2007).

El tiempo de descongelamiento debe controlarse con cuidado para evitar matar las células por sobrecalentamiento, se coloca las pajillas a descongelar en agua a 37 ºC por 45 segundos, se descongela solo las pajillas que van a usar en los próximos 10 a 15 minutos. No permita que se vuelva a congelar y trate de mantener la temperatura a 35 ºC mientras prepara la pistola (Dejarnette, 2007).

El glicerol es añadido para la crio preservación, su concentración final en el semen diluido está en el rango de 4 % a 6 % siendo importante en el momento de congelamiento hasta -30 ºC. Un reciente estudio ha confirmado que altas concentraciones de glicerol son de importancia para mejorar la calidad seminal (England, 1993).

26

2.6 Dilutores para semen bovino

Los dilutores deben prepararse en forma aséptica y almacenarse por menos de una semana, a menos que se congelen. Suelen agregarse carbohidratos simples, como glucosa que es fuente de energía y otros nutrimentos usados por los espermatozoides. Se utilizan yema de huevo, leche para proteger a las células espermáticas contra el choque térmico cuando son enfriados desde la temperatura corporal hasta 5ºC. Se utiliza diversos amortiguadores para mantener el pH cercano del neutro y una presión osmótica de aproximada de 300 mOsm, equivalente a la de semen, y para evitar la proliferación de microorganismos, se agregan antibióticos como penicilina, estreptomicina y otras combinaciones de antibióticos (Hafez, 2000).

Salamon y Maxwell (1995) manifiestan que el ácido cítrico en los diluyentes, neutraliza los productos de desecho del metabolismo de los espermatozoides, en especial del ácido láctico, es decir, desempeña una acción buffer efectiva neutralizando la acidez del medio causado por los catabolitos; adicionalmente, Holy (1983) destaca la importancia del ácido cítrico por su acción en la fijación del calcio, que junto con los iones de sodio y potasio mantienen el equilibrio osmótico, favoreciendo la motilidad de los espermatozoides por participar en la activación de la fosfatasa ácida presente en el plasma seminal. Borque y Sagües (1992) refieren que, la fructosa es necesaria para la supervivencia de los espermatozoides en condiciones anaeróbicas y está estrechamente relacionada con la motilidad inicial de los espermatozoides.

27 La adición de yema de huevo al dilutor tiene un efecto benéfico sobre el porcentaje de motilidad, particularmente luego de un rápido enfriamiento del semen a 10 y 5 ºC, ya que las lipoproteínas de baja densidad, actúan como crio protectores contribuyendo con dos factores: uno de los cuales protege contra el shock de frío (factor de resistencia) y un segundo que mantiene la viabilidad (factor de conservación) (Fiser y Fairfull, 1986).

Bioquímicamente es posible distinguir tres tipos de crioprotectores, los alcoholes (metanol, etanol, propanol, 1-2 propanodiol y glicerol), azúcares (glucosa, lactosa, sucrosa, sacarosa) y el dimetil sulfóxido; los crioprotectores pueden clasificarse también en agentes penetrantes y no penetrantes de acuerdo a la permeabilidad celular (García, 1984; Porcu, 2001).

La adición del criopreservante genera estrés osmótico sobre las células porque aumenta la osmolaridad del medio. Las células inicialmente se deshidratan para compensar la fuerza osmótica inducida por la presencia de los agentes crioprotectores y después se hidrata (Lozano et al., 2006).

Dilutores libres de elementos de origen animal, se han desarrollado y están remplazando a la yema de huevo (Aires et al., 2003). La presencia de lecitina de soya como reemplazo de los componentes de origen animal ejerce un rol protector de las membranas del esperma de toros durante los diferentes pasos de los procedimientos de congelamiento y descongelamiento, para mantener la fertilidad y sobrevivencia embrionaria temprana a niveles comparables a los obtenidos con diluyentes para semen de toros a base de yema de huevo o base de leche (Decuadro, 2001b).

28 Como ni el semen ni la yema de huevo son libres de contaminación bacteriana; los dilutores contienen antibióticos (penicilina procainica, ampicilina, sulfato de gentamicina, lincomycin hidrocloridratado) para prevenir más crecimiento bacteriano (Althouse et al., 2005).

2.6.2 Dilutores más usados para preservación de espermatozoides a) Dilutor Tris – Yema de huevo

Se usa Tris (Hidroximetil amino metano) 3,605 gr, acido cítrico 2,025 gr, fructuosa 1,488 gr, todo esto se disuelve en agua bidestilada, en una probeta graduada a 100 ml, se toma el 80% de la solución y se le agrega 20% de yema de huevo que sería el dilutor A, preparado para semen refrigerado; para congelación se prepara el mismo dilutor anterior pero añadiendo el glicerol que sería el dilutor B. Así mismo al dilutor A se le agregan los antibióticos de 500 a 1000 microgramos/ml dilutor y ya se puede hacer la dilución con el dilutor A tratando que el semen baje lentamente por las paredes de la probeta, luego el dilutor B se divide en tres partes y se mezcla la primera parte con el semen diluido con el dilutor A y luego el resto con intervalos de 15 minutos (Alvarado et al., 2005).

b) Dilutor citrato - yema de huevo

Preparado a base de 2,9g de citrato de sodio en 100 ml de agua bidestilada, se toma 80% de la solución preparada y 20% de yema de huevo. La preparación es para semen fresco y refrigerado (Alvarado et al., 2005).

29 c) Dilutor leche - yema de huevo

Se puede utilizar leche entera, descremada u homogenizada. Para su uso se calienta a 92ºC, durante 10 minutos en baño maría, luego se filtra para separa la nata y la espuma y cuando alcance una temperatura de 32 - 34 ºC ya puede ser usado (Alvarado et al., 2005).

d) Dilutor AndroMed®

Elaborado en Alemania, diluyente para semen de toros y también utilizado exitosamente con semen de especies no bovinas, especialmente caprina. Posee las siguientes características: es apropiado para la preservación de semen fresco a +5ºC hasta +10ºC, tiene ausencia de componentes de origen animal (tales como yema de huevo), previenen efectos indeseados de hormonas, bacterias y residuos de drogas. La preparación es simple: se requiere añadir sólo 800 ml de agua destilada al contenido de 200 ml de un frasco de AndroMed®. También tiene un medio altamente transparente que entrega imágenes de semen extremadamente claras bajo el microscopio. La eficiencia es alta dentro de las concentraciones estándar de dosis: la tasa de dilución de los eyaculados puede variarse en gran medida, manteniendo resultados sobresalientes. AndroMed® está siendo utilizado con eyaculados de baja concentración y a altas tasas de dilución (bajo 10 millones de células por pajuela). Contiene fosfolípidos, TRIS, ácido cítrico, azúcares, antioxidantes, tampones, glicerina, agua de altísima pureza y antibióticos, de acuerdo a la Directiva de CE 88/407 (Tilosina, Gentamicina, Espectinomicina, Lincomicina) (Simmet, 2006a).

e) Dilutor Bioxcell

Elaborado en Francia, permite la congelación de pajillas de semen a concentraciones menores a las normales (7x10⁶ espermatozoides/dosis)

30 manteniendo los niveles de fertilidad adecuados. Composición: Contiene también anti – oxidantes, fosfolipidos y antibióticos como lincomicina, espectinomicina, gentamicina y tilosina, de conformidad con los estándares de calidad especificados en la directiva europea. No incluye productos de origen animal, por tanto es libre de posibilidad de contaminación bacterial y micoplasma, otorgándosele la certificación ISO 9002 a la alta calidad (Decuadro, 2001b).

f) Dilutor Triladyl

Su presentación en frascos de 250 gr, que para la preparación del diluyente se agregan 750 ml de agua destilada y 250 gr de yema de huevo fresca. La tasa de dilución para los eyaculados permite un amplio rango de variación, sin comprometer los resultados de fertilidad; es un buffer que contiene TRIS, Ácido cítrico, azúcar, Glicerina, agua purísima y antibióticos, de acuerdo a la Directiva 88/407 de la UE (Tilosina, Gentamicina, Espectinomicina, Lincomicina), además de yema de huevo.

Sin embargo, se dispone de un Cocktail de antibióticos en polvo (Art. Nº 13500/0005), adecuado para el procesamiento de semen en dilución de 1 paso, de acuerdo a la norma CSS. Simmet (2006) b.

2.7 Uso de dilutores en semen bovino y respuestas en las características seminales

Rado (2006), en su investigación realizada en el Banco Nacional de Semen en toros evaluados en dos épocas del año utilizando el dilutor Bioxcell, en semen refrigerado obtuvo porcentajes de espermatozoides vivos para Holstein, Brown Swiss, y Simmental de 73,29 ± 2,39 %; 64,48 ± 1,64 % y 68,085 ± 2,33 %

respectivamente y con promedios en la primera época (verano) de

31 68,604 ± 1,564% y segunda época (invierno) de 72,154 ± 1,619%; encontrando diferencia estadística significativa entre razas y eyaculados de las dos épocas del año a un (P<0,05), también evaluó integridad de membrana plasmática en semen fresco, refrigerado y congelado con resultados de 48,53 ± 1,42 %; 57,76 ± 1,42 % y 36,43 ± 1,42 % así mismo al refrigerado por razas obtiene 51,342 ± 2,077 % para Holstein, 40,392 ± 1,429% para Brown Swiss y 42,738 ± 1,997% para Simmental. Así mismo también encontró un grado de correlación entre motilidad y endósmosis para semen fresco de 0,53, refrigerado 0,137 y congelado 0,416 a los 60 minutos de incubación.

Stradaioli et al. (2007), en su trabajo de investigación en Italia usando 4 toros Simmental utilizando Bioxcell y Tris-yema de huevo, obtuvo con microscopio de contraste de fase, en pajillas de 0,25 ml en semen fresco, 79,8% de motilidad, en refrigerado 74,7% (Bioxcell) y 72,5% (Tris) y en semen congelado 44,3% con Bioxcell y 41,8% con Tris-yema y para vitalidad en fresco 77,6 %, en refrigerado 74,8 % (Bioxcell) y 72,9 % (Tris) así como en congelado 46,4% (Bioxcell) y 43,4%

(Tris) siendo el dilutor Bioxcell superior al Tris-yema. Así mismo determina la concentración de glutatión (antioxidante no enzimático) en ambos dilutores para encontrar una diferencia más entre dilutores siendo para Bioxcell 450 µM y solo 40 µM en Tris yema de huevo y se puede ver que hay una gran diferencia entre dilutores.

Omega et al. (2005) en su trabajo de investigación con 7 toros Holstein utilizando un dilutor en base a leche, encuentra en semen descongelado un 54,3 ± 2,5 % con reacción positiva a la prueba de Host. Así mismo Vera-Munoz et al. (2008), al evaluar el efecto del semen diluido en baja concentración por dosis sobre la motilidad espermática y integridad de la membrana plasmática en el proceso de criopreservación utilizando tres dilutores comerciales (Triladyl®, Bioxcell®) y LDL

32 (baja densidad de lipoproteínas) dilutor preparado en laboratorio 97% puro; revela que el dilutor LDL fue más efectivo en la preservación de la motilidad e integridad de membrana espermática que el Bioxcell y el Triladyl; y no diferencia significativa fue observado entre Triladyl y Bioxcell.

Janett et al., (2005), al comparar la calidad de semen congelado de toros en Alemania, procesado con tres diferentes dilutores comerciales disponibles de 58 colecciones de eyaculado de 22 toros de diferentes razas divididos y diluidos con AndroMed® (Minitüb, Tiefenbach, Germany) Bioxcell® (IMV, Aigle, France) and Triladyl® (Minitüb, Tiefenbach, Germany), con una concentración final de 90 millones de espermatozoides/ml y que después del congelamiento y equilibración a 5ºC, el semen diluido fue empacado en pajillas de 0,5 ml y congelados en un congelador automático (Microdigitcool,IMV, Aigle, France), al evaluar la calidad del semen en el congelamiento y descongelamiento a través de la motilidad y viabilidad espermática, demostró que la motilidad total al descongelado de semen procesado en AndroMed® fue de 67,7 ± 1,9% y mostró significancia (P < 0,05) comparado con Bioxcell® que fue de 60,9 ± 1,9% y Triladyl® 52,4 ± 1,9. Para la viabilidad espermática, sin embargo, mejores resultados significativos fueron obtenidos usando Triladyl® (78,5 ± 1,3%) que AndroMed® (72,6 ± 1,6%) o Bioxcell® (70,8 ± 1,6). Pero de la evaluación el autor concluye que de los tres dilutores, AndroMed® parece ser el más adecuado para congelar semen de toros.

Braga et al., (2006), en su trabajo de investigación en Brasil, compara tres dilutores diferentes para congelar semen de toros, el semen fue empaquetado en pajillas de 0,25 ml a una concentración de 3 millones de espermatozoides sexados por citometria de flujo y congelados en congelador automático (Digit cool 5300® IMV). Para evaluar la calidad al congelado, las pajillas fueron descongeladas e incubadas a 35ºC por 15 min. La motilidad progresiva fue

33 observada a través de un microscopio óptico Coleman 200T. Los resultados muestran que no hubo diferencia estadística entre el dilutor Bioxcell y AndroMed (P ≤ 0,05). Sin embargo, el dilutor Botu-Bov mostro diferencia significativa cuando fue comparado con el Bioxcell y AndroMed. A pesar de que pocos eyaculados fueron usados para este estudio, resultados preliminares mostraron que Bioxcell parece ser el más adecuado para congelar semen sexado de toros.

Amirat et al. (2004), en su trabajo de investigación en Francia con 11 toros utilizando los dilutores LDL (lipoproteínas de baja densidad) y Optidyl (dilutor comercial que contiene yema de huevo) obtuvo 47,3% y 46,4% de espermatozoides reaccionantes al test de Host al congelado.

Catena et al., (1999), recomiendan como mínimo un 40% de espermatozoides reaccionantes al test de Host y (Santiani et al., 2002), recomienda contar un mínimo de de 200 espermatozoides por lámina, expresando los resultados en porcentaje de espermatozoides con reacción positiva a la prueba de Host.

34

III. MATERIALES Y METODOS

3.1 Lugar de ejecución y duración

El presente trabajo de investigación que tuvo como actividades la colección, procesamiento y congelación de semen, se realizaron en las instalaciones y laboratorio del Banco Nacional de Semen de la Universidad Nacional Agraria la Molina, a una altitud aproximada de 241 m.s.n.m, ubicado en el distrito de La Molina, Provincia y Departamento de Lima, y duró aproximadamente 7 meses, entre los meses de Enero a Julio del 2009.

3.2 De los animales del experimento

Se colectó semen de toros jóvenes de la raza Holstein y Brown Swiss, de 3 a 4 años de edad, lo cual están sujetos a un régimen de colección de dos veces por semana por parte del Banco Nacional de Semen con los siguientes toros.

 Toro 1. Camay Blitz Kyle Bingo, con registro genealógico Nº 14 944 de raza Holstein, con 3 años de edad al experimento.

35

 Toro2. Molinero Sosa Garter Miguel, con registro genealógico Nº 14 740 de raza Holstein, con 4 años de edad al experimento.

 Toro 3. L4J Dallas Collection Cash, con registro genealógico Nº 11 453 de raza Brown Swiss, con 3 años de edad al experimento.

 Toro 4.NBV Dominate Callicpasapa Rocket, con registro genealógico Nº 11 351 de raza Brown Swiss, con 4 años de edad al experimento.

 Toro 5. Huampani Molinero Dominate Emory Pepe, con registro genealógico Nº 11 280 de raza Brown Swiss, con 4 años de edad al experimento.

3.3 Alimentación de los animales

La alimentación de los reproductores estuvo basada en forraje verde picado de maíz chala (Zea mays) y suplementado con concentrado. El reparto del alimento fue 2 veces por día, salvo el concentrado que se le suministró una vez por día y por las mañanas; los insumos y la proporción utilizada en la elaboración del balanceado se presentan en el Anexo N° 1, y el aporte nutricional aproximado fue:

- Proteínas 13 %

- Fibra 15 %

- NDT 68,5 %

Que corresponde a rumiantes en actividad reproductiva constante. La disponibilidad de agua fresca fue ad-libitum.

3.4 Instalaciones

Todos los toros permanecieron todo el tiempo en toriles semi techados con parte piso de cemento y el resto de tierra, el cual se aprecia en el Anexo N° 30.

36 La evaluación del eyaculado y dilución del mismo, se realizó en el laboratorio del Banco Nacional de Semen (Anexo N°31), que conto con los equipos y materiales necesarios para la realización de la investigación.

3.5 Variables en estudio

3.5.1 Variables independientes:

- Eyaculado de los toros.

3.5.2 Variables dependientes:

- Volumen del eyaculado - Color del semen - pH del eyaculado - Motilidad masal

- Concentración espermática - Motilidad individual progresiva - Espermatozoides vivos - Integridad de membrana (Host)

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3.6 Métodos de evaluación

En el grafico N°1 se muestra el flujograma de las actividades de trabajo.

Grafico N°1: Flujograma de metodología

Color

Ev. Macroscópica Volumen pH

Motilidad masal

Ev. Microscópica Concentración espermática Vitalidad espermatica

Prueba de Host

Dilutor AdroMed

Dilutor Bioxcell

Pajillas de 0.5 ml

Motilidad Individual

Ev. Microscópica Vitalidad espermática Post Refr. Prueba de Host

Motilidad Individual

Ev. Microscópica Vitalidad espermática Post Cong. Prueba de Host

Preparación de los reproductores para la colección de semen

Preparación de la vagina artificial Preparación del dilutor

Colección de semen

Evaluación del semen fresco

Dilución del Semen

Refrigeración del semen diluido a 5°c

Congelación de semen a -196°c

Almacenamiento de pajillas en tanques criogénicos Empajillado del semen

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3.6.1 Colección del semen

Para la colección de semen, se contó con un brete de monta el cual se ve en la Anexo N° 32. Antes de la colección se limpió el prepucio del toro con agua destilada o suero fisiológico, y se secó con papel toalla para evitar la contaminación del semen. Para colectar el semen de los donadores se usó la vagina artificial los mismos que brinda condiciones homogéneas de presión, confort y temperatura ( Agua temperada a 40 - 45ºC) al toro durante la colección.

Se tuvo especial cuidado en la limpieza y rotulado de los tubos, todas las colecciones fueron realizados por un mismo técnico especialista a primeras horas de la mañana (8-9 am). La frecuencia de colección estuvo establecida en 2 veces por semana.

3.6.2 Evaluación del semen

El semen inmediatamente obtenido fue conducido al Laboratorio en el cual se evaluaron los siguientes parámetros:

3.6.2.1 Evaluaciones macroscópicas a) Color

Mediante la observación visual, el cual dependió de la cantidad de espermatozoides; cuando el semen era de buena calidad a excelente, presento coloración blanco cremosa y cuando fue de baja calidad de color blanco lechoso.

b) pH

Se determinó mediante el uso de papel de tornasol.

39 c) Volumen

Se midió directamente en los tubos de colección graduados.

3.6.2.2 Evaluaciones microscópicas

a) Motilidad espermática

La evaluación de la motilidad fue subjetiva y expresada en porcentajes, por observación en el microscopio óptico a un aumento de 20x y 40x, colocándose 10 uL de semen sobre la lámina porta objetos previamente calentada a 37ºC. Para el experimento solo se considero alícuotas espermáticas de semen fresco con buena motilidad masal.

b) Concentración espermática

El número de espermatozoides se determinó mediante el método de hemocitómetro de Neubauer.

Se utilizo el hemocitómetro para conteo de Globulos Rojos y se absorbió semen puro hasta la marca de 0,5. Luego se enrasó con agua bidestilada hasta los 101 que marca en el hemocitómetro y se logro una mezcla homogénea.

Así mismo se eliminó las primeras 5 gotas, el restante fue colocado uno en cada extremo de la cámara de Neubauer (dentro del cubreobjeto de la cámara). Para luego de unos minutos hacer el conteo espermático en la cámara de Neubauer que contiene la muestra.

40 Una vez finalizado el conteo de los cinco cuadrantes pequeños escogidos al azar, se realizó el mismo procedimiento en el cuadrante inferior de la cámara de Neubauer y de esta forma se sacó el promedio de espermatozoides contados en ambos cuadrantes.

A la cantidad de células contadas en promedio, se le multiplicó por 10x10⁶/ml), ya que la concentración esta expresada en millones de espermatozoides por mililitro. Al resultado obtenido se le multiplico por el factor 10, esto por el espesor de la cámara de Neubauer.

c) Vivos y muertos

La proporción de espermatozoides vivos y muertos se calculó por la técnica de coloración con Eosina al 5% y Nigrosina al 10%, en donde se emplearon 3 gotas de eosina – 2 gotas de nigrosina en 10 uL de semen aproximadamente y se homogenizó suavemente con los colorantes sobre una lamina porta objeto identificada y secada a temperatura del laboratorio.

El porcentaje de espermatozoides vivos se determinó aplicando la siguiente fórmula:

n x 100 X =

N Donde:

N = número total de espermatozóides contados.

n = número de espermatozoides vivos hallados.

41

3.6.3 Determinación de la integridad de membrana citoplasmática en los espermatozoides

Se utilizo el Tes de Host (hypoosmotic sperm swilleng test) en soluc ión hipo-osmótica de citrato de sodio, descrita por (Correa et al., 1994) en semen fresco, refrigerado y congelado que tiene los siguientes pasos:

a) Preparación de las soluciones

La solución hipo-osmótica estaba a una osmolaridad aproximada de 100 mOsmol/L, compuesto de 0,08 gr de citrato de sodio dihidratado, 0,025 gr de fructuosa y 10 ml de agua destilada. Como se indica en el cuadro Nº1.

La solución del medio de lavado estaba compuesta de 0,29 gr de citrato de sodio dihidratado, 10 ml de agua destilada; de la mezcla de ambos; se tomo una alícuota de 9,8 ml para ser mezclado con 0,2 ml de suero bovino (2%). Como se indica en el Cuadro Nº2.

Cuadro Nº1: Composición química de la solución hipo-osmótica a 100 mOsmol/l con citrato de sodio y fructuosa.

Agente Unidad Cantidad

Citrato de sodio dihidratado gr. 0,08

Fructuosa gr. 0,025

Agua destilada ml. 10,0

Osmolaridad aproximada mOsmol/L 100

42 Cuadro Nº2: Composición química del medio de lavado con citrato de

sodio al 2,9% con 2% (v/v) de suero bovino.

b) Protocolo del test de endósmosis espermática, según Correa et al., (1994).

i. Se descongeló pajillas de semen a 37ºC por un tiempo aproximado de 15 segundos.

ii. El semen descongelado se colocó en un tubo de ensayo para ser diluido en proporción de 1:1 con la solución de lavado.

iii. Esta dilución es llevó a la centrifuga por 5 minutos a 1 000 rpm, y después de este tiempo se quito el sobre-nadante con la ayuda de la pipeta Pasteur, quedando sólo el pellet o semen puro.

iv. Terminado el proceso anterior, se procedió en forma inmediata a reconstituir el volumen original del semen con la solución de lavado, todo esto en baño maría a 32,7°C.

v. Prueba hipo-osmótica: el semen ya reconstituido a su volumen original fue diluido con la solución hipo-osmótica a 100mOsmol/L, en una proporción de 1:10 (semen – sol. Hipo-osmótica).

Soluciones Unidad Cantidad Solución A: gr. 0,29

ml. 10,0

Solución B: ml. 9,8

ml. 0,2

43 vi. Como parte final se incubaron las muestras en baño maría a 32,7°C

por 60 minutos. Pasado el tiempo de incubación, se mezcló una gota de la muestra con una gota de glutaraldehido al 2% con el fin de detener la reacción (Gonzales, 1992).

vii. El conteo de las células que reaccionaron positivas al test de HOST se vió al microscopio a 100x aumentos. Se contó un promedio de 600 células en 10 campos diferentes, siendo la interpretación de la siguiente manera: los espermatozoides que presentaron enrollamiento de cola son considerados con reacción positiva al test y por tanto fueron células con membrana intacta y los que no presentaron enrollamiento de cola fueron considerados como espermatozoide con membrana destruida o dañada.

3.6.4 De los dilutores y procesamiento de semen

Las muestras de semen fueron diluidos con dos tipos de dilutores, Bioxcell de origen Francés y el AndroMed de origen alemán y se utilizó la misma metodología de preparación y dilución para ambos dilutores; luego se envasó en pajillas de 0,5ml Cassou IMV Technologies, Francia.

3.6.4.1 Preparación del dilutor

Ambos dilutores tuvieron el mismo procedimiento; se colocaron los frascos de dilutores concentrados en baño maría a 32 ºC por 10 minutos, así mismo también agua bidestilada apirógena en un Erlenmeyer, luego se puso el dilutor concentrado dentro del agua bidestilada apirógena en un proporción de 1:4, se homogenizó la solución y el dilutor quedo listo.

44 3.6.4.2 Protocolo de dilución

Obtenidos los resultados de la evaluación en semen puro, el número de pajillas a congelar fue determinado en función de la concentración espermática del eyaculado, siendo 25 x 10⁶ el número de espermatozoides por pajillas.

Luego se hizo una pre-dilución 1:1, entre el semen puro y el dilutor, a 32 ºC y se dejó por 10 minutos en el baño maría para que los espermatozoides se adapten al dilutor; después se hizo la ultima dilución agregando el semen pre- diluido en el dilutor. Se dejaron los frascos de semen diluido a la temperatura del ambiente del laboratorio 20 ºC durante 10 minutos. Pasado este tiempo se hizo una evaluación previa correspondiente y se empezó con el empajillado.

3.6.4.3 Envasado del semen en pajillas.

Se envasó o empajilló el semen diluido en pajillas de 0,5 ml, con nombre y registro de los toros, donde se utilizo una bomba de vacio la cual absorbe el semen diluido. Luego con ayuda de un peine especial se creó un espacio vacío y se sello la pajilla con alcohol polivinilico, el cual al contacto con el agua se convirtió en un tapón impermeable.

3.6.4.4 Equilibrio o ambientación de las pajillas

Todas las pajillas envasadas, se depositaron en una bandeja plástica con agua a temperatura de 20 a 23ºC, luego se colocaron en la refrigeradora para enfriar gradualmente hasta 4 a 5ºC, por un tiempo de 18 horas.

45 3.6.4.5 Congelamiento y descongelamiento

Para el congelamiento se utilizó una caja de tecnopor de 40 x 30 x 30 cm., que contenía nitrógeno líquido a una altura de 5 a 8 cm. Así mismo de una rejilla con área ligeramente menor que la caja, para colocar las pajillas previamente secadas con papel toalla.

Entonces los vapores de nitrógeno líquido descendieron la temperatura, pasando de 4 °C o 5 ºC a 0 ºC en un minuto y luego rápidamente se bajo a -20ºC por cada minuto hasta llegar a -140ºC en 7 minutos. Luego de llegar a -140 ºC, se sumergió rápidamente las pajillas en el nitrógeno líquido, concluyendo de este modo el proceso de congelamiento.

Para el descongelamiento se utilizó agua temperada a 37-38 ^oC.

Las pajillas que se utilizaron se descongelaron por un espacio de 15 segundos. Luego se seco completamente y se cortó el extremo de alcohol polivinilico y se realizaron las evaluaciones correspondientes.

3.7 Diseño estadístico

Todos los datos fueron introducidos previamente en una hoja de cálculo (Excel) que luego fueron procesados en el programa SAS (Statistical Análisis System), Versión 8, donde se aplicó un test de normalidad para los datos numéricos obtenidos durante la evaluación. En caso de los datos porcentuales, se procedió a su transformación mediante arco seno, según se describe más adelante.

46 Aproximados de ese modo, se procedió a un test de normalidad para datos transformados.

Para el análisis de las características del semen puro (volumen, motilidad masal, porcentajes de espermatozoides vivos y Host), y para evaluar el comportamiento de los toros en las características evaluadas al post-refrigerado y post-congelado en los dilutores, se utilizó el diseño Completamente al azar (DCA), cuyo modelo lineal es el siguiente:

Yij = µ + Ti + εij

Donde:

Yij = Es la variable respuesta para volumen, motilidad masal, vitalidad y integridad de membrana espermática del i-ésimo toro.

µ = Media general.

Ti = Efecto del i-ésimo toro.

εij = Error experimental.

Se realizó comparación de los promedios con la prueba de Duncan.

Para la determinar el efecto de los dilutores sobre la motilidad espermática, espermatozoides vivos e integridad de membrana (HOST), al post-refrigerado y post-congelado, se utilizo el diseño de bloques completamente al azar con sub muestreo, siendo los factores a evaluar dos diluyentes de semen (Bioxcell y AndroMed), en dos momentos de procesamiento de semen (Post refrigerado – Post congelado) considerando para ello como bloques cada uno de los toros (5).

El modelo estadístico utilizado es el siguiente:

Yijk = µ+ Di + Bj + eij + δijk